基于抗体修饰ZnSe纳米晶检测肝癌标志物GPC3的试剂盒的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及一种基于抗体修饰ZnSe纳米晶检测肝癌标志物GPC3的试剂盒，主要包括：表面交联修饰GPC3抗体的ZnSe纳米晶，锌离子荧光探针溶液，GPC3抗体和GPC3蛋白标准品。本发明将双抗夹心免疫分析法和ZnSe纳米晶的阳离子交换反应相结合，实现对免疫反应中GPC3检测信号的放大，用于检测肝癌标志物GPC3具有信号稳定、灵敏度高和检测限低等优点，可应用于肝癌患者的早期诊断。
【专利说明】基于抗体修饰ZnSe纳米晶检测肝癌标志物GPC3的试剂盒 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于抗体修饰ZnSe纳米晶检测肝癌标志物GPC3的试剂盒。 (二）
【背景技术】
[0002] 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一， 其发病率呈逐年上升的趋势。据统计，全球每年新增肝癌患者约60万，其致死率达到第3 位，仅仅稍次于肺癌和胃癌。我国每年新增的肝细胞癌发病人数约占全球55%;肝癌防治 的核心是早期发现、早期诊断和早期治疗。其中早期诊断最为关键，即在患者出现临床症 状前或在癌症发生浸润前得以确诊，从而得到及时治疗，达到提高治愈率、降低死亡率的 目的。磷脂酰肌醇蛋白多糖-3 (glypican-3,简称GPC3)在1996年被Pillia等人首先 发现，其相对分子量约66kDa，基本结构包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素链和糖基磷脂酰肌醇 (glycosy 1-phosphatidyl inositol,简称GPI)，并通过GPI锚定于细胞表面，在生长发育和 癌变过程中起关键作用。科学研究表明，GPC3在大多数HCC中有表达甚至高表达，而在正常 肝组织及良性肝脏病变中弱表达或不表达，对HCC的诊断具有较高的灵敏度和特异性，同 时GPC3的表达量与HCC的预后也有一定的关系。因此GPC3有望成为HCC早期诊断和预后 的新型分子标志物。目前可溶性GPC3作为HCC病人早期诊断的血清标志物的有效性已经 得到证明，因此血清中GPC3含量的高灵敏检测对肝癌的早期诊断及预后判断具有重要意 义；然而血清样本中GPC3浓度通常低至ppb，为了能够准确检测血清样本中GPC3的确切含 量，则对检测方法的灵敏度提出了更高的要求，目前仍然缺乏快速、简便、高灵敏度的GPC3 蛋白血清分析检测技术。
[0003] 免疫分析是利用抗原和抗体间的特异性反应进行生化样品检测的一种分析方法， 在临床诊断和生化分析等领域具有广泛的应用。其中酶联免疫吸附法（ELISA)具有操作简 便、易于标准化等特点，是应用最广的抗原检测方法。目前，血清GPC3含量的检测主要通过 ELISA进行，然而ELISA存在价格昂贵、稳定性差、灵敏度不够等诸多问题。
[0004] 近年来各类荧光纳米材料广泛的应用于生物医学检测中，尤其是将免疫反应的特 异性和荧光纳米材料的敏感性相结合，可以准确、特异、灵敏、快速的检测一些微量甚至超 微量物质，有望解决ELISA检测中灵敏度低和稳定性差等问题。量子点具有吸收波长范围 宽、发光寿命长和不易漂白等优点，被称为最有潜力的荧光标记物质，目前被广泛应用于各 类免疫分析的荧光标记研究中。
[0005] 本专利将结合免疫分析技术和新型ZnSe纳米晶，开发肝癌标志物（GPC3)的快速、 特异和高灵敏检测新方法。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种基于抗体修饰ZnSe纳米晶检测肝癌标志物GPC3的试剂 盒。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] -种基于抗体修饰ZnSe纳米晶检测肝癌标志物GPC3的试剂盒，主要包括：表面交 联修饰GPC3抗体的ZnSe纳米晶，锌离子荧光探针溶液，GPC3抗体和GPC3蛋白标准品。上 述为试剂盒的主要试剂组成，未包括检测过程中所用的常规缓冲液，如包被缓冲液、洗涤缓 冲液和封闭缓冲液等。试剂盒中GPC3抗体是用于包被吸附于酶标板上，简称吸附抗体，交 联修饰在ZnSe纳米晶表面的GPC3抗体(该抗体和前述的吸附抗体对应GPC3蛋白的不同识 别位点）用于检测GPC3,简称检测抗体。所述ZnSe纳米晶与GPC3检测抗体可直接或间接 交联，优选为直接交联，所述ZnSe纳米晶粒径为1?10nm。
[0009] 优选的，所述表面交联修饰GPC3抗体的ZnSe纳米晶由如下方法制备得到：取 ZnSe纳米晶粉末加入磷酸缓冲溶液中，并相继加入足量的EDC和NHS，活化15?30分钟， 过量的EDC用巯基乙醇进行淬灭，之后加 GPC3抗体于37°C涡旋交联3?6小时，GPC3抗体 与ZnSe纳米晶质量之比为1 : 1，交联过后经离心过滤纯化，即得所述表面交联修饰GPC3 抗体的ZnSe纳米晶。所述表面交联修饰GPC3抗体的ZnSe纳米晶通常需用磷酸缓冲溶液 (pH7. 2)进行分散，储存备用。
[0010] 所述GPC3蛋白标准品优选为人重组GPC3蛋白，可作为免疫原或GPC3蛋白标准 品。所述的GPC3吸附抗体为兔抗人、鼠抗人、鸡抗人或其他GPC3抗体，使用时所述GPC3吸 附抗体稀释至蛋白含量为1?100 μ g/mL。优选的GPC3吸附抗体与GPC3检测抗体为同源 且识别GPC3蛋白不同序列。
[0011] 本发明试剂盒原理如下：首先用GPC3吸附抗体直接包被在聚苯乙烯的酶标板上， 然后加入包含GPC3抗原的样品溶液，两者通过抗原-抗体反应发生特异性结合，最后加入 表面修饰GPC3抗体的ZnSe纳米晶，ZnSe纳米晶交联的GPC3检测抗体与GPC3抗原结合形 成GPC3吸附抗体-GPC3抗原-GPC3检测抗体三明治夹心结构的纳米晶复合物，并利用ZnSe 纳米晶中的锌离子与缓冲体系中银离子的阳离子交换反应释放大量锌离子，触发锌离子探 针的强烈荧光，对GPC3检测信号进行放大，可以利用荧光分光光度计(或多功能酶标仪）检 测荧光强度。在一定范围内荧光信号强度与GPC3含量相关，基于此对GPC3标准品进行检 测，建立荧光信号强度与GPC3含量的标准曲线，从而通过检测未知样品中GPC3的荧光强度 可以得到样品中GPC3的含量，实现对GPC3的特异、灵敏检测。
[0012] 本发明是利用与GPC3抗体交联的每个ZnSe纳米晶都包含数千个锌离子，通过阳 离子交换反应可以将纳米晶体中的这些锌离子释放出来，然后触发锌离子特异性荧光染 料，这样每个GPC3抗体的信号相当于被放大了数千倍，因此在免疫反应检测血清样本中痕 量GPC3蛋白时就可以显著提高检测的灵敏度，降低检测限。
[0013] 所述锌离子荧光探针溶液组成如下：FluoZin-33yM，AgN03500 yM，溶剂为10mM、 pH7. 3的HEPES缓冲液。
[0014] 所述试剂盒还可包括：包被缓冲液、洗涤缓冲液和封闭缓冲液。
[0015] 所述包被缓冲液为本领域常规包被缓冲液，优选为pH=9. 6的碳酸盐缓冲液。
[0016] 所述洗涤缓冲液为本领域常规洗涤缓冲液，优选为pH=7. 4的PBS溶液。
[0017] 所述封闭缓冲液为本领域常规封闭缓冲液，优选为BSA质量浓度1%的PBS溶液 (ρΗ=7· 4)。
[0018] 本发明将双抗夹心法免疫分析和ZnSe纳米晶的阳离子交换反应相结合，实现对 免疫反应中GPC3检测信号的放大，用于检测痕量肝癌标志物GPC3具有信号稳定、灵敏度高 和检测限低等优点，可应用于肝癌患者的早期诊断。 (四）
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为ZnSe纳米晶的透射电镜图；
[0020] 图2为ZnSe纳米晶的电子衍射图；
[0021] 图3为ZnSe纳米晶信号放大策略检测GPC3标准溶液的荧光光谱图，a为GPC3标 准溶液的浓度为l〇〇ng/mL，b为GPC3标准溶液的浓度为10ng/mL，c为干扰对照卵白蛋白 (ovalbumin,简称OVA)溶液浓度为100ng/mL，d为空白对照；
[0022] 图4为ZnSe纳米晶信号放大策略检测GPC3标准溶液的标准曲线。 (五）
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0024] 实施例1 :
[0025] 试剂盒组成：
[0026] 表面交联修饰GPC3抗体的ZnSe纳米晶，制备方法见后；
[0027] 锌离子荧光探针溶液：10mM HEPES (pH7. 3) +AgN03500 μ M+FluoZin-33 μ Μ ;
[0028] GPC3抗体(吸附抗体):鼠抗人GPC3单克隆抗体(该抗体的识别位点为重构GPC3蛋 白的第121-220个氨基酸，购自Sigma公司）；
[0029] GPC3蛋白标准品：人重组GPC3蛋白（购自Life公司）；
[0030] 包被缓冲液：pH=9. 6的碳酸盐缓冲液；
[0031] 洗涤缓冲液：ρΗ=7· 4的PBS溶液；
[0032] 封闭缓冲液：BSA质量浓度1%的PBS溶液（ρΗ=7. 4)。
[0033] 表面交联修饰GPC3抗体的ZnSe纳米晶的制备：
[0034] (1)分别称取1. 10克的Se和7. 6克的Na2S03粉末，将二者加入40mL去离子水（电 阻为18兆欧）中90°C加热并通氮气，保持2小时至得到澄清的Na 2SeS03溶液。
[0035] (2)将0· 35克ZnCl2和0· 75mL巯基乙酸（MAA)-起加入50mL去离子水中混合，并 用NaOH调节溶液pH为9?10之间，然后取新鲜制备的Na 2SeS03溶液注入N2饱和的ZnCl2/ MAA混合溶液中，沸水浴中回流1小时，反应完成后冷却至室温，用过量的异丙醇清洗三次， 离心并真空干燥得到ZnSe纳米晶粉末，其透射电镜图见图1，电子衍射图见图2。
[0036] (3)取0. 4mg EDC、1. lmg NHS和100 μ g的ZnSe纳米晶粉末一起加入lmL磷酸缓 冲溶液中，活化15分钟，过量的EDC用1. 2 μ L巯基乙醇进行淬灭，之后加100 μ Llmg/mL的 GPC3抗体(检测抗体）（鼠抗人GPC3单克隆抗体(该抗体的识别位点为重构GPC3蛋白的第 303-460个氨基酸，购自Sant cruz公司）于混合溶液中，37°C润旋交联4小时，交联过后的 GPC3抗体修饰ZnSe纳米晶离心过滤纯化，并重新用100 μ L磷酸缓冲溶液进行分散，储存以 备用。
[0037] 实施例2 :GPC3检测标准曲线的建立
[0038] (1)GPC3捕获：取100μ L、10y g/mL的GPC3抗体(吸附抗体，溶于碳酸缓冲溶液中） 加入96孔板，4°C孵育过夜，孵育过后用封闭缓冲液进行封闭，接着分别将梯度浓度的GPC3 蛋白标准品溶液加入所述酶标板37°C孵育1小时（同时平行加入lOOng/mL的OVA标准溶液 (购自Thermo公司)作为干扰对照，操作方法同GPC3蛋白标准品溶液)，用PBS多次清洗后， 取100 μ L实施例1得到的修饰GPC3检测抗体的ZnSe纳米晶溶液（100倍稀释于PBS溶液 中）加入上述酶标板，并37°C孵育1小时，孵育完成后PBS三次清洗；
[0039] (2)信号放大并检测：取100yL锌离子荧光探针溶液(包含有500yMAgN0jP3yM FluoZin-3的10mM HEPES缓冲溶液）加入步骤（1)所述的酶标板，然后用荧光分光光度计 (或多功能酶标仪）检测500?800nm间的荧光发射光谱(激发光492nm)。
[0040] (3)建立标准曲线：步骤（1)的GPC3标准溶液的溶度梯度对应步骤（2)中检测到 的516nm处的荧光信号强度建立标准曲线，GPC3蛋白标准品溶液检测的荧光光谱图见图3， 获得的标准曲线见图4,此标准曲线可用于根据检测得到的荧光强度计算未知样品中GPC3 的浓度。由图3可知，本试剂盒对干扰对照组的0VA没有响应，因此说明本试剂盒对GPC3 蛋白检测具有特异性。由图4可知，当GPC3蛋白浓度在5ng/mL?100ng/mL范围内，本试 剂盒对GPC3蛋白检测呈良好的线性关系。
【权利要求】
1. 一种基于抗体修饰ZnSe纳米晶检测肝癌标志物GPC3的试剂盒，主要包括：表面交 联修饰GPC3抗体的ZnSe纳米晶，锌离子荧光探针溶液，GPC3抗体和GPC3蛋白标准品。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述表面交联修饰GPC3抗体的ZnSe纳米 晶由如下方法制备得到：取ZnSe纳米晶粉末加入磷酸缓冲溶液中，并相继加入足量的EDC 和NHS，活化15?30分钟，过量的EDC用巯基乙醇进行淬灭，之后加 GPC3抗体于37°C涡旋 交联3?6小时，GPC3抗体与ZnSe纳米晶质量之比为1 : 1，交联过后经离心过滤纯化，即 得所述表面交联修饰GPC3抗体的ZnSe纳米晶。
3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述锌离子荧光探针溶液组成如下： FluoZin-33 μ M，AgN03500 μ M，溶剂为 10mM、ρΗ7· 3 的 HEPES 缓冲液。
4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括：包被缓冲液、洗涤缓冲 液和封闭缓冲液。
5. 如权利要求要求4所述的试剂盒，其特征在于所述包被缓冲液为ρΗ=9. 6的碳酸盐缓 冲液。
6. 如权利要求要求4所述的试剂盒，其特征在于所述洗涤缓冲液为ρΗ=7. 4的PBS溶 液。
7. 如权利要求要求4所述的试剂盒，其特征在于所述封闭缓冲液为BSA质量浓度1%的 PBS溶液。
【文档编号】G01N33/574GK104090103SQ201410109381
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】刘景丰, 刘小龙, 韦学勇, 黄爱民, 王庆堂, 曾永毅 申请人:福州市传染病医院