一种鉴别连翘衍生品的方法
【专利摘要】本发明涉及一种鉴别连翘衍生品的方法，包括：1）取连翘衍生品直接作为含有活性成分组的连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物；2）对所述连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；3）通过定量分析手段得到所述标准参照品的绝对含量；4）利用所述特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出连翘衍生品中各活性成分的含量及活性成分组的含量。本发明可以反映连翘衍生品中含有哪些木脂素类和苯乙醇苷类化合物以及它们之间的比例，达到对连翘衍生品质量鉴定的目的。
【专利说明】一种鉴别连翘衍生品的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于天然药用植物的鉴别领域，具体地，涉及一种鉴别连翘衍生品的方法。【背景技术】
[0002]连翘是中国临床常用传统中药之一，为木犀科(Oleaceae)连翘属(Forsythia)植物连翅(Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl)的干燥果实,果实初熟尚带绿色时采收称为青翘，果实熟透颜色发黄时采收称为老翘。连翘归肺、心、小肠经，药性微寒，味苦，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热的功效[国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部.中国医药科技出版社，159.]。其活性成分主要为木脂素类和苯乙醇苷类化合物，具有抗病毒、抗炎、抗菌、抗氧化、降血酯、保肝等作用[王金梅，等.天然产物研究与开发2007，19:153.] ο
[0003]定性鉴别上述某类成分或定量测定其某种活性成分含量，已成为评价连翘衍生品质量的重要方法(例如中国药典2010版是对连翘衍生品中木脂素类成分连翘苷和苯乙醇苷类成分连翘酯苷进行定性和定量分析)；这种针对单一成分进行定性、定量分析的质量检测模式不能有效控制中药提取物的内在质量，无法满足当前对于客观有效地评价和控制连翘及其制剂质量的迫切要求。
[0004]指纹图谱是目前国际公认的控制中药或天然药物质量最有效的方式之一。人们凭借实用的指纹图谱不仅可确认该产品的真伪，同时能判断其稳定性。目前，连翘衍生品的木脂素和苯乙醇苷类化合物的指纹图谱研究工作，集中在HPLC指纹图谱[①[国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部.中国医药科技出版社，381.②孙国祥，等.中成药2007，29(2):161.]、毛细管电泳指纹图谱(HPCE法)[孙国祥，等.色谱2006，24(2): 196.]、高效液相色谱-质谱联用法(LC-MS) [Qu HH, et al.MICROCHEMICALJOURNAL, 2008;89(2):159]等。其中主流方法HPLC指纹图谱由于受非色谱条件(如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等)影响较大和需用标准品等等原因，重复性和可行性均存在许多局限性；HPCE法虽以其高效、快速、简便且柱不易受污染而优于HPLC法，但仍存在重现性较差、线性范围窄和灵敏度较低等不足；单一 LC-MS分析方法由于中药复方的复杂性和缺乏标准品的现状，MS还有离子化程度和基质干扰等问题，通常不足以对多种成分进行准确的结构定性。
[0005]I⑶核磁共振碳谱偶联(I⑶13C NMR coupling)指纹图谱技术，也叫反门控去偶核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，该技术是在已研究多年的核磁共振氢谱(1H NMR)指纹图谱技术[赵天增，等.1HNMR指纹法鉴定植物中药，中草药2000，31 (11) =868-870]的基础上联合其他技术(例如目前应用最广泛的高效液相(HPLC)指纹图谱技术[谢培山等，中药色谱指纹图谱，人民卫生出版社，2005])提出的一种新的非单一手段综合指纹图谱技术。目前为止，对于连翘衍生品及相关产品，并未见用I⑶核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术进行鉴别的报道和技术内容的披露。
[0006]连翘衍生品的品质不在于某个单一成分，其疗效是多个成分协同配比的结果。因此，建立不仅能控制连翘衍生品活性成分，而且能控制这些活性成分之比例的I⑶核磁共振碳谱偶联指纹图谱势在必行。连翘衍生品核磁共振碳谱偶联指纹图谱的研究与应用，不仅可以解决我国连翘衍生品评价的难题，也为加强连翘衍生品内在成分研究的系统化与标准化，实现与国际接轨提供了科学的保证。随着该技术在其他中药提取物中的推广应用，该技术的重大科学价值必将日趋突出。
【发明内容】
[0007]为了解决现有技术的问题，本发明的目的是提供一种鉴别连翘衍生品的方法。
[0008]为了实现上述目的，本发明提供的鉴别连翘衍生品的方法，包括以下步骤:
[0009]I)取连翘衍生品直接作为含有活性成分组(连翘木脂素和苯乙醇苷)的连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物；
[0010]2)对所述连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式(IGD核磁共振碳谱指纹图谱)测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；
[0011]3)通过定量分析手段得到所述标准参照品的绝对含量；
[0012]4)利用所述特征峰峰强度(各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度)的比值和所述标准参照品的绝对含量，计算出连翘衍生品中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量，即活性成分组的含量。
[0013]其中，采用具有获得清晰IGD核磁共振碳谱指纹图谱的提取工艺作为所述连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物的提取方式。
[0014]其中，步骤2)中，对连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，溶解连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物的溶剂为氘代甲醇(CD3OD)或氘代二甲基亚砜(DMS0-d6)，优选氘代二甲基亚砜；连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物和相应溶剂的质量体积比为55:1?65:1 (mg:mL),优选60:1。
[0015]其中，步骤2 )中，连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中，木脂素类活性成分的特征峰为C-7吸收峰，其化学位移为δ c83.0?88.0。
[0016]优选地，选择C-7'作为特征峰进一步区别木脂素类活性成分中的连翘苷和表松脂素_4_ β -D-匍萄糖苷，它们的化学位移为δ c81.0?82.0。
[0017]连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中，苯乙醇苷类活性成分的特征峰为C-9'吸收峰，其化学位移为δε165.0?170.0。
[0018]优选地，选择C-1或C-6作为特征峰进一步区别苯乙醇苷类活性成分中的连翘酯苷A和连翘酯苷H，它们的化学位移分别为δε119.0?120.0和δ。129.0?130.0。
[0019]其中，步骤2)中，根据特征峰峰强度的大小和位置，对连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中若干个活性成分进行排序。
[0020]进一步地，步骤2)中，根据特征峰峰强度的大小和位置，对连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中的活性成分:连翘苷、表松脂素_4-β -D-葡萄糖苷、松酯素-β -D-葡萄糖苷、连翘酯素、1-羟基-松脂素4" -O-葡萄糖苷、连翘酯苷Α、连翘酯苷H、连翘酯苷1、连翘酯苷F进行排序。[0021]其中，步骤2)中，所述峰强度可以采用峰高法、面积积分法或重量法计算。
[0022]其中，步骤3)中，所述定量分析手段为:高效液相(HPLC)法。
[0023]进一步地，当鉴别连翘木脂素类活性成分时，所述高效液相法的条件包括:
[0024]流动相为乙腈:水=(20~30): (70~80)，优选25:75 ;检测波长为277nm。
[0025]进一步地，当鉴别苯乙醇苷类活性成分时，所述高效液相法的条件包括:
[0026]流动相为乙腈:冰醋酸溶液=(10~20): (80~90)，优选15:85 ;检测波长为330nm。
[0027]其中，步骤3)中，所述标准参照品的绝对含量是指:用定量分析手段测定的标准参照品的质量百分含量。
[0028]进一步地，连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中，木脂素类活性成分和苯乙醇苷类活性成分的标准参照品为连翘苷或连翘酯苷A。
[0029]其中，步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为:
【权利要求】
1.一种鉴别连翘衍生品的方法，包括以下步骤: 1)取连翘衍生品直接作为含有活性成分组的连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物； 2)对所述连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度； 3)通过定量分析手段得到所述标准参照品的绝对含量； 4)利用各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度的比值和所述标准参照品的绝对含量，计算出连翘衍生品中各活性成分的含量及活性成分组的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用具有获得清晰IGD核磁共振碳谱指纹图谱的提取工艺作为所述连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物的提取方式。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，对连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，溶解连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物的溶剂为氘代二甲基亚砜或氘代甲醇。
4.根据权利要求1~3任意一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中，连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中，木脂素类活性成分的特征峰为C-7吸收峰，其化学位移为δ c83.0~88.0 ;优选地，选择C-7'作为特征峰进一步区别木脂素类活性成分中的连翘苷和表松脂素-4-β -D-葡萄糖苷，它们的化学位移为δ c81.0~82.0 ; 连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中，苯乙醇苷类活性成分的特征峰为C-9'吸收峰，其化学位移为δ c165.0~170.0 ;优选地，选择C-1或C-6作为特征峰进一步区别苯乙醇苷类活性成分中的连翘酯苷A和连翘酯苷H，它们的化学位移分别为δ c119.0~120.0和δ c129.0 ~130.0。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中，根据特征峰峰强度的大小和位置，对连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中若干个活性成分进行排序。
6.根据权利要求1~5任意一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述定量分析手段为高效液相法。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当鉴别连翘木脂素类活性成分时，所述高效液相法的条件包括流动相为乙腈:水=(20~30): (70~80)，优选25:75 ;检测波长为277nm ； 当鉴别苯乙醇苷类活性成分时，所述高效液相法的条件包括流动相为乙腈:冰醋酸溶液=(10~20): (80~90)，优选15:85 ;检测波长为330nm。
8.根据权利要求1~7任意一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述标准参照品的绝对含量是指用定量分析手段测定的标准参照品的质量百分含量。
9.根据权利要求1~8任意一项所述的方法，其特征在于，连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中的活性成分的标准参照品为连翘苷或连翘酯苷A。
10.根据权利要求1~9任意一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为:
11.根据权利要求1~10任意一项所述的方法，其特征在于，所述连翘衍生品包括:连翘提取物或连 翘天然药物。
【文档编号】G01N30/88GK103808749SQ201410044108
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月30日 优先权日:2013年1月30日
【发明者】董建军, 张海艳, 赵天增, 郭唯, 李晓, 陈玲, 范毅, 常霞, 王建军, 魏悦, 李倩 申请人:河南省科高植物天然产物开发工程技术有限公司