一种减少生物样品背景荧光的方法
【专利摘要】本发明公开了一种减少生物样品背景荧光的方法，属于生物工程【技术领域】。该方法采用苏丹黑B作为光吸收剂，利用高浓度乙醇溶液溶解苏丹黑B染色液使之能够快速均匀渗透到生物组织中。利用该方法所得生物样品背景荧光大大降低，提高了荧光成像的信号对比度。
【专利说明】一种减少生物样品背景荧光的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，特别涉及一种减少生物样品背景荧光的方法。
【背景技术】
[0002]落射荧光显微成像是生物研究中最常使用的显微技术之一，其与荧光蛋白(GFP及其衍生物，XFPs)、免疫荧光以及荧光探针标记的方法结合后，在动物学、植物学、微生物学、免疫学、病理学及药学等领域得到了广泛的应用。
[0003]然而，落射式荧光成像存在一个非常严重的问题，即背景荧光的干扰，尤其对较厚的生物组织块。背景荧光不仅可能导致错误的有效信号，甚至使得焦面上的信号被湮没。而在生物研究中，常常不仅需要局部的精细结构，更需要针对厚组织块进行大范围的结构追踪。例如脑结构和功能的研究，常常需要对毫米甚至厘米尺寸的小鼠鼠脑进行成像。因此，这种大尺寸样本背景荧光的问题亟待解决。
[0004]针对背景荧光干扰，目前有几种解决方式:一种是从成像技术角度消除焦面外荧光信号的影响。常见的解决方式是采用光切片的技术，如共聚焦激光扫描显微镜、多光子显微镜、光片照明及结构光照明显微镜。然而这些方式都存在一定的局限性。比如共聚焦激光扫描显微镜和多光子显微镜米用点扫描方式，成像速度慢、视场小，对大尺寸样本成像时需要耗费较长时间。光片照明显微镜受限于物镜的工作距离，无法使用高NA值的物镜进行成像，导致成像分辨率不高。结构光照明显微镜对噪声如散粒噪声敏感，通过解码算法后散粒噪声大大增加，难以应用于较厚、背景荧光较强的样本。另一种是采用化学手段降低背景荧光。比如在专利U.S.Pat.N0.6，221，612中描述了使用多种染料减少细胞溶液中不需要的光发射的方法。对于自发荧光导致的背景荧光，也一直有研究者尝试用各种染色剂来进行去除，如文献“Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescentlylabeled tissue.(Schnell, S.A., ff.A.Staines and M.ff.Wessendorf, Journal of Histochemistry&Cytochemistry47(1999) 719_730)”、“Working with GFP in the brain.(Doyle, K.P., R.P.Simon, A.Snyder, et al., Biotechniques 34 (2003) 492-494)，，、“Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolutionof in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.(Oliveira, V.C., R.C.V.Carrara, D.L.C.Simoes, et al., Histology and Histopathology25, (2010)1017_1024”、“Sudan Black B Reduces Autofluorescence in MurineRenal Tissue.(Sun, Y., H.Yu, D.Zheng, et al., Archives of Pathology&LaboratoryMediCinel35 (2011) 1335-1342)”。然而，目前的染色方法都局限在细胞溶液或几十微米的切片中，对毫米级甚至厘米级的生物组织块并没有研究。而当样品尺寸增大时，常常导致染色时间慢、染色不均匀、实验流程繁琐等现象。例如硫瑾染色小鼠全脑时染色分色通常需要接近一个月，Golg1-Cox法染色小鼠全脑甚至需要半年。因此，选择一种合适的适用于特定荧光物质的光吸收剂，找到其合适的使用条件，使其快速均匀地渗透到生物组织中，可能也需要大量的研究。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为解决上述问题而提供了一种大大降低生物样品荧光背景，提高荧光成像信号对比度的方法。
[0006]本发明所采用的技术方案是:
[0007]—种减少生物样品背景荧光的方法，包括以下步骤:
[0008](I)将生物样品用冰水预冷却的质量百分比为4%的多聚甲醛溶液固定6?24h ;
[0009](2)将步骤(I)得到的生物样品用冰水预冷却的浓度为0.01mol/L的PBS漂洗液清洗3?24h，其间更换新鲜漂洗液3?5次；
[0010](3)将步骤(2)得到的生物样品依次放入冰水预冷却的质量百分比为50%和70%的乙醇溶液中进行梯度脱水,每次15min?2h ；
[0011](4)将步骤(3)得到的生物样品放入苏丹黑B染色液中染色30min?48h ；
[0012](5)将步骤(4)得到的生物样品用冰水预冷却的浓度为0.01mol/L的PBS漂洗液6?24h，其间更换新鲜漂洗液3?5次。
[0013]优选地，所述步骤(I)中生物样品的尺寸不超过2厘米见方。
[0014]进一步地，所述步骤(4)中苏丹黑B染色液是由质量百分比90?100%的乙醇溶解浓度为0.5?5w/w%。(g/kg)的苏丹黑B染色液制备得到。
[0015]进一步地，所述步骤(4)中苏丹黑B染色液染色时间根据生物样品的大小而定，I毫米厚度以内的组织块染色时间为30min?2h，I?5毫米厚度的组织块染色时间为I?12小时，5毫米?2厘米厚度的组织块染色时间为12?48h。
[0016]优选地，所述生物样品可以为任何发射荧光的动物组织。
[0017]本发明具有以下优点:
[0018]本发明是将一种光吸收剂均匀分散在生物样品中，该光吸收剂的吸收光谱与所述生物样品背景荧光的激发或发射光谱重叠，采用苏丹黑B作为光吸收剂，利用高浓度乙醇溶液溶解苏丹黑B染色液使之能够快速均匀渗透到生物组织中。该方法所得生物样品背景荧光大大降低，提高了荧光成像的信号对比度。本发明方法成本低廉，操作步骤简单，处理时间短，适合在一般实验室推广使用。同时本发明的方法能应用于厘米尺寸生物样品中，处理时间短。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明实施例1采用苏丹黑B染色液处理生物样本前后的背景荧光对比显微镜图。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图和实施方式对本发明做进一步详细的说明。
[0021]实施例1
[0022]本实施例提供了一种减少生物样品背景荧光的方法，包括以下步骤:
[0023]生物样本为Thyl-eYFP-H小鼠3毫米厚度的脑块，成像系统为Olympus 1X71宽场突光显微镜。[0024](lMfThyl-eYFP-H line转基因小鼠用1%戊巴比妥钠麻醉后，通过心脏左心室灌注37°C的0.01mol/L的PBS溶液3分钟，待血液冲洗干净后，立即灌注冰水预冷却的质量百分比4%多聚甲醛固定液，并持续I小时。然后，取出小鼠全脑，切成3毫米厚度的脑块，再次放入冰水预冷却的4%多聚甲醛固定液中后固定12小时。固定液中加入2.5%蔗糖，溶剂为浓度为0.01mol/L的PBS0
[0025](2)固定结束后，将全脑样本放入冰水预冷却的浓度为0.0lmol/L的PBS中漂洗12小时，其间更换新液3次，以彻底清洗掉残余的多聚甲醛固定液。
[0026](3)接着，将脑块样本依次放入冰水预冷却的浓度为50%和70%乙醇溶液中进行梯度脱水，每次30min。
[0027](4)脱水结束后，将全脑样本放入冰水预冷却的95%乙醇配制的0.5%。苏丹黑B染色液中，在避光的情况下染色6小时。苏丹黑B染色液在处理样本前已过滤。
[0028](5)最后，染色6小时的脑块放置到冰水预冷却的浓度为0.0lmol/L的PBS中漂洗12小时，其间更换新液3次，以彻底清洗掉残余的乙醇溶液。参照图1，a是染色前的样本，成像曝光时间120毫秒；b是染色后的样本，成像曝光时间300毫秒。从图1中可以明显看出，通过本实施例的方法，生物样品背景荧光大大降低，提高了荧光成像的信号对比度。
[0029]实施例2
[0030]本实施例提供了一种减少生物样品背景荧光的方法，包括以下步骤:
[0031]生物样本为Thyl-eYFP-H小鼠全脑样本。
[0032](I)将Thyl-eYFP-H line转基因小鼠用1%戊巴比妥钠麻醉后，通过心脏左心室灌注37°C的0.01mol/L的PBS溶液3分钟，待血液冲洗干净后，立即灌注冰水预冷却的质量百分比4%多聚甲醛固定液，并持续I小时。然后，取出小鼠全脑，再次放入冰水预冷却的4%多聚甲醛固定液中后固定24小时。固定液中加入2.5%蔗糖，溶剂为浓度为0.01mol/L的 PBS。
[0033](2)固定结束后，将全脑样本放入冰水预冷却的浓度为0.01mol/L的PBS中漂洗24小时，其间更换新液5次，以彻底清洗掉残余的多聚甲醛固定液。
[0034](3)接着，将全脑样本依次放入冰水预冷却的浓度为50%和70%乙醇溶液中进行梯度脱水，每次2小时。
[0035](4)脱水结束后，将全脑样本放入冰水预冷却的90%乙醇配制的3%。苏丹黑B染色液中，在避光的情况下染色48小时。苏丹黑B染色液在处理样本前已过滤。
[0036](5)最后，染色48小时的鼠脑放置到冰水预冷却的浓度为0.01mol/L的PBS中漂洗24小时，其间更换新液4次，以彻底清洗掉残余的乙醇溶液。
[0037]实施例3
[0038]本实施例提供了一种减少生物样品背景荧光的方法，包括以下步骤:
[0039]生物样本为Thyl-eYFP-H小鼠I毫米厚度的脑块。
[0040](I)将Thyl-eYFP-H line转基因小鼠用1%戊巴比妥钠麻醉后，通过心脏左心室灌注37°C的0.01mol/L的PBS溶液3分钟，待血液冲洗干净后，立即灌注冰水预冷却的质量百分比4%多聚甲醛固定液，并持续I小时。然后，取出小鼠全脑，切成I毫米厚度的脑块，再次放入冰水预冷却的4%多聚甲醛固定液中后固定6小时。固定液中加入2.5%蔗糖，溶剂为浓度为0.01mol/L的PBS0[0041](2)固定结束后，将全脑样本放入冰水预冷却的浓度为0.01mol/L的PBS中漂洗3小时，其间更换新液4次，以彻底清洗掉残余的多聚甲醛固定液。
[0042](3)接着，将全脑样本依次放入冰水预冷却的浓度为50%和70%乙醇溶液中进行梯度脱水，每次15分钟。
[0043](4)脱水结束后，将全脑样本放入冰水预冷却的100%乙醇配制的5%。苏丹黑B染色液中，在避光的情况下染色30分钟。苏丹黑B染色液在处理样本前已过滤。
[0044](5)最后，染色30分钟的鼠脑放置到冰水预冷却的浓度为0.01mol/L的PBS中漂洗15小时，其间更换新液3次，以彻底清洗掉残余的乙醇溶液。
[0045]本发明是将一种光吸收剂均匀分散在生物样品中，该光吸收剂的吸收光谱与所述生物样品背景荧光的激发或发射光谱重叠，采用苏丹黑B作为光吸收剂，利用高浓度乙醇溶液溶解苏丹黑B染色液使之能够快速均匀渗透到生物组织中。该方法所得生物样品背景荧光大大降低，提高了荧光成像的信号对比度。本发明方法成本低廉，操作步骤简单，处理时间短，适合在一般实验室推广使用。同时本发明的方法能应用于厘米尺寸生物样品中，处理时间短。
[0046]最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【权利要求】
1.一种减少生物样品背景荧光的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将生物样品用冰水预冷却的质量百分比为4%的多聚甲醛溶液固定6?24h; (2)将步骤(I)得到的生物样品用冰水预冷却的浓度为0.0lmol/L的PBS漂洗液清洗3?24h，其间更换新鲜漂洗液3?5次； (3)将步骤(2)得到的生物样品依次放入冰水预冷却的质量百分比为50%和70%的乙醇溶液中进行梯度脱水，每次15min?2h ； (4)将步骤(3)得到的生物样品放入苏丹黑B染色液中染色30min?48h； (5)将步骤(4)得到的生物样品用冰水预冷却的浓度为0.01mol/L的PBS漂洗液6?24h，其间更换新鲜漂洗液3?5次。
2.根据权利要求1所述的减少生物样品背景荧光的方法，其特征在于，所述步骤(I)中生物样品的尺寸不超过2厘米见方。
3.根据权利要求1所述的减少生物样品背景荧光的方法，其特征在于，所述步骤(4)中苏丹黑B染色液是由质量百分比90?100%的乙醇溶解浓度为0.5?5w/w%。(g/kg)的苏丹黑B染色液制备得到。
4.根据权利要求3所述的减少生物样品背景荧光的方法，其特征在于，所述步骤(4)中苏丹黑B染色液染色时间根据生物样品的大小而定，I毫米厚度以内的组织块染色时间为30min?2h，I?5毫米厚度的组织块染色时间为I?12小时，5毫米?2厘米厚度的组织块染色时间为12?48h。
5.根据权利要求1至4任一项所述的减少生物样品背景荧光的方法，其特征在于，所述生物样品可以为任何发射荧光的动物组织。
【文档编号】G01N1/28GK103776679SQ201410043251
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月29日 优先权日:2014年1月29日
【发明者】龚辉, 骆清铭, 胡碧荷 申请人:华中科技大学