一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法
【专利摘要】一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法，属于水产品检测【技术领域】，它包括样品提取、净化、标准曲线的绘制、实验所用的仪器条件及代谢产物的结构分析。本发明应用液相色谱-串联质谱-离子阱技术，采用pMRM法能够准确测定预见的代谢产物，并能检测到低浓度的代谢产物；采用QTrap独有的MRM-IDA-EPI工作模式，一次进样，既可得到相应代谢产物的MRM色谱图，又可得到其MS2质谱图。本发明可以检测到包括环丙沙星在内的10种代谢产物，其中有两种新发现的代谢产物的质谱响应强度远大于环丙沙星。本发明填补了我国目前没有海参中恩诺沙星代谢产物检测方法的空白，对研究其它药物的代谢产物及未知药物筛查提供了新的借鉴思路。
【专利说明】一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水产品检测【技术领域】，是一种用高效液相色谱-串联质谱-离子阱质谱(LC-MS/MS-Qtrap)法检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法。
【背景技术】
[0002]恩诺沙星(enrofloxacin, ENR)属于第三代喹诺酮类合成抗菌药物，是水产养殖中主要抗菌药物之一，其作用机理为通过抑制细菌DNA回旋酶亚基A的活性，抑制酶的切割与连接功能，使DNA、RNA及蛋白质的合成受干扰，从而起到抑菌、杀菌的目的。然而，恩诺沙星的不规范使用和滥用可以在动物体、食品、
[0003]环境和消费者体内引起细菌耐药性增强，严重威胁人类和动物的健康。
[0004]恩诺沙星在环境中和在动物体内具有不同的降解或代谢途径，其在环境中的降解产物和在动物体内的代谢产物亦各不相同。研究表明，环境作用，如介质的极性、离子、PH值及与生物分子的结合等因素，是影响氟喹诺酮类物质光化学特性的关键因素。Li Yan发现恩诺沙星在水溶液中有包括环丙沙星在内的11种氧化降解产物。Michela发现土壤中的恩诺沙星在光诱导下有10种降解产物。恩诺沙星的光解产物主要通过三种途径降解:氧化降解哌嗪侧链，脱氟反应，氟溶剂分解。大鼠口服恩诺沙星后，在体内可检测到6种代谢产物，包括环丙沙星、葡糖苷酸恩诺沙星和其它4种代谢产物；恩诺沙星在褐腐真菌(Gloeophyllum striatum)作用下有11种降解产物，其中8种降解产物的结构得到确定。在毛霉(Mucorramannianus)作用下仅产生3种代谢产物，分别是N-氧化恩诺沙星、N-乙酰化环丙沙星和去乙烯恩诺沙星。在锯缘青蟹口灌恩诺沙星给药后血淋巴中发现3种代谢产物，包括环丙沙星、羟基化恩诺沙星和加氧恩诺沙星。兔肌注恩诺沙星后，在体内检测到6种代谢产物，包括环丙沙星、加氧恩诺沙星及其他四种代谢产物。恩诺沙星在食用动物体内的代谢产物除环丙沙星外，关于其他代谢产物的研究还较少。
[0005]现有报道研究代谢产物时主要借助离子阱质谱或飞行时间质谱法，通过研究化合物裂解机制分析代谢产物。离子阱质谱具备多级串级功能，适合分子结构方面的定性研究，能够给出分子局部的结构信息，但不能做多反应监测(MRM)和中性丢失扫描，无法筛选特征结构分子。由于在筛选未知化合物时采用一级质谱全扫描，在灵敏度方面有欠缺。飞行时间质谱属于高分辨质谱，可以有助于未知化合物的定性和m/z近似离子的区别，分析速度快，但价格昂贵，较精密，维护成本高。而本发明采用高效液相色谱-串联质谱-离子阱质谱(LC-MS/MS-Qtrap)法分析海参中恩诺沙星代谢产物，该方法同时具备多反应监测(MRM)、选择反应监测扫描(SRM)、中性丢失功能和多级串级功能，利用该方法可以检测海参中恩诺沙星未知代谢产物，根据给出的母离子与碎片离子的关系对其代谢产物进行结构解析。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法。本发明应用液相色谱-串联质谱-离子阱质谱(LC-MS/MS-Qtrap)技术，采用pMRM法准确测定预见的代谢产物，采用QTrap独有的MRM-1DA-EPI工作模式，在进行三重四极杆质谱工作的同时，还能进行线性离子阱质谱的工作，一次进样，既可得到恩诺沙星在海参体内代谢产物的MRM色谱图，又可得到其代谢产物的MS2质谱图。本方法可以检测到海参体内10种代谢产物，除检测到恩诺沙星最主要的代谢产物环丙沙星外，还检测到恩诺沙星的另两种主要代谢产物，一种为环丙沙星的同分异构体，一种为恩诺沙星的加氢还原产物，且这两种新发现的代谢产物的质谱相应强度远大于环丙沙星。恩诺沙星在海参体内的代谢机制与其他动物体内的代谢机制有差异。
[0007]本发明是按照以下操作方法完成的:
[0008]一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法，样品经无水硫酸钠脱水后，用酸化乙腈提取其中的恩诺沙星及其代谢产物，提取液浓缩后，用乙腈水溶液溶解残留物，用正己烷除脂，用液相色谱-串联质谱-离子阱质谱(LC-MS/MS-Qtrap)法进行测定，根据母离子与碎片离子的关系，对样品中的恩诺沙星及其未知代谢产物进行结构分析，所用的液相色谱-串联质谱-离子阱质谱实验所用的仪器条件如下:
[0009](I)色谱条件:
[0010]a)色谱柱:C18 反相色谱柱,2.1mmX 150mm, 5 μ m ；
[0011]b)柱温:35°C ;
[0012]c)流速:0.35mL/min ；
[0013]d)进样量:IOyL ;
[0014]e)流动相:A:0.1% (体积比)甲酸水溶液，B:乙腈，梯度洗脱程序见表I ;
[0015](2)质谱条件:
[0016]离子源参数:
[0017]a)离子化模式:电喷雾离子源(ESI)；
[0018]b)扫描方式:正离子扫描；
[0019]c)碰撞气 CAD, Medium ；
[0020]d)气帘气 Curtain gas, 35psi ;
[0021]e)雾化气 Gasl, 30psi ;
[0022]f)辅助加热气 Gas2，3Opsi ；
[0023]g)喷雾电压 IS:5500V ；
[0024]h)离子源温度 TEM: 500 0C ；
[0025](3)化合物参数:
[0026]恩诺沙星的代谢产物通过MRM-1DA-EPI模式来分析，其中MRM扫描的IDA阈值为500cps，EPI 扫描速率为 1000amu/s，CE 为 40±15eV，DP 为 50V，驻留时间 20ms ;MRM 离子对则需根据恩诺沙星的结构及在体内可能发生的化学反应，预测其代谢产物的母离子及碎片离。
[0027]一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法，它包括样品提取、净化、标准曲线的绘制、实验所用的仪器条件和代谢产物的结构分析，具体步骤如下:
[0028](I)样品提取
[0029]样品加入无水硫酸钠后，涡旋混合均匀，再加入酸化乙腈超声波提取，提取液经氮气吹干，吹干后的残留物待净化；[0030](2)净化
[0031]加入乙腈水溶液涡旋溶解步骤(1)所述的残留物，再加入正己烷，涡旋混合，静置分层后，取下层清液，高速离心，过0.22 μ m有机相微孔滤膜后得到样品待测液，供液相色谱_串联质谱_尚子讲质谱(LC-MS/MS-Qtrap)仪分析测定；
[0032](3)标准曲线的绘制
[0033]精确称取恩诺沙星和环丙沙星标准品，先用醋酸溶解，再用甲醇稀释并定容，配制成标准储备液，采用定容溶液稀释配制恩诺沙星和环丙沙星的混合标准系列溶液，进高效液相色谱-串联质谱-离子阱质谱(LC-MS/MS-Qtrap)法分析，绘制标准曲线；
[0034]进一步，步骤(3)所述的标准溶液的配制方法为称取的恩诺沙星和环丙沙星标准品，先用醋酸溶解，再用甲醇稀释并定容，配制成浓度为100 μ g/mL标准储备液，采用定容溶液稀释配制恩诺沙星及环丙沙星的混合标准系列溶液，所述的定容溶液为乙腈与0.1%甲酸水溶液的体积比为1:9。
[0035](4)实验所用的仪器条件
[0036]色谱条件如下:
[0037]a)色谱柱:C18 反相色谱柱,2.1mmX 150mm, 5 μ m ；
[0038]b)柱温:35°C ；
[0039]c)流速:0.35mL/min ；
[0040]d)进样量:IOyL ;
[0041]e)流动相:A:0.1%甲酸水溶液，B:乙腈，梯度洗脱程序见表1 ;
[0042]表1流动相梯度洗脱条件
[0043]
【权利要求】
1.一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法，其特征在于样品经无水硫酸钠脱水后，用酸化乙腈提取其中的恩诺沙星及其代谢产物，提取液浓缩后，用乙腈水溶液溶解残留物，用正己烷除脂，用液相色谱-串联质谱-离子阱质谱法进行测定，根据母离子与碎片离子的关系，对样品中的恩诺沙星及其未知代谢产物进行结构分析，所用的液相色谱-串联质谱-离子阱质谱实验所用的仪器条件如下: (1)色谱条件: a)色谱柱:C18反相色谱柱,2.1mmX 150mm, 5 μ m ； b)柱温:35°C；
c)流速:0.35mL/min ； d)进样量:10yL; e)流动相:A:0.1% (体积比)甲酸水溶液，B:乙腈，梯度洗脱程序见表1 ; (2)质谱条件: 离子源参数: a)离子化模式:电喷雾离子源； b)扫描方式:正离子扫描； c)碰撞气CAD, Medium ；
d)气帘气Cu rtain gas, 35psi ; e)雾化气Gasl,30psi ； f)辅助加热气Gas2，30psi； g)喷雾电压IS:5500V ； h)离子源温度TEM: 500 0C ； (3)化合物参数: 恩诺沙星的代谢产物通过MRM-1DA-EPI模式来分析，其中MRM扫描的IDA阈值为500cps，EPI 扫描速率为 1000amu/s，CE 为 40±15eV，DP 为 50V，驻留时间 20ms ;MRM 离子对则需根据恩诺沙星的结构及在体内可能发生的化学反应，预测其代谢产物的母离子及碎片离。
2.根据权利要求1所述的一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法，其特征在于它包括样品提取、净化、标准曲线的绘制、实验所用的仪器条件和代谢产物的结构分析，具体步骤如下: (1)样品提取 样品加入无水硫酸钠后，涡旋混合均匀，再加入酸化乙腈超声波提取，提取液经氮气吹干，吹干后的残留物待净化； (2)净化 加入乙腈水溶液涡旋溶解步骤(1)所述的残留物，再加入正己烷，涡旋混合，静置分层后，取下层清液，高速离心，过0.22 μ m有机相微孔滤膜后得到样品待测液，供液相色谱-串联质谱-离子阱质谱仪分析测定； (3)标准曲线的绘制 精确称取恩诺沙星和环丙沙星标准品，先用醋酸溶解，再用甲醇稀释并定容，配制成标准储备液，采用定容溶液稀释配制恩诺沙星和环丙沙星的混合标准系列溶液，进高效液相色谱-串联质谱-离子阱质谱法分析，绘制标准曲线； (4)实验所用的仪器条件 色谱条件如下: a)色谱柱:C18反相色谱柱,2.1mmX 150mm, 5 μ m ； b)柱温:35°C；
c)流速:0.35mL/min ； d)进样量:10yL; e)流动相:A:0.1%甲酸水溶液，B:乙腈，梯度洗脱程序见表1 ; 表1流动相梯度洗脱条件
3.根据权利要求1所述的一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法，其特征在于步骤(3)所述的标准溶液的配制方法为称取的恩诺沙星和环丙沙星标准品，先用醋酸溶解，再用甲醇稀释并定容，配制成浓度为100 μ g/mL标准储备液，采用定容溶液稀释配制恩诺沙星及环丙沙星 的混合标准系列溶液，所述的定容溶液为乙腈与0.1%甲酸水溶液的体积比为1:9。
【文档编号】G01N30/02GK103743809SQ201410028583
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】邢丽红, 孙伟红, 李兆新, 翟毓秀, 郭江涛, 郭萌萌, 吴海燕, 唐锡招 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所