一种昆虫幼虫石蜡切片方法
【专利摘要】本发明公开了一种昆虫幼虫石蜡切片方法，属于显微组织切片【技术领域】。该方法包括组织固定、组织脱水、组织透明、浸蜡、包埋与切片、展片与粘片、脱蜡和组织复水等步骤，操作简单、耗时短，最终切片对组织区分度高，能观察到虫体完整的空间结构，适用于身体柔软、液体含量高、腔室比例大的幼虫虫体材料。采用该方法处理3龄棉铃虫幼虫虫体，在明场下观察其体壁完整，体腔内部的肌肉组织、神经组织等分布其间，占身体比例大的消化道结构清晰完整，一对腹足的空间结构正常；在蓝光激发下，能够观察到各器官组织被激发的自发绿色荧光水平。
【专利说明】一种昆虫幼虫石蜡切片方法
【技术领域】
[0001]本发明具体涉及一种昆虫幼虫石蜡切片方法，属于显微组织切片【技术领域】。
【背景技术】
[0002]昆虫石蜡切片技术是研究昆虫组织形态及组织病理的重要实验技术，一般包括解剖、固定、脱水透明、包埋、切片等步骤。昆虫外骨骼较为坚硬，难以制作完整的石蜡切片，目前昆虫石蜡切片方法多数用于昆虫的局部组织或器官(如触角、消化道、足等)，这样不能观察到昆虫整体的显微结构。昆虫幼虫柔韧的体壁包裹着开放流动的血淋巴和体液,血淋巴和体液中从头部至尾部贯穿着管状消化道，消化道相对体积较大，消化道内由昆虫摄取的食物填充，食物水分含量高。针对这种身体柔软、液体含量高、腔室比例大的幼虫虫体材料，目前常规的切片方法不仅操作复杂，需要耗费较长时间，且常使用毒性大的二甲苯等化学物质，更重要的是最终固定、包埋、切片等的效果不够理想，最终切片对组织区分度十分有限，尤其是占虫体比例非常大的消化道容易变形或破碎，难以观察到虫体完整空间结构。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种昆虫幼虫石蜡切片方法。
[0004]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是:
[0005]一种昆虫幼虫石蜡切片方法，包括以下步骤:
[0006](I)组织固定:
[0007]取昆虫虫体浸于组织固定液中，抽真空并保持负压10?30分钟(使虫体完全沉至底部)，再于4°C下静置10?14小时；
[0008](2)组织脱水:
[0009]取组织固定后的虫体，4°C条件下，依次用浓度梯度为50%、60%、70%、90%、100%的乙醇溶液脱水，每个梯度的处理时间至少为I小时；
[0010](3)组织透明:
[0011]取组织脱水后的虫体，室温下在组织透明剂中浸泡5?9小时(每1.5?2小时更换组织透明剂一次);
[0012](4)浸蜡、包埋与切片:
[0013]取组织透明后的虫体，在65°C的液体石蜡中浸泡7?9小时，凝固定型后切片；
[0014](5)展片与粘片:
[0015]取切片移至载玻片上，在切片边缘滴加60°C的蒸馏水至切片完全展开，再置于30?37°C条件下10?14小时粘片；
[0016](6)脱蜡和组织复水:
[0017]取组织透明剂滴加在切片组织上，保持至少20分钟后吸走，重复至少按此，再依次滴加浓度梯度为100%、95%、85%、70%、50%、30%的乙醇溶液和水，每个梯度的处理时间为I?5分钟。[0018]所述步骤(I)中的组织固定液为:取IOOmL PBS缓冲液，调节缓冲液pH值至
10.5?11.5，加热至65?75°C，加入多聚甲醛至终浓度为4%，待溶解完全后冷却，调节溶液pH值至6.5?7.5，再加入30 μ L吐温-20或吐温Χ-100，冷却至4°C备用。固定液的用量与虫体的体积比为20:1。
[0019]所述的PBS 缓冲液的组成为:NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L, Na2HPO4 IOmmol/L, KH2PO4 2mmol/L, pH 值为 5 ?7。
[0020]所述步骤(I)中负压的压力值为-1.0KPa0
[0021]所述步骤(2)中乙醇用量与虫体的体积比为20:1 ;每个梯度的处理时间优选为I小时。
[0022]所述步骤(2 )中组织脱水步骤为:
[0023]I) 4°C条件下，50%乙醇中保持Ih,
[0024]2) 4°C条件下，60%乙醇中保持Ih,
[0025]3) 4°C条件下，70%乙醇中保持Ih (此步骤可长期存放)，
[0026]4) 4°C条件下，90%乙醇中保持Ih,
[0027]5)4°C条件下，无水乙醇中保持lh，
[0028]6)4°C条件下，无水乙醇中保持lh，
[0029]7)4°C条件下，无水乙醇中保持lh。
[0030]所述步骤(3 )中组织透明步骤为:
[0031 ]I)室温条件下，组织透明剂中浸泡I.5?3小时，
[0032]2 )室温条件下，组织透明剂中浸泡1.5?3小时，
[0033]3 )室温条件下，组织透明剂中浸泡2?3小时。
[0034]所述步骤I)、2 )中的浸泡时间优选1.5小时，步骤3 )中的浸泡时间优选2小时。
[0035]所述的组织透明剂为Histo-Clear，型号为SG HS-200，购自美国NationalDiagnotics 公司。
[0036]所述步骤(4)中浸蜡步骤为:
[0037]I)浸入液体石蜡，65°C浸泡2小时，
[0038]2)浸入液体石蜡，65°C浸泡2小时，
[0039]3)浸入液体石蜡，65°C浸泡2小时，
[0040]4)浸入液体石腊，65°C浸泡2小时。
[0041]所述步骤(4)中将第四次的石蜡连同虫体组织一起倒入包埋盒中，迅速调整虫体在石蜡中的位置，在冷水中凝固定型完成包埋。
[0042]所述步骤(6)中脱蜡和组织复水步骤为:
[0043]I)将组织透明剂滴加在切片组织上，保持20min，再用吸水纸在切片边缘吸走，
[0044]2)将组织透明剂滴加在切片组织上，保持20min，再用吸水纸在切片边缘吸走，
[0045]3)将组织透明剂滴加在切片组织上，保持20min，再用吸水纸在切片边缘吸走，
[0046]4)将无水乙醇滴加在切片组织上,保持Imin,再用吸水纸在切片边缘吸走，
[0047]5)将无水乙醇滴加在切片组织上,保持Imin,再用吸水纸在切片边缘吸走，
[0048]6)将95%乙醇滴加在切片组织上，保持lmin，再用吸水纸在切片边缘吸走，
[0049]7)将85%乙醇滴加在切片组织上，保持lmin，再用吸水纸在切片边缘吸走，[0050]8)将70%乙醇滴加在切片组织上，保持lmin，再用吸水纸在切片边缘吸走，
[0051]9)将50%乙醇滴加在切片组织上，保持lmin，再用吸水纸在切片边缘吸走，
[0052]10)将30%乙醇滴加在切片组织上，保持lmin，再用吸水纸在切片边缘吸走，
[0053]11)将无菌水滴加在切片组织上，保持lmin，再用吸水纸在切片边缘吸走。
[0054]本发明的有益效果:
[0055]本发明中昆虫幼虫石蜡切片方法，操作简单、耗时短，最终切片对组织区分度高，能观察到虫体完整的空间结构,适用于身体柔软、液体含量高、腔室比例大的的幼虫虫体材料。采用该方法处理3龄棉铃虫幼虫虫体，在明场下观察其体壁完整，体腔内部的肌肉组织、神经组织等分布其间，尤其是占身体比例非常大的消化道结构清晰完整，甚至一对腹足也空间结构正常；在蓝光激发下，能够观察到各器官组织被激发的自发绿色荧光水平。本发明昆虫整体石蜡切片方法即可以弥补局部观察的不足，还可以进行免疫酶染色和原位杂交等组织定位，为昆虫生理、病理学等方面的研究提供新的试验方法。
[0056]本发明在组织透明步骤中采用Histo-Clear组织透明剂，在处理组织切片时不需要吸入有毒的二甲苯，安全性高，透明处理效果好。Histo-Clear处理的样本没有二甲苯处理的硬和脆，方便切成更薄的切片，并且延长了切片刀片的寿命。
【专利附图】
【附图说明】
[0057]图1为本发明实施例1中棉铃虫3龄幼虫虫体腹节横切面切片。
【具体实施方式】
[0058]下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0059]实施例1
[0060]本实施例中昆虫幼虫石蜡切片方法，包括以下步骤:
[0061]1、组织固定
[0062]在化学通风柜中配制4%的多聚甲醛溶液作为组织固定液，固定液现配现用，组织固定液配制流程为:在100毫升PBS缓冲液(PBS缓冲液:NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 IOmmoI/L，KH2PO4 2mmol/L，pH值为5?7)中，添加固体氢氧化钠颗粒，使pH值达到11，然后在微波炉中加热到70°C，加入多聚甲醛颗粒4g，快速摇动至溶解，用冰水浴对溶液进行冷却，用浓硫酸调整pH值至7,最后添加30 μ I Tween20,配制好的组织固定液冷却到 4。。；
[0063]固定流程为:将供试虫体(室内饲养棉铃虫3龄幼虫，饲养室温度27°C，相对湿度60%，光照16:8/L:D)直接投放入到4°C预冷的现配的固定液中，固定液的量与虫体的体积比为20:1，用真空泵抽真空，保持负压值-l.0kpa，时间15min，解除负压后，确认虫体已沉入固定液底部，将固定液连同虫体一起放入4°C保持12h ；
[0064]2、组织脱水
[0065]从固定液取出中组织固定完毕的虫体，使用乙醇梯度溶液依次进行如下脱水步骤(乙醇溶液用量与虫体的体积比为20:1):
[0066]I) 4°C条件下，50%乙醇中保持Ih,
[0067]2) 4°C条件下，60%乙醇中保持Ih,[0068]3) 4°C条件下，70%乙醇中保持Ih,
[0069]4) 4°C条件下，90%乙醇中保持Ih,
[0070]5)4°C条件下，无水乙醇中保持lh，
[0071]6)4°C条件下，无水乙醇中保持lh，
[0072]7) 4°C条件下，无水乙醇中保持Ih ；
[0073]3、组织透明处理
[0074]米用美国National Diagnotics 公司组织透明剂 Histo-Clear,每次 Histo-Clear的量与虫体的体积比为20:1，依次进行以下3个步骤:
[0075]I)室温条件下，Histo-Clear液体中浸泡1.5小时，
[0076]2)室温条件下，Histo-Clear液体中浸泡1.5小时，
[0077]3)室温条件下，Histo-Clear液体中浸泡2小时；
[0078]4、浸蜡与包埋
[0079]预先将石蜡在65°C下融化，将经组织透明处理过的虫体依次经过以下4个浸蜡步骤:
[0080]I)浸入液体石蜡，65°C浸泡2h，
[0081]2)浸入液体石蜡，65°C浸泡2h，
[0082]3)浸入液体石蜡，65°C浸泡2h，
[0083]4)浸入液体石蜡，65°C浸泡2h，
[0084]将第四次的石蜡连同虫体组织一起倒入包埋盒中，迅速调整虫体在石蜡中的位置，在冷水中凝固定型完成包埋；
[0085]5、切片
[0086]将虫体石蜡包埋块固定于切片机刀架上，虫体横切面垂直于刀口，修除近刀一端包埋块的石蜡仅保留虫体组织，控制切片厚度9 μ m进行连续切片；
[0087]6、展片
[0088]用毛笔将连续切片转移至载玻片上，用移液器滴加60°C蒸馏水150 μ I到切片边缘，切片处于半悬浮状态，待切片缓慢舒展；
[0089]7、粘片
[0090]展片置于35°C烘箱中，经12h完成粘片；
[0091]8、脱蜡和组织复水
[0092]室温条件下，对切片进行如下脱蜡和组织复水步骤:
[0093]I)用移液器将Histo-Clear液体轻滴加在切片组织上,保持20min,然后用吸水纸在切片边缘吸走Histo-Clear,
[0094]2)用移液器将Histo-Clear液体轻滴加在切片组织上,保持20min,然后用吸水纸在切片边缘吸走Histo-Clear,
[0095]3)用移液器将Histo-Clear液体轻滴加在切片组织上,保持20min,然后用吸水纸在切片边缘吸走Histo-Clear,
[0096]4)用移液器将无水乙醇液体轻滴加在切片组织上，保持lmin，然后用吸水纸在切片边缘吸走无水乙醇，
[0097]5)用移液器将无水乙醇液体轻滴加在切片组织上，保持lmin，然后用吸水纸在切片边缘吸走无水乙醇，
[0098]6)用移液器将95%乙醇轻滴加在切片组织上，保持lmin，然后用吸水纸在切片边缘吸走95%乙醇，
[0099]7)用移液器将85%乙醇轻滴加在切片组织上，保持lmin，然后用吸水纸在切片边缘吸走85%乙醇，
[0100]8)用移液器将70%乙醇轻滴加在切片组织上，保持lmin，然后用吸水纸在切片边缘吸走70%乙醇，
[0101]9)用移液器将50%乙醇轻滴加在切片组织上，保持lmin，然后用吸水纸在切片边缘吸走50%乙醇，
[0102]10)用移液器将30%乙醇轻滴加在切片组织上，保持lmin，然后用吸水纸在切片边缘吸走30%乙醇，
[0103]11)用移液器将无菌水轻滴加在切片组织上，保持lmin，然后用吸水纸在切片边缘吸走无菌水；
[0104]9、封片和观察
[0105]在切片组织上滴加甘油I滴，盖上盖玻片，在可见光下观察明场下的组织结构，在蓝光激发下观察暗场下的特殊组织结构(见图1)。
[0106]在明场下观察，发现体壁完整，体腔内部的肌肉组织、神经组织等分布其间，尤其是占身体比例非常大的消化道结构清晰完整，甚至一对腹足也空间结构正常(见图1a);在蓝光激发下，能够观察到各器官组织被激发的自发绿色荧光水平(见图lb)。
【权利要求】
1.一种昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)组织固定: 取昆虫虫体浸于组织固定液中，抽真空并保持负压10~30分钟，再于4°C下静置10~14小时； (2)组织脱水: 取组织固定后的虫体，4°C条件下，依次用浓度梯度为50%、60%、70%、90%、100%的乙醇溶液脱水，每个梯度的处理时间至少为I小时； (3)组织透明: 取组织脱水后的虫体，室温下在组织透明剂中浸泡5~9小时； (4)浸蜡、包埋与切片: 取组织透明后的虫体，在65°C的液体石蜡中浸泡7~9小时，凝固定型后切片； (5)展片与粘片: 取切片移至载玻片上，在切片边缘滴加60°C的蒸馏水至切片完全展开，再置于30~37°C条件下10~14小时粘片； (6)脱蜡和组织复水: 取组织透明剂滴加在切片组织上，保持至少20分钟后吸走，重复至少3次，再依次滴加浓度梯度为100%、95%、85%、70%、50%、30%的乙醇溶液和水，每个梯度的处理时间为I~5分钟。
2.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于:所述步骤(1)中的组织固定液为:取IOOmL PBS缓冲液，调节缓冲液pH值至10.5~11.5，加热至65~75。。，加入多聚甲醛至终浓度为4%，待溶解完全后冷却，调节溶液pH值至6.5~7.5，再加入30 μ L吐温-20或吐温X-100，冷却至4°C备用。
3.根据权利要求2所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于:所述的的PBS缓冲液的组成为:NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L, Na2HPO4 IOmmoI/L，KH2PO4 2mmol/L，pH 值为5~7。
4.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于:所述步骤(1)中负压的压力值为-l.0KPa。
5.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于:所述步骤(2)中组织脱水步骤为: 1)4°C条件下，50%乙醇中保持lh， 2)4°C条件下，60%乙醇中保持lh， 3)4°C条件下，70%乙醇中保持lh， 4)4°C条件下，90%乙醇中保持lh， 5)4°C条件下，无水乙醇中保持lh， 6)4°C条件下，无水乙醇中保持lh， 7)4°C条件下，无水乙醇中保持lh。
6.根据权利要求5所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于:所述步骤(2)中乙醇用量与虫体的体积比为20:1。
7.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于:所述步骤(3)中组织透明步骤为: 1)室温条件下，组织透明剂中浸泡1.5~2小时； 2)室温条件下，组织透明剂中浸泡1.5~2小时； 3)室温条件下，组织透明剂中浸泡2~3小时。
8.根据权利要求7所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于:所述的组织透明剂为Histo—Clear。
9.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于:所述步骤(4)中浸蜡步骤为: 1)浸入液体石蜡，65°C浸泡2小时， 2)浸入液体石蜡，65°C浸泡2小时， 3)浸入液体石蜡，65°C浸泡2小时， 4)浸入液体石蜡，65°C浸泡2小时。
10.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于:所述步骤(6)中脱蜡和组织复水步骤为: 1)将组织透明剂滴加在切片组织上，保持20min后吸走， 2)将组织透明剂滴加在切片组织上，保持20min后吸走， 3)将组织透明剂滴加在切片组织上，保持20min后吸走，` 4)将无水乙醇滴加在切片组织上，保持Imin后吸走， 5)将无水乙醇滴加在切片组织上，保持Imin后吸走， 6)将95%乙醇滴加在切片组织上，保持Imin后吸走， 7)将85%乙醇滴加在切片组织上，保持Imin后吸走， 8)将70%乙醇滴加在切片组织上，保持Imin后吸走， 9)将50%乙醇滴加在切片组织上，保持Imin后吸走， 10)将30%乙醇滴加在切片组织上，保持Imin后吸走， 11)将无菌水滴加在切片组织上，保持Imin后吸走。
【文档编号】G01N1/30GK103759994SQ201410001003
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】李永丽, 周洲, 源春彦, 李红英, 刘圣明 申请人:河南科技大学