前列腺癌和sar-cov的人血清生物标记物的利记博彩app
【专利摘要】抗-碳水化合物的抗体可通过以下方法检测：(a)使固定在基质上的低聚甘露糖-血清白蛋白缀合物的阵列与含有抗体的血清样品接触，接触条件为其中TM10抗体以至少微摩尔的亲和力结合所述缀合物的低聚甘露糖的条件；和(b)检测因而发生的所述样品的特定抗体与所述缀合物的低聚甘露糖的结合，作为所述抗碳水化合物的抗体的指示。
【专利说明】則列腺癌和SAR-COV的人血清生物标记物
[0001] 本发明是在国立卫生研究院授予的基金No. 7U01CA128416-04的政府支持下完成 的。政府对本发明享有某些权利。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求于2012年4月24日提交的美国申请No. 61/637,674和于2013年2 月1日提交的美国申请No. 61/759, 745的优先权，所述申请的公开内容以引用的形式全文 纳入本文。
【背景技术】
[0004] 前列腺癌（PCa)是男性中最常见的非上皮性恶性肿瘤。根据尸检研究，大量美国 男性在他们30多岁的时候已经在他们的前列腺中患有癌症；该频率在男性70多岁的时候 上升到约80%。尽管PCa有如此高的发病率，但在美国只有8%的男性在他们的一生中表 现出影响他们生活质量的临床重大疾病[Stamey et al. 1993]，并且在美国所有男性中只 有3%死于PCa[Ries 1994]。没有其他人类癌症在非常高的恶性肿瘤的微观发病率和相对 较低的死亡率之间具有如此巨大的差异。例如，乳腺癌--主要的女性恶性肿瘤--在5 年内具有 15%的死亡率[DeSantis et al. 2011a ;DeSantis et al. 2011b]，同时，肺癌- 总体上第三大常见的恶性肿瘤--在5年内具有超过86%的死亡率[Bach et al. 2004]。
[0005] PCa的高发生率和相对较低的死亡率之间的这种显著差异已经促使本发明人提出 以下疑问：1)是否存在实质上降低PCa的死亡率的宿主监视机制；2)是否能建立新的测 定方法来检测PCa的高风险、高死亡率的状态以使得可以给予这些受试者有效的治疗以降 低该疾病的死亡率；和3)是否存在在侵袭性癌症（aPCa)和其他临床无痛、非侵袭性癌症 (iPCa)之间差异性表达的关键免疫学靶标。这类免疫原性要素的鉴定对于建立治疗和诊断 策略来改善PCa患者的当前健康护理是重要的。
[0006] 本发明人的小组已经研究了 PCa的潜在免疫原性碳水化合物部分。通过对凝集 素结合到组织微阵列上的模式进行评估，本发明人观察到PCa中很多聚糖标志物的异常表 达[Wang et al. 2011]。这些标志物是N-聚糖的前体、核心和内部序列，例如低聚甘露糖、 三触角 Π 型（Gal β 1 - 4GlcNAc)链（Tri-II)或多价 II 型链（m-II) [Wang 2012]。这些 标志物的常见免疫学特征在于它们通常被其它糖部分遮盖，并且它们属于一类通常"隐性 的（cryptic) "的糖表位。重要的是，它们的组织表达或曝光量在PCa的不同Gleason分级 和肿瘤转移中看起来明显不同[Lange et al.2012;Wang et al.2011]。这具有潜在的临 床意义，因为Gleason分级是确定性手术治疗或放射治疗后PCa的复发的最有效预测指标 (predictor)〇
[0007] 随后，本发明人在动物模型研究中发现基于肿瘤细胞的疫苗诱发了抗Man9-簇的 抗体[Newsom-Davis et al. 2009]。在这种情况下，Fas-配体转染的黑素瘤细胞被用于动 物免疫接种。通过该免疫接种策略建立的单克隆抗体（mAb)TMlO在流式细胞术分析中显示 了独特的结合性质。TMlO不与未转化的正常细胞的细胞表面结合但是强烈地结合许多小鼠 和人肿瘤细胞系（包括来自黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌的那些）。有趣的是，本发明 人的碳水化合物微阵列分析显示TMlO识别由（Man9) η-匙孔血蓝蛋白（KLH)和[(Man9) 4] n-KLH所呈递的寡甘露糖基表位[Newsom-Davis et al.2009]。最初构建了这些糖缀合物 以显示由mAb 2G12识别的HIV-I中和表位[Ni et al. 2006]，但是在该研究中发现它们呈 递所述肿瘤相关的TMlO-抗原。
[0008] 通过使用碳水化合物微阵列，本发明人还研究了人免疫系统是否也识别这些肿瘤 碳水化合物并引起（mount)抗体应答。本发明人分析了一组来自带有PCa的男性的血清（N =17)，与来自带有良性前列腺增生（BPH)的男性的血清（N= 12)相比较。发现所述两个 TMlO-阳性的Man9-缀合物可高度有效地捕获来自这两个组的人血清IgG抗体。但是，在癌 症组中捕获的抗体的水平显著高于在BPH组中检测的那些[Wang2012]。
[0009] 总的来说，这些发现表明所述肿瘤相关的TMlO抗原在体内具有免疫原性。这些靶 标的异常表达或暴露可以在癌症受试者中引发特异的自身抗体反应。本发明人使用根治性 前列腺切除术样本和血清的斯坦福同龄组（cohort)将本发明人的调查扩展至更大规模的 血清学研究。如下面所总结的，本发明人建立了 ELISA以便能够高度特异性检测人血清中 的抗Man9-簇的抗体（包括IgGsian9和Msfan9)。本发明人还证实抗Man9-簇的抗体广泛存在 于人体循环中，并且证实这些自身抗体的水平在其癌症含有大体积的Gleason分级4和/ 或5的男性中显著地增加。
[0010] 相关技术：
[0011] 本发明的方面公开为 Wang et al. 2012, J Proteomics&Bioinformatics (5:090-0 95，D0I:10.4172/jpb. 1000218)和 Wang et al. 2013,Drug Development Research[14(2): 65-80, DOI: 10. 1002/ddr. 21063]。斯坦福专利 US7, 981，625。
【发明内容】
[0012] 本发明提供了用于检测抗碳水化合物的抗体的材料、系统和方法。在一个方面，所 述方法包括以下步骤：(a)使在基质上的低聚甘露糖-血清白蛋白缀合物的阵列与含抗体 的血清样品接触，基础条件为其中TMlO抗体以至少微摩尔的亲和力结合所述缀合物的低 聚甘露糖的条件；和（b)检测由此产生的所述样品的特定抗体与所述缀合物的低聚甘露糖 的结合，作为所述抗碳水化合物的抗体的指示。在另一方面，所述组合物为包含有序的、固 定的低聚甘露糖-血清白蛋白缀合物的阵列的微阵列、微孔板（microwell plate)或相关 基质，其中所述缀合物的低聚甘露糖以至少微摩尔的亲和力结合TMlO抗体。
[0013] 在另一方面，本发明提供了用于通过检测抗碳水化合物的抗体如IgMan9和PSA来协 同预测前列腺增生，特别是前列腺癌的临床结果的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使低 聚甘露糖和前列腺特异性抗原
[0014] (PSA)与患者样品中的抗体接触，接触条件为其中所述抗体特异性结合所述抗原 的条件；和（b)检测由此产生的所述抗体与所述抗原的特异性结合，其中所述抗体的特异 性结合可协同预测前列腺增生的临床结果。
[0015] 本发明包括具体的实施方案，及其所有的结合，其中：
[0016] -所述血清白蛋白是HAS或BSA ;
[0017] -所述低聚甘露糖是man5或man9 ;
[0018] -所述缀合物具有结构（Man9GlcNAc2Asn) n-BSA 或（Man5GlcNAc2Asn) n-BSA ;
[0019] -所述阵列包含固定在所述基质的不同位置上的man5_和man9_血清白蛋白缀合 物；
[0020] -所述阵列还包含固定在所述基质的不同位置上的ASOR、AGOR和/或OR
[0021] -所述方法从人血清抗体的未经筛选的库（unselected repertoire)中选择性检 测TMlO样抗Man9簇。
[0022] -所述样品来自患有前列腺发育异常的人并且所产生的结合的量指示前列腺增生 的状态，如其中所述前列腺发育异常是侵袭性前列腺癌。
[0023] -所述基质是环氧树脂包被的载玻片且所述阵列是微阵列。
[0024] -所述基质是疏水性聚苯乙烯表面包被的塑料微孔板（microplate)(例如NUNC Polysorp)；
[0025] -所述缀合物是通过以下方式来固定：用溶于pH9. 6的0. IM碳酸氢钠缓冲液溶液 中的20 μ g/ml的Man9-BSA包被表面（例如，聚苯乙烯微孔板）并在37°C下孵育2小时；
[0026] -所述接触步骤包括用以1:500的稀释度溶于1 % BSA、PBST中的所述血清样品包 被所述缀合物并在4°C下孵育8-12小时。
[0027] 例如，在具体实施方案的一种组合中：所述基质是疏水性聚苯乙烯表面包被的塑 料微孔板；所述缀合物是通过以下方式来固定：用溶于PH9. 6的0. IM碳酸氢钠缓冲液溶液 的20 μ g/ml的Man9-BSA包被表面并在37°C下孵育2小时；并且所述接触步骤包括用以 1:500稀释度溶于1 % BSA、PBST中的所述血清样品包被所述缀合物并在4°C下孵育8-12小 时。
[0028] 本发明具体提供了所列举方面的所有组合，就如已努力将每一个组合单独提出。
【具体实施方式】
[0029] 本发明提供了从人血清抗体的大库中选择性检测TMlO样抗Man9簇，与用于检测 人血清中的抗碳水化合物的抗体的现有技术方法相比，该检测具有显著提高的信号/背景 t匕。本发明的方面包括：1)用于在前列腺癌中检测自身抗体的AS0R、AG0R和OR组（panel); 2) 用于检测侵袭性 PCa 的 Man9-BSA (例如（Man9GlcNAc2Asn)n-BSA)和 Man5-BSA 组探针； 3) 用于检测TMlO和TMlO-样抗体的微阵列；和4)用于检测正常、BPH和PCa，且特别是侵 袭性PCa中的TMlO-样人血清自身抗体的ELISA方案。
[0030] 除非另有说明，本公开内容不限于特定的过程、材料等，因为这些可以变化。本文 使用的术语仅是为了描述具体实施方案，并且不意欲进行限制。除非上下文中另有明确说 明，单数形式" 一"、"一个"和"所述"包括复数指代对象。
[0031] 本发明涵盖所记载的具体和优选实施方案的所有组合。应理解，本文所述的实施 例和实施方案仅仅是为了说明的目的，根据其的各种修改和变化将被建议给本领域技术人 员，并且它们将被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。本文引用的 所有出版物、专利和专利申请，包括其中的引用文献，都为了所有目的以引用的形式全文纳 入本文。
[0032] 实施例
[0033] 实施例1.作为侵袭性前列腺癌的潜在血清生物标志物的抗低聚甘露糖的抗体 [0034] 本研究将碳水化合物微阵列发现与作为侵袭性前列腺癌（PCa)的新血清生物标 志物的抗低聚甘露糖的抗体的大规模血清学验证联系在一起。在实验上，建立了 Man9-簇 特异性的ELISA以实现在人血清中灵敏检测Man9抗体。使用该测定法对血清存储（bank) 在斯坦福大学的患有PCa或良性前列腺增生（BPH)的男性的较大同龄组进行了表征。受 试者包括患有100%的Gleason分级3癌症的患者（N = 84)、患有Gleason分级4和/或 5癌症的患者（N = 204)和BPH对照（N = 135)。根治性前列腺切除术Gleason分级和生 化（PSA)复发作为用于血清生物标记物评估的关键参数。发现IgG sfan9和IgMsian9广泛存在 于患有BPH的男性、以及患有癌症的男性的血清中。但是，这些抗体的反应性在具有最大体 积的高分级癌症的受试者中显著增加。检测血清IgG sfan9和IgMsian9显著预测了根除性前列 腺切除术后PCa的临床结果。考虑到这些结果，本发明人公开了 IgGsian9和IgMsian9是用于检 测PCa的侵袭性进展的新的血清生物标志物，并且低聚甘露糖基抗原使用用于PCa亚分型 (sub-typing)和祀向免疫治疗的有用革巴标。
[0035] 材料与方法
[0036] 根治性前列腺切除术样本和血清的斯坦福同龄组。该同龄组包括已知其癌症全 部由Gleason分级3 (Gr3)组成的男性（N = 84)、其癌症含有L 0-100 %的Gleason分 级4和/或5 (Gr4/5)癌症的男性（N = 204)、和被活检确认为PCa阴性的BPH对照（N = 135)。所述BPH同龄组选自已经过两轮系统性前列腺活检以排除存在癌症的男性。所述癌 症同龄组选自这样的男性，即其已在斯坦福进行过根除性前列腺切除术，并且其前列腺被 以每步3-mm的间隔进行切片并被定量表征了 8个形态变量[Stamey et al. 1993 ;Stamey et al. 1999]。BPH、Gr3 和 Gr4/5 的平均年龄分别为 67. 3(47-88)岁、61. 35(37-75)岁和 63. 73(41-80)岁。Gr3的平均随访天数为2437. 63(221-4884)并且Gr4/5的平均随访天数 为2374. 27 (292-6174)，它们都具有定义为生化（PSA)复发的失败。
[0037] 所使用的样本于1984和2006年间存储于斯坦福大学。在根除性前列腺切除术之 前的手术前咨询过程中获得了血液并将其收集在带有二氧化硅凝块活化剂的试管中。离心 后，收集血清并按等份试样储存在_80°C下直至进行分析。在患有BPH的男性为了 BPH症 状到斯坦福泌尿科（Stanford Department of Urology)就诊的过程中获得了他们的血清。 所有的患者都经过了至少两次活检并被确认为癌症阴性。
[0038] 碳水化合物的抗体和抗原。MAb TM10[Newsom_Davis et al. 2009]由 Thomas E Newsom-Davis 博士 惠赠 ，mAb 2G12 由 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program惠赠。生物素化的抗人IgM的抗体、碱性磷酸酶（AP)缀合的抗人IgG和辣根过氧 化物酶（HRP)-链霉亲和素缀合物购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。生物素化的伴刀豆 凝集素 A (Con A)购自 EY Laboratories, Inc. (San Mateo, CA)。
[0039] 表1.碳水化合物抗原和对照试剂
[0040]
【权利要求】
1. 一种用于检测抗-碳水化合物的抗体的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 使固定在基质上的低聚甘露糖-血清白蛋白缀合物的阵列与含抗体的血清样品接 触，接触条件为其中TM10抗体以至少微摩尔的亲和力结合缀合物的低聚甘露糖的条件； (b) 检测因而发生的所述样品的特定抗体与所述缀合物的低聚甘露糖的结合，作为所 述抗碳水化合物的抗体的指示。
2. 权利要求1的方法，其中所述血清白蛋白是HSA或BSA。
3. 权利要求1的方法，其中所述低聚甘露糖是man5或man9。
4. 权利要求1的方法，其中所述缀合物具有结构（Man9GlcNAc2Asn)n-BSA或 (Man5GlcNAc2Asn) n_BSA。
5. 权利要求1的方法，其中所述阵列包含固定在所述基质的不同位置上的man5和 man9-血清白蛋白缀合物
6. 权利要求1的方法，其中所述阵列还包含固定在所述基质的不同位置上的ASOR、 AGOR 或 OR。
7. 权利要求1的方法，所述方法从人血清抗体的未经筛选的库中选择性检测TM10样 抗-Man9簇。
8. 权利要求1的方法，其中所述样品来自患有前列腺发育异常的人并且所产生的结合 的量指示前列腺增生的状态。
9. 权利要求1的方法，其中所述样品其中所述样品来自患有前列腺发育异常的人并且 所产生的结合的量指示前列腺增生的状态，其中所述前列腺发育异常是侵袭性前列腺癌。
10. 权利要求1的方法，其中所述基质是环氧树脂包被的载玻片且所述阵列是微阵列。
11. 权利要求1的方法，其中所述基质是疏水性聚苯乙烯表面包被的塑料微孔板。
12. 权利要求1的方法，其中所述缀合物是通过以下方式固定：用溶于pH9. 6的0. 1M碳 酸氢钠缓冲液溶液中的20 y g/ml的Man9-BSA包被表面并在37°C下孵育2小时。
13. 权利要求1的方法，其中所述接触步骤包括用以1:500的稀释度溶于1 % BSA、PBST 中的血清样品包被所述缀合物并在4°C下孵育8-12小时。
14. 权利要求1的方法，其中： 所述基质是疏水性聚苯乙烯表面包被的塑料微孔板； 所述缀合物是通过以下方式固定：用溶于pf!9. 6的0. 1M碳酸氢钠缓冲液溶液中的 20 y g/ml的Man9-BSA包被表面并在37°C下孵育2小时；和 所述接触步骤包括用以1:500的稀释度溶于1% BSA、PBST中的血清样品包被所述缀 合物并在4°C下孵育8-12小时。
15. -种用于检测抗-碳水化合物的抗体的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 使低聚甘露糖和前列腺特异性抗原（PSA)与患者样品中的抗体接触，接触条件为 其中所述抗体特异性结合所述抗原的条件； (b) 检测由此产生的所述抗体与所述抗原的特异性结合，其中所述抗体的特异性结合 可协同预测前列腺增生的临床结果。
【文档编号】G01N33/574GK104428674SQ201380033615
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年4月24日 优先权日:2012年4月24日
【发明者】王德农 申请人:思研（Sri）国际顾问与咨询公司