鉴定杀虫剂抗性的检测系统的利记博彩app
【专利摘要】本文描述了—种快速、简单且高度灵敏的检测系统，其用于鉴定动植物害虫对新烟碱类和吡蚜酮的抗性。进一步的，提供了一种控制昆虫害虫，特别是抗药性害虫的方法。
【专利说明】鉴定杀虫剂抗性的检测系统 发明领域
[0001] 本发明涉及一种容易地鉴定在昆虫中对杀虫剂的抗性的检测试剂盒。所述试剂盒 特别适合于在田间检测抗性，因为它允许用包含一些昆虫的样本量快速简单地鉴定抗性标 记物。另外，本发明涉及用于对某些杀虫剂有抗性的昆虫中抗性治理的方法。所述方法和 所述试剂盒特别适用于棉粉虱，烟草粉虱（Bemisa tabaci)(半翅目：粉虱科）。
【背景技术】
[0002] 已知棉粉虱（烟草粉虱）对新烟碱类杀虫剂吡虫啉的抗性与细胞色素P450单 加氧酶 CYP6CM1 的高水平表达相关（Insect Biochemistry and Molecular Biology 38， (2008),634-644)。
[0003] 问题
[0004] 在农业中一个越来越重要的问题是在多种经济相关的昆虫害虫中对某些广泛使 用的杀虫剂的抗性的发展（PestManag Sci 2009;65:313-322)。对昆虫害虫施用杀虫剂 (所述害虫已经发展了对这些杀虫剂的一定水平的抗性），造成农作物损失并且增加了对 这些害虫种群中额外的抗性累积进一步的选择压力。
[0005] 用于控制粉虱害虫的优选杀虫剂的一种为新烟碱类杀虫剂。新烟碱类杀虫剂包括 以下商品化的活性成分：吡虫啉、噻虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、啶虫咪、烯啶虫胺和呋虫胺。它们 也被杀虫剂抗性行动委员会(IRAC ：www. irac-online. ογη)称为IRAC作用模式类别（MoA 类别）4A。
[0006] 虽然，农民会优先使用新烟碱类化学成分处理粉虱害虫，但他们面对数量正在增 长的已经发展了对抗这些活性成分的至少某种抗性的害虫种群。从不同的化学成分或不同 的IRAC MoA类别完全切换到其他杀虫剂最可能会导致对这些杀虫剂也有抗性的害虫种群 的发展。另外，其他化学成分的杀虫活性会较为逊色。
[0007] 目前害虫对特定杀虫剂的抗性的标准确定需要实验室环境。在田间或温室条件 下，农民将不得不尝试杀虫剂并且然后观察它是否可以控制特定的目的害虫。然而，结果将 得到的太晚，因为耐药虫会已经破坏了至少部分作物。另外，已经需要抗性治理的微弱的抗 性在这些条件下是不可见的。
[0008] 因此会非常有现实意义的是，具有容易使用的系统，农民可以直接在田间操作，其 进一步实现高灵敏性和可靠性，并且其将在几分钟内向他提供结果，这样他可以基于不同 作用模式类别的循环使用实施合适的抗性治理策略，而不受抗性机理的影响。
[0009] 发明详述 [0010] 原理
[0011] 令人惊奇的，细胞色素P450单加氧酶的水平，特别是与容易使用的抗体检测系统 组合的CYP6CM1，允许快速、可靠和非常灵敏地检测昆虫抗性，特别是烟草粉虱对新烟碱类 和吡蚜酮化学成分的抗性。
[0012] 测试试剂盒（也见图1)
[0013] 测试的基础是P450单加氧酶，优选为CYP6CM1的免疫检测，优选地通过ELISA测 定法。P450单加氧酶蛋白质由一种或优选地由两种不同的多克隆抗体（溶液Al和A2)进 行识别。特别优选的为用生物素标记的抗体和另外的用地高辛标记的抗体的组合。在P450 抗原存在下，生物素化抗体将额外地结合链霉亲和素-金溶液（溶液B)并且形成复合物， 其此时通过在测试条上的点样为线状的抗-地高辛抗体来检测。
[0014] 试剂盒通常提供3种溶液（A1、A2和B)、一次性使用均质化小瓶、一次性使用均质 化研棒和密封的测试条。
[0015] 新烟碱类或吡蚜酮抗性的存在可以通常地通过在一个如下面的测试过程所描述 的粉虱测试中处理1-20只粉虱来观察。最适度为大约四只昆虫；多于20只动物将造成信 号淬灭，并因此是不太优选的。
[0016] 粉虱可以收集到水碗内，例如植物托盘（理想的为深色），装有水和1-10滴洗涤 剂（或使用商品化的餐具洗涤剂或与试剂盒一起提供的10% Tween20)。轻拍被感染的植 物使粉虱落入碗内以收集粉虱，其浮在液面上。当浸入碗内时粉虱将粘在均质化研棒的表 面上。
[0017] 通常的检测过程包括将溶液Al和A2(每种包含足够量的相应的生物素或地高辛 标记抗体，在磷酸缓冲溶液和洗涤剂中）各1-2滴加入均质化小瓶（图1，图片1)。接着， 粉虱如以上所述的被从碗中的水面"钓"上去。在其端部粘有1-20只粉虱的研棒插入装有 液体（之前滴入的溶液Al和A2)的均质化小瓶内并且小心的转动使得昆虫均质化（图1， 图片2)。当溶液变成微黄色和混浊时均质化完成。所述溶液可以直接用于下面的步骤而不 会改变最终结果；然而，1-5分钟的孵育时间会增大最终信号。
[0018] 在均质化后，2滴溶液B (包含磷酸盐缓冲液和洗涤剂中的液体链霉亲和素-金） 被加入小瓶中并且通过倒转小瓶3-4次，轻柔的混合得到的溶液（图1，图片3)。再一次， 在下一步骤进行之前等待1-5分钟会增大信号，但是不会改变总体结果。
[0019] 对于抗性检测，全部的溶液从小瓶中倒入测试条的样品腔内（随粉虱试剂盒提供 的测试条是密封的，且必须首先从包装中取出）（图1，图片4)。当液体流动到测试条上后， 出现红色对照线（在壳上标记"C"的位置），最迟出现在5分钟后。仅当此线存在时测试条 才运行正常。
[0020] 如果对照线存在，但是没有另外的测试线（在壳上标记"T"的位置），则测试的烟 草粉虱种群对于新烟碱类或吡蚜酮没有某于CYP6CM1的讨表汰的抗件。
[0021] 如果在"T"处可见清晰的线（图1)，种群是新烟碱类（和吡蚜酮）抗性的，且必须 应用不同作用模式类别的可选的活性成分以控制那些种群。
[0022] 抗性标记物的检测可以通常使用任何抗体或抗体衍生的检测系统来进行。抗体可 以为多克隆抗体或单克隆抗体或多于一种单克隆抗体的组合。可替代地，任何其他的分子 高亲和系统例如适配体可以用于实施本发明。优选地使用多克隆抗体。优选地，多于一种 抗体的组合被用于检测。
[0023] 抗性标记物-抗体复合物的检测可以通常使用任何允许相当简单和快速地产生 信号的抗体检测系统进行，例如地高辛检测系统或生物素-链霉亲和素系统。其他适合的 检测系统基于等离子共振原理。优选地，地高辛和生物素化抗体的组合是优选的。在图3 和4中举例说明了通过基于测试条（横向流动）的ELISA的检测系统的设计。
[0024] 为了示意的目的，在图5中显示了测试条上用于基于ELISA的抗性标记物的检测 的三种不同的设置。优选地抗体-抗性标记物缀合物的检测通过横向流动分析实施。
[0025] 控制害虫的方法
[0026] 本发明的另一实施方案为控制昆虫害虫（优选地为抗性品种）的方法，包括以下 步骤：
[0027] a.获得昆虫害虫的样品，
[0028] b.对选自CYP家族的抗性标记物进行基于抗体的检测,优选地通过ELISA分析
[0029] c.如果检测到了抗性标记物，则从由氨基甲酸酯类、有机磷类、环戊二烯-有机氯 类、拟除虫菊酯类、亚磺酰亚胺类、蚊蝇醚、杀螨隆、苯甲酰脲类、噻嗪酮、METI、特窗酸和特 特拉姆酸、丁烯轻酸内酯、二酰胺类、Pyrifluquinazon组成的表A)中选择杀虫剂。
[0030] d.如果不存在抗性标记物，则从表A)或包括吡虫啉、噻虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、啶 虫脒、烯啶虫胺、和呋虫胺、吡蚜酮的表B)中选择杀虫剂
[0031] 类别氨基甲酸酯类、有机磷类、环戊二烯-有机氯类、拟除虫菊酯类、亚磺酰亚胺 类、蚊蝇醚、杀螨隆、苯甲酰脲类、噻嗪酮、METI、特窗酸和特特拉姆酸、二酰胺类的用于实施 本发明的表A)的优选杀虫剂为：
[0032] 氨基甲酸酯类:棉铃威(II)、涕灭威（12)、噁虫威（13)、丙硫克百威（14)、丁酮 威（15)、丁酮砜威（16)、甲萘威（17)、虫螨威（18)、丁硫克百威（19)、乙硫苯威（110)、仲 丁威（111)、伐虫脒（112)、呋线威（113)、异丙威（114)、灭虫威（115)、灭多虫（116)、速灭 威（117)、杀线威（118)、抗蚜威（119)、残杀威（120)、硫双威（121)、久效威（122)、唑蚜威 (123)、混杀威（124)、XMC (125)、和灭杀威（126)，
[0033] 有机磷类：乙酰甲胺磷(127)、甲基吡啶磷（128)、乙基谷硫磷（129)、甲基谷硫磷 (130)、硫线磷（131)、氯氧磷（132)、毒虫畏（133)、氯甲磷（134)、毒死蜱（135)、甲基毒死蜱 (136)、蝇毒磷（137)、杀螟腈（138)、甲基内吸磷（139)、二嗪农（140)、敌敌畏/DDVP(Ml)、 百治磷（142)、乐果（143)、甲基毒虫畏（144)、乙拌磷（145)、EPN (146)、乙硫磷（147)、丙 线磷（148)、氨磺磷（149)、苯线磷（150)、杀螟硫磷（151)、倍硫磷（152)、噻唑膦（153)、庚 烯磷（154)、Imicyafos (155)、异柳磷（156)、0-(甲氧基氨基硫代磷酰基）水杨酸异丙酯 (157)、异噁唑磷（158)、马拉硫磷（159)、灭蚜磷（160)、甲胺磷（161)、杀扑磷（162)、速灭磷 (163)、久效磷（164)、二溴磷（165)、氧化乐果（166)、亚砜磷（167)、对硫磷（168)、甲基对硫 磷（169)、稻丰散（170)、甲拌磷（171)、伏杀硫磷（172)、亚胺硫磷（173)、磷胺（174)、辛硫 磷（175)、甲基嘧啶磷（176)、丙溴磷（177)、烯虫磷（178)、丙硫磷（179)、吡唑硫磷（180)、 哒嗪硫磷（181)、喹硫磷（182)、治螟磷（183)、丁基嘧啶磷（184)、双硫磷（185)、特丁磷 (186)、杀虫畏（187)、甲基乙拌磷（188)、三唑磷（189)、敌百虫（190)、和蚜灭磷（191);
[0034] 环戊二烯-有机氯类：氯丹(192)和硫丹（193);
[0035] 拟除虫菊酯类：氟丙菊酷(196)、烯丙菊酯（197)、右旋顺式反式烯丙菊酯（198)、 右旋反式烯丙菊酯（199)、联苯菊酯（1100)、生物丙烯菊酯（1101)、生物丙烯菊酯S-环 戊烯基异构体（1102)、灭虫菊（1103)、乙氰菊酯（1104)、氟氯氰菊酯（1105)、β-氟氯菊 酯（1106)、氯氟氰菊酯（1107)、λ-氯氟氰菊酯（1108)、Y-氯氟氰菊酯（1109)、氯氰菊 酯（ΠΙΟ)、α -氯氰菊酯（Illl)、β -氯氰菊酯（1112)、Θ -氯氰菊酯（1113)、f -氯氰 菊酯（1114)、苯氰菊酯[(IR)-反式异构体](1115)、溴氰菊酯（1116)、右旋反式炔戊菊 酯[(EZ)-(IR)异构体](1117)、高氰戊菊酯（1118)、醚菊酯（1119)、甲氰菊酯（1120)、氰 戊菊酯（1121)、氟氰戊菊酯（1122)、氟氯苯菊酯（1123)、τ-氟胺氰菊酯（1124)、苄螨醚 (1125)、炔咪菊酯（1126)、噻嗯菊酯（1127)、苄氯菊酯（1128)、苯醚菊酯[(IR)-反式异 构体](1129)、炔丙菊酯（1130)、除虫菊素（除虫菊）（1131)、苄呋菊酯（1132)、氟硅菊酯 (1133)、七氟菊酯（1134)、胺菊酯（1135)、胺菊酯[(IR)异构体](1136)、四溴菊酯（1137)、 和四氟苯菊酯（1138);或DDT(I139);或甲氧氯（1140);
[0036] 苯甲酰脲类：双三氟虫脲(1191)、定虫隆（1192)、除虫脲（1193)、氟环脲（1194)、 氟虫脲（1195)、氟铃脲（1196)、虱螨脲（1197)、双苯氟脲（1198)、多氟脲（1199)、氟苯脲 (1200)、和杀铃脲（1201);
[0037] METI :喹螨醚(1212)、唑螨酯（1213)、嘧螨醚（1214)、哒螨灵（1215)、吡螨胺 (1216)、和唑虫酰胺（1217)、或鱼藤酮（Derris) (1218);
[0038] 特窗酸和特特柃姆酸：，例如螺螨酯（1221)、螺甲螨酯（1222)、和螺虫乙酯 (1223) ; (25)线粒体复合物II电子传输抑制剂，例如β-酮腈衍生物，如腈吡螨酯（1229) 和丁氟螨酯（1230);
[0039] 二酰胺类：氯虫酰胺(1231)，溴氰虫酰胺（1232)，和氟虫双酰胺（1233);
[0040] 丁烯羟酸内酯类：4-丨「（6_溴吡啶-3-基）甲基](2-氟乙基）氨基}呋 喃 _2(SH) -酮（I258)(从 W〇2〇〇7/ll5644 已知），4-{[(6_ 氟吡啶 _3_ 基）甲基](2， 2- 二氟乙基）氨基}呋喃-2(5H)_ 酮（1259)(从 TO2007/115644 已知），4-{[(2_ 氯-1， 3- 噻唑-5-基）甲基](2-氟乙基）氨基}呋喃-2(5H)_酮（1260)(从W02007/115644 已知），4-{[ (6-氯吡啶-3-基）甲基](2-氟乙基）氨基}呋喃-2 (5H)-酮（1261)(从 W〇2〇〇7/l 15644 已知），Flupyradifurone (I262)，4- {[ (6_ 氯 5_ 氟吡啶 _3_ 基）甲基] (甲基）氨基}呋喃-2(5H)_ 酮（1263)(从W02007/115643 已知），4-{[(5,6_二氯吡 啶-3-基）甲基](2-氟乙基）氨基}呋喃-2(5H)_酮（1264)(从TO2007/115646已 知），4-{[(6_氯-5-氟吡啶-3-基）甲基](环丙基）氨基}呋喃-2(5H)_酮（1265)(从 冊2007/115643已知），4-{[(6-氯吡啶-3-基）甲基](环丙基）氨基}呋喃-2(5!1)-酮 (I 266)(从EP-A-O539588已知），4-{[(6_氯吡啶_3_基）甲基](甲基）氨基}呋 喃-2 (5H)-酮（1267)(从 EP-A-0539588 已知），
[0041] Sulfoxymines ： I Γ?~ (6~ 氯批陡 _3_ 基）乙基](甲基）氧化-λ 4-硫 代（sulfanylidene)}氰胺（1268)(从W02007/149134已知）和其非对映异构体 {[ (IR) -1- (6-氯批陡-3-基）乙基（甲基）氧化-λ 4-硫代}氰胺（A) (1269)，和 {[ (IS) -1-(6-氯批陡-3-基）乙基（甲基）氧化-λ 4-硫代}氰胺⑶（1270)(也从 W02007/149134已知）以及非对映异构体[(R)-甲基（氧化）{(lR)-l-[6-(三氟甲基）吡 陡 _3_ 基]乙基} - λ 4-硫代}氰胺（Al) (1271)，和[(S)-甲基（氧化）{ (IS) -1-[6-(二 氟甲基）吡啶-3-基]乙基}-λ4-硫代}氰胺（A2) (1272)，称为非对映异构体组A(从 W02010/074747, W02010/074751 已知），[(R)-甲基（氧化）{(lS)-l-[6-(三氟甲基）吡 陡_3_基]乙基} - λ 4-硫代}氰胺（BI) (1273)，和[(S)-甲基（氧化）{(IR) -1-[6_(二氟 甲基）批陡-3-基]乙基} - λ 4-硫代}氰胺
[0042] 更优选地，表Α)由螺虫乙酯，螺甲螨酯和fIupyradifurone组成。非常优选地，表 A)由螺虫乙酯和螺甲螨酯组成。
[0043] 优选地，表B)由吡虫啉和吡蚜酮组成。
[0044] 优选的抗性标记物为CYP6CM1。
[0045] 优选的害虫为粉虱属。非常优选的害虫为棉粉虱（烟草粉虱）。
[0046] 本文中通过它们的"通用名称"描述的活性成分是已知的并且描述于，例如， Pesticide Manual ( "The Pesticide Manual，'， 第 14 版，British Crop Protection Council2006)或可以在互联网上搜索至Ij (例如 http: //www. alanwood. net/pesticides)。
[0047] 试剂的制各和纟目成:
[0048] 兔免疫：
[0049] 4只兔使用PBS中的His6-CYP6CM1 (每次注射500 μ g)免疫。
[0050] SPF兔（SPF =无特定病原体；品系：新西兰白兔）的免疫包括：
[0051] ?免疫标准方案（于第0、28、42、56天注射4次），2个对照（在40和54天后）
[0052] ?预先取血的血清（在第一次注射之前）
[0053] ?免疫通过组合佐剂的皮下注射进行（第一次注射CFA，第二次和其他次注射 IFA)
[0054] ?提供血清（1.和2.取血每次3-5mL，在70天每次取血大约20ml，然后每个月对 每只家兔取血大约20ml)
[0055] 抗体的纯化：
[0056] 抗体通过阳性免疫吸附从血清中纯化。为了制备柱基质，按照生产商的说明书，将 抗原MBP-CYP6CM1与NHS活化琼脂糖凝胶4FF偶联（GE Healthcare)。通过结合对CYP6CM1 特异性的抗体部分来进行纯化，其通过将血清泵送通过填充有BMP-CYP6CM1-琼脂糖凝胶 的柱来进行。在采用（1)0. 5MNaCl，0.05 % Tween 20和（2) 30mM NaCl的两次洗涤步骤后， 特异性抗体在酸性条件下用包含IOOmM甘氨酸，〇. 5M NaCl，pH2. 7的缓冲液洗脱。将抗体 对PBS透析并且通过超滤来浓缩。
[0057] 抗体的修饰：
[0058] 通过偶联NHS活化的标记试剂来标记抗体,所述标记试剂与伯氨基（-NH2)有效反 应以形成稳定的酰胺键。抗体在赖氨酸（K)残基的侧链和每个多肽的N端具有多个伯氨基， 其可用作用NHS活化试剂标记的靶。除了这些可用的氨基，一些残基在反应过程中发生随 机的偶联。标记的程度取决于缀合反应过程中使用的摩尔比率。
[0059] 生物素化在pH8. 5的IOOmM磷酸盐缓冲液中采用2-8倍摩尔过量的生物素化试剂 (琥珀酰亚氨6-(生物素酰胺）己酸酯）于25°C进行2小时。反应通过加入IOmM赖氨酸 终止。缀合物通过对PBS透析以从过量的生物素化试剂和副产物中纯化。标记的程度采用 HABA测定法来确定。
[0060] 与地高辛的缀合在pH8. 5的IOOmM磷酸盐缓冲液中采用8倍摩尔过量的标记试剂 (地高辛-3-0-甲基羰基-e-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚氨酯）于25°C进行2小时。反应 通过加入IOmM赖氨酸终止。缀合物通过对PBS透析，从过量的标记试剂和副产物中纯化。
[0061] 均质化缓冲液：
[0062]
【权利要求】
1. 一种控制昆虫害虫的方法，包括如下步骤： a. 获得昆虫害虫的样品， b. 对选自CYP家族的抗性标记物进行基于抗体的检测， C.如果检测到了抗性标记物，则从由氨基甲酸醋类、有机磯类、环戊二帰-有机氯类、 拟除虫菊醋类、亚賴醜亚胺类、蚊禍離、杀峨隆、苯甲醜脈类、喔嗦丽、METI、特窗酸和特特拉 姆酸、了帰轻酸内醋、二醜胺类、Pyrifluquinazon组成的列表A)中选择杀虫剂。 d.如果不存在抗性t不记物，则从列表A)或包括化虫晰、曖虫晰、曖虫胺、曖虫嗦、巧虫 脉、帰巧虫胺、和巧虫胺、化闽丽的列表B)中选择杀虫剂。
2. 权利要求1的方法，其中害虫为粉風属，优选为烟草粉風炬emisia t油aci)种。
3. 权利要求1或2的方法，其中抗性标记物为CYP6CM1。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中表A)由螺虫己醋，螺甲峨醋和 flupyradifurone 组成。
5. 权利要求1-4的任一项的方法，其中表A)由螺虫己醋和螺甲峨醋组成。
6. 确定害虫种对特定杀虫剂的抗性的试剂盒，包括如下组分： a. 增溶溶液， b. 对细胞色素P450单加氧酶特异性的抗体， C.针对步骤b中的抗体的检测系统。 7. CYP6CM1检测在粉風的抗性治理中的用途。
【文档编号】G01N33/573GK104471401SQ201380030199
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年6月5日 优先权日:2012年6月8日
【发明者】R·瑙恩, K·拉明, K·韦尔费尔 申请人:拜耳农作物科学股份公司