牛奶中氟喹诺酮类药物的maldi-tof-ms检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种牛奶中氟喹诺酮类药物的MALDI-TOF-MS检测方法，包括8-羟基喹啉功能化介孔分子筛，得到SBA-15-8羟基喹啉；将牛奶用三氟乙酸稀释，得到样品目标物；将SBA-15-8羟基喹啉分散在乙醇溶液中并进行超声处理，得悬浮液；取悬浮液加入样品目标物，室温下自然干燥后得到MALDI基质薄层；取待测牛奶并置于MALDI基质薄层上，溶剂自然蒸发后进行MALDI-TOF-MS分析，将样品和基质混合点于靶板之上，直接进入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行测定，省去了繁琐的前处理过程，当牛奶中氟喹诺酮类药物残留量超过0.05mg/kg时，可以有效地检测到25种氟喹诺酮类药物残留中的18种，可大大提高检测效率，以适应进出口产品的快验快放要求。
【专利说明】牛奶中氟喹诺酮类药物的MALD1-TOF-MS检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种牛奶中氟喹诺酮类药物的检测方法，具体地说，涉及一种牛奶中氟喹诺酮类药物的MALD1-TOF-MS检测方法，属于食品安全检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]近年来，基质辅助激光吸附电离飞行时间质谱(MALD1-TOF-MS)技术广泛应用于多肽和蛋白质分子量的测定及纯度评价，如牛碳酸酐酶、蜂毒素、牛胰岛素、牛胰岛素B链、短杆菌肽S、肌红蛋白、细胞色素C、胰蛋白酶原等，测定过程十分简便，在国内外的一些实验室MALD1-TOF-MS已成为蛋白质分子量测定的常规方法。在多肽、氨基酸质谱分析方面，大多采用DHB、CHCA作为MALDI基质。
[0003]目前，MALD1-TOF-MS多用于大分子物质的分析，但是实际待测物的组成中经常也包含有小分子物质，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD1-TOF-MS)在分子量小于400u区域内，由于基质本身的电离，使小分子化合物质谱图中存在大量难以解释的杂峰。大量杂峰的存在产生了很强的质量歧视效应，使那些不易电离的小分子化合物很难解吸电离出分子离子。
[0004]氟喹诺酮类药物残留通常采用酶联免疫吸附法或液质联用法检测，以上检测方法的前处理过程是整个氟喹诺酮类药物残留检测过程中最耗时耗力、最繁琐的一个环节，同时又是对检测结果影响最大的环节。目前，还没有见到采用MALD1-TOF-MS来检测氟喹诺酮类药物残留的研究报道。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的问题是针对以上不足，提供一种牛奶中氟喹诺酮类药物的MALD1-TOF-MS检测方法，可以快速筛选牛奶中残留的氟喹诺酮类药物，采用本发明所述的检测方法，前处理过程简单，检测效率高。
[0006]为解决以上问题，本发明采用的技术方案为:牛奶中氟喹诺酮类药物的MALD1-TOF-MS检测方法，其特征在于:所述检测方法包括以下步骤:
8-羟基喹啉功能化介孔分子筛，得到SBA-15-8羟基喹啉；
制备 MALD1-TOF-MS 样品:
将牛奶用三氟乙酸稀释，得到样品目标物；
将SBA-15-8羟基喹啉分散在乙醇溶液中并进行超声处理，得悬浮液；
取悬浮液加入样品目标物，室温下自然干燥后得到MALDI基质薄层；
取待测牛奶并置于MALDI基质薄层上，溶剂自然蒸发后进行MALD1-TOF-MS分析。
[0007]一种优化方案，所述制备MALD1-TOF-MS样品步骤包括:
取IOyL牛奶以体积比1:100用0.1%的三氟乙酸稀释，得到样品目标物；取Img的SBA-15-8羟基喹啉分散在ImL乙醇溶液中并进行超声处理，时间为3min，得悬浮液；
取I μ L悬浮液加入样品目标物，即用三氟乙酸稀释后的牛奶上，室温放置5-10min，自然干燥后得到MALDI基质薄层；
量取0.5 μ L待测牛奶并置于MALDI基质薄层上，放置5_10min，溶剂自然蒸发后，将基质薄层通过MALD1-TOF-MS进行分析。
[0008]另一种优化方案，所述8-羟基喹啉功能化介孔分子筛步骤包括:
将介孔分子筛SBA-15置于马弗炉中烘烤干燥；
取干燥后的介孔分子筛SBA-15置于混有8羟基喹啉的甲苯溶液中，搅拌，然后将温度在10分钟内升至120°C并保持，再进行过滤，清洗过滤后得到的固体，在真空下干燥，得到SBA-15-8羟基喹啉。
[0009]再一种优化方案，MALD1-TOF-MS分析后得待测牛奶的质谱图，与纯牛奶的质谱图进行对比，判断待测牛奶中是否含有氟奎诺酮药物。
[0010]本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点:将样品和基质混合点于靶板之上，直接进入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行测定，省去了繁琐的前处理过程。当牛奶中氟喹诺酮类药物残留量超过0.05mg/kg时，可以有效地检测到25种氟喹诺酮类药物残留中的18种。利用8-羟基喹啉功能化的介孔分子筛材料SBA-15为基质，建立用MALD1-TOF-MS对牛奶中的25种氟喹诺酮类药物进行快速筛选的方法，可大大提高检测效率，以适应进出口产品的快验快放要求。
[0011]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]附图1为本发明实施例中以CHCA为基质添加浓度为200mg/kg的麻保沙星的MALDI质谱图；
附图2为本发明实施例中以DHB为基质添加浓度为200mg/kg的麻保沙星的MALDI质谱图；
附图3为本发明实施例中以CHCA为基质添加喹诺酮类药物后的MALD1-TOF-MS质谱
图；
附图4为本发明实施例中以SBA-15为基质添加喹诺酮类药物后的MALD1-TOF-MS质谱
图；
附图5为本发明实施例中以SBA-15-8QSi为基质添加喹诺酮类药物后的MALD1-TOF-MS质谱图；
附图6为本发明实施例中添加浓度为0.5mg/kg麻保沙星的牛奶样品的MALD1-TOF-MS质谱图；
附图7为本发明实施例中添加浓度为0.05mg/kg麻保沙星的牛奶样品的MALD1-TOF-MS质谱图；
附图8为附图7的局部放大图；
附图9为本发明实施例中添加浓度为0.01mg/kg麻保沙星的牛奶样品的MALD1-TOF-MS质谱图；
附图10为本发明实施例中以SBA-15-8QSi为基质牛奶中25种氟喹诺酮类兽药残留的MALDI质谱图。【具体实施方式】
[0013]以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0014]实施例，牛奶中氟喹诺酮类药物的MALD1-TOF-MS检测方法，包括以下步骤:
制备8-羟基喹啉功能化介孔分子筛步骤:
将介孔分子筛SBA-15置于550°C的马弗炉中烘烤2小时，加热的目的是为了脱除模板
剂；
称取1.0g介孔分子筛SBA-15，置于混有8羟基喹啉的IOmL甲苯溶液中，8QSi的含量为0.32g，在80°C下搅拌24h，然后将温度在10分钟内升至120°C并保持24h，再进行过滤，将过滤后得到的固体依次用甲苯、丙酮、甲醇以及二氯甲烷清洗，在真空下干燥，得到SBA-15-8QSi,即 SBA-15-8 羟基喹啉。
[0015]制备MALD1-TOF-MS 样品步骤:
取IOyL牛奶以体积比1:100用0.1%的三氟乙酸稀释，得到样品目标物；取Img的SBA-15-8羟基喹啉分散在ImL乙醇溶液中并进行超声处理，时间为3min，得悬浮液；
取I μ L悬浮液加入样品目标物，即用三氟乙酸稀释后的牛奶上，室温放置5-10min，自然干燥后得到MALDI基质薄层；
量取0.5 μ L待测牛奶并置于MALDI基质薄层上，放置5_10min，溶剂自然蒸发后，将含待测牛奶样品的基质薄层通过MALD1-TOF-MS进行分析；
按照MALD1-TOF-MS的操作规程进行，得待测牛奶的质谱图，与纯牛奶的质谱图进行对t匕，判断待测牛奶中是否含有氟奎诺酮药物。
[0016]试验
1、纯牛奶样品的MALD1-TOF-MS质谱牛奶样品的MALDI质谱图比对蛋白质谱图数据库可知,300-600分子量区间的主要物质是一些多肽分子的碎片，而分子量为m/z8002.9的物质可能为蛋白胨P.P.81,而分子离子峰在m/zll553.8和11813.8的物质可能分别为Y 3和Y 2酪蛋白。在乳清蛋白的分子离子峰区域，一般是m/zl4000到m/zl9000之间,有一个明显的特征峰，m/zl4154.1,它代表了乳白蛋白。从牛奶样品的全谱图(m/z300_30000)来看，未发现与本研究中25种氟喹诺酮类药物有相吻合的分子离子峰出现，而在m/z5000-30000的区间可以观测到牛奶中蛋白胨、酪蛋白、乳清蛋白以及酪蛋白的特征分子离子峰，纯牛奶样品对试验样品没有影响。
[0017]2、DHB和CHCA作为基质添加喹诺酮类药物后的MALD1-TOF-MS质谱分析试验:本试验对比DHB和CHCA对于牛奶中喹诺酮类药物分析的影响。
[0018]分别以DHB和CHCA为基质，向牛奶样品中添加浓度为200mg/kg的麻保沙星(m/z362.35)，得到MALDI质谱图，其中图1所示以CHCA为基质，图2所示以DHB为基质。
[0019]CHCA基质下出峰情况与DHB基质下相差不大，但是CHCA基质下背景干扰却小了很多。对比未添加麻保沙星的牛奶的MALDI图谱可知，在m/z300-600的区间内，出现了m/z361.9的分子离子峰，与麻保沙星m/z362.35的分子量相吻合。试验结果表明浓度为200mg/kg的麻保沙星牛奶溶液可以使用MALD1-TOF-MS简单快捷的检测出来，同时，麻保沙星并未与牛奶中的蛋白或氨基酸产生特异性相互作用。
[0020]3、以SBA-15、SBA-15-8QSi以及CHCA为基质添加喹诺酮类药物后的MALD1-TOF-MS质谱分析以SBA-15，SBA-15-8QSi以及CHCA为基质，将基质点在靶板上，自然干燥后上机检测，得到在MALD1-TOF-MS下的质谱图，得到不同基质下的MALDI质谱图，图3所示以CHCA为基质，图4所示以SBA-15为基质，图5所示以SBA-15-8QSi为基质，虽然以CHCA为基质时存在较多的离子峰，例如m/zl89和172，这些可能是出自于CHCA本身。
[0021]与CHCA相比，SBA-15, SBA_15_8QSi基本上很少有背景峰出现。这就说明采用介孔分子筛材料作为基质可以很大程度的削弱背景干扰，有利于提高检测灵敏度。
[0022]与SBA-15相比，SBA_15_8QSi介孔分子筛材料具有更强的解吸/离子化强度，如图4、图5所示。图5与图4相比，分子离子峰具有更高的信号强度。这可能是因为在介孔表面吸附8QSi基团之后更容易吸收能量。
[0023]4、以SBA-15_8QSi为基质研究牛奶中氟喹诺酮的MALDI质谱分析
4.1灵敏度测试
为了验证以SBA-15-8QSi为基质的牛奶中氟喹诺酮的MALDI质谱检测的灵敏度，试验设计了一个浓度梯度，分别按照添加量为100mg/kg、50mg/kg、10mg/kg、5mg/kg、0.5mg/kg、
0.05mg/kg及0.01mg/kg的麻保沙星加入牛奶，并以SBA_15_8QSi为基质，使用337_nm氮激光器轰击，用MALD1-TOF-MS检测其检测限。添加量大于0.5mg/kg产生的MALD1-TOF-MS质谱图类似，不再——明示，0.5mg/kg以下浓度的MALD1-TOF-MS质谱图如图6_8所示。
[0024]图6为添加浓度为0.5mg/kg麻保沙星的牛奶样品的MALD1-TOF-MS质谱图，可以清晰的看到m/z 362.17的特征分子离子峰。
[0025]图7添加浓度为0.05mg/kg麻保沙星的牛奶样品的MALD1-TOF-MS质谱图，m/z362.2的特征分子离子峰出现明显的降低，需放大判定，附图8是m/z363-372部分的放大。
[0026]图9添加浓度为0.01mg/kg麻保沙星的牛奶样品的MALD1-TOF-MS质谱图(m/Z353-373)已无法检测到m/z362.2的特征分子离子峰。也就是说用MALD1-TOF-MS可以检测到牛奶中0.05mg/kg的麻保沙星。
[0027]4.2特异性测试
由图7可看出，m/z 362.4069，与麻保沙星m/z 362.35最接近，但在其附近出现两个峰，m/z 362.2363和m/z 362.6433，说明在麻保沙星添加浓度为0.05mg/kg时，存在干扰，会出现一定的假阳性。
[0028]4.3以SBA-15-8QSi为基质研究牛奶中25种氟喹诺酮类兽药残留的MALDI质谱同时添加浓度为0.05mg/kg的25种氟奎诺酮药物，并以SBA-15-8QSi为基质，使用337nm氮激光器轰击，用MALD1-TOF-MS检测的谱图见图10。
[0029]各化合物的分子离子峰如下:环丙沙星m/z 331.35、丹诺沙星m/z 453.5、恩诺沙星m/z 359.40、沙拉沙星m/z 385.36、诺氟沙星m/z 409.41、二氟沙星m/z 435.86、麻保沙星m/z 362.35、恶喹酸m/z 261.23、萘啶酸m/z 232.24、培氟沙星m/z 429.47、司帕沙星m/z 392.41、奥比沙星m/z 395.38、氟罗沙星m/z 369.34、洛美沙星m/z 387.81、氟甲喹m/z 261.25、依诺沙星m/z 320.32、加替沙星m/z 375.40、帕珠沙星m/z 318.29、莫西沙星m/z 401.43、那氟沙星m/z 360.38、达氟沙星m/z 357.38、左氧氟沙星m/z 370.38、吡哌酸m/z 303.33、妥舒沙星m/z 576.54、巴洛沙星m/z 389.42。其中可以对应找到有萘啶酸m/z 232.24、吡哌酸m/z 303.33、依诺沙星m/z 320.32、环丙沙星m/z 331.35、达氟沙星m/z357.38、恩诺沙星m/z 359.40、麻保沙星m/z 362.35、左氧氟沙星m/z 370.38、加替沙星m/Z 375.40、沙拉沙星m/z 385.36、洛美沙星m/z 387.81、司帕沙星m/z 392.41、莫西沙星m/z 401.43、诺氟沙星m/z 409.41、培氟沙星m/z 429.47、二氟沙星m/z 435.86、丹诺沙星m/z 453.5、妥舒沙星 m/z 576.54 共 18 种。
[0030]4.4重复性测定
本试验进行了日内和日间重复性的测定。
[0031]日内重复性测定:按照试验4.3中检出阳性的18种氟喹诺酮类药物牛奶样品，分别取其浓度为100mg/kg,50mg/kg,0.05mg/kg的同种牛奶样品,在同日内不同时间，用同一台MALD1-TOF-MS 6次重复测定高、中、低3种药物浓度的样品，求得日内(批内)重复性。每次测定在各自的m/z附近出现一个最高的分子离子峰，且每种药物每次测定的m/z差值在
0.1-0.5之间。个别药物在各自的m/z附近出现两个相近的分子离子峰，可判断为有假阳性存在。
[0032]日间精密度测定:取浓度为100mg/kg，50mg/kg, 0.05mg/kg的2.4.3中检出阳性的18种氟喹诺酮类药物，在一周内不同三日内，分别添加到三种不同品牌牛奶中，用同一台MALD1-TOF-MS 6次重复测定高、中、低3种药物浓度的牛奶样品，求得日间(批间)重复性。每次测定在各自的m/z附近出现一个最高的分子离子峰，且每种药物每次测定的m/z差值在0.1-0.5之间。个别药物在各自的m/z附近出现两个相近的分子离子峰，可判断为有假阳性存在。而不同品牌的牛奶对结果影响不大。
[0033]通过重复性试验用MALD1-TOF-MS检测4.3中18种氟喹诺酮类药物，全部检出，无假阴性现象。
[0034]结论
本试验成功的应用MALD1-TOF-MS检测到了牛奶中添加的浓度为0.05mg/kg麻保沙星、依诺沙星等18种氟喹诺酮类化合物，这18种药物基本涵盖了临床上常用的氟喹诺酮类药物，而筛选浓度基本符合不同进口国对牛奶中喹诺酮类药物最高残留限量标准的规定。该方法在低限附近虽然有一定的假阳性，但做为一种快速筛选方法来分析牛奶中氟喹诺酮类药物残留，整个分析过程不需要传统的复杂前处理过程，省时省力，可极大的提高分析效率。对于日常检测中极低的检出率，在检出后使用其他方法再进行准确定量，可满足进出口检验检疫快验快放要求。
[0035]环丙沙星(纯度95%)、单诺沙星(纯度94%)、恩诺沙星(纯度99%)、二氟沙星(纯度98.5%)、麻保沙星(纯度98.5%)、恶喹酸(纯度97.5%)、萘啶酸(纯度99.8%)、培氟沙星(纯度99%)、司帕沙星(纯度99%)、奥比沙星(纯度99.8%)、洛美沙星(纯度97.6%)、氟甲喹(纯度98%)、依诺沙星(纯度99%)、达氟沙星(纯度94%)(来自Dr Ehrenstorfer公司),诺氟沙星(纯度98%)、沙拉沙星(纯度97%)、甲磺酸帕珠沙星(纯度75.3%)、左氧氟沙星(纯度98%)、批哌酸(纯度99%)(来自Sigma公司)、莫西沙星(纯度99%)、氟罗沙星(纯度99.1%)、加替沙星(纯度98%)、那氟沙星(纯度92%)、妥舒沙星(纯度98.9%)、巴洛沙星(纯度99.5%)(中国兽药监察所友情提供)；三氟乙酸(TFA)、2、5-二羟基苯甲酸(DHB)和α-氰基_4_羟基肉桂酸(CHCA)(分析纯，Fluka (St.Louis，MO)公司)；甲苯、丙酮、无水乙醇、二氯甲烷(色谱纯，天津科密欧)；甲醇(色谱纯，Fisher) ；8- (3-(三乙氧基)丙氧基)喹啉(8QSi)、介孔分子筛(长春应用化学研究所友情赞助)；纯牛奶(伊利、蒙牛、光明品牌，乐购超市)。水(二级水，实验室自制)。[0036]仪器与设备
AXIMA-T0F2型MALD1-T0F质谱仪:日本岛津公司产品，氮激光器，波长337nm，采用离子延时引出及反射工作方式。
[0037]除非特别说明，涉及到的百分比含量均为质量百分比含量。
[0038]最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.牛奶中氟喹诺酮类药物的MALD1-TOF-MS检测方法，其特征在于:所述检测方法包括以下步骤: 8-羟基喹啉功能化介孔分子筛，得到SBA-15-8羟基喹啉； 制备 MALD1-TOF-MS 样品: 将牛奶用三氟乙酸稀释，得到样品目标物； 将SBA-15-8羟基喹啉分散在乙醇溶液中并进行超声处理，得悬浮液； 取悬浮液加入样品目标物，室温下自然干燥后得到MALDI基质薄层； 取待测牛奶并置于MALDI基质薄层上，溶剂自然蒸发后进行MALD1-T0F-MS分析。
2.如权利要求1所述的牛奶中氟喹诺酮类药物的MALD1-T0F-MS检测方法，其特征在于:所述制备MALD1-T0F-MS样品步骤包括: 取10 μ L牛奶以体积比1:100用0.1%的三氟乙酸稀释，得到样品目标物；取Img的SBA-15-8羟基喹啉分散在ImL乙醇溶液中并进行超声处理，时间为3min，得悬浮液； 取IuL悬浮液加入样品目标物，即用三氟乙酸稀释后的牛奶上，室温放置5-10min，自然干燥后得到MALDI基质薄层； 量取0.5 μ L待测牛奶并置于MALDI基质薄层上，放置5_10min，溶剂自然蒸发后，将基质薄层通过MALD1-T0F-MS进行分析。
3.如权利要求1或2所述的牛奶中氟喹诺酮类药物的MALD1-T0F-MS检测方法，其特征在于:所述8-羟基喹啉功能化介孔分子筛步骤包括: 将介孔分子筛SBA-15置于马弗炉中烘烤干燥； 取干燥后的介孔分子筛SBA-15置于混有8羟基喹啉的甲苯溶液中，搅拌，然后将温度在10分钟内升至120°C并保持，再进行过滤，清洗过滤后得到的固体，在真空下干燥，得到SBA-15-8羟基喹啉。
4.如权利要求1所述的牛奶中氟喹诺酮类药物的MALD1-T0F-MS检测方法，其特征在于:MALD1-T0F-MS分析后得待测牛奶的质谱图，与纯牛奶的质谱图进行对比，判断待测牛奶中是否含有氟奎诺酮药物。
【文档编号】G01N30/72GK103743847SQ201310746995
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】张金玲, 李凯, 孙军, 田国宁, 赵晗 申请人:张金玲