一种抗体辅助的凝集素液相悬浮芯片多重检测糖蛋白糖链结构的方法
【专利摘要】本发明属生物【技术领域】，涉及一种抗体辅助的凝集素液相悬浮芯片多重检测糖蛋白糖链结构的方法。本发明通过将凝集素偶联在标记有不同染料的磁珠上，利用Bioplex检测系统对偶联有不同凝集素的磁珠进行识别，可通过在一个反应中加入偶联有不同凝集素的不同编号的磁珠，能同时对同一个蛋白上的不同糖型进行检测，显著提高了糖链结构检测的通量。本发明能够快速地，高通量地，特异地检测糖蛋白上的糖链结构，可进一步应用于临床生物标志物的检测当中，为疾病糖组学研究提供高效的手段。
【专利说明】一种抗体辅助的凝集素液相悬浮芯片多重检测糖蛋白糖链结构的方法
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，涉及一种抗体辅助的凝集素液相悬浮芯片多重检测糖蛋白糖链结构的新方法；具体涉及抗体辅助的凝集素液相悬浮芯片的制备、抗体辅助的凝集素液相芯片对触珠蛋白(Hp)上的糖型进行多重检测；该方法可对糖蛋白上的糖链结构进行多重检测，提高凝集素芯片技术的通量。
【背景技术】
[0002]真核蛋白的糖基化是一种普遍、至关重要但复杂的翻译后修饰；糖基化结构的变化在癌症中一种广泛的标志。一些定位于糖链末端的糖，包括唾液酸化Lewisx (sLex)，唾液酸化Tn (sTn)，Globo H，Lewis y (Ley)以及多聚唾液酸会在许多恶性组织中过表达。尽管糖链具有重要的功能，但是针对糖基化的研究却受阻于因其合成缺乏模板而造成的结构异质性和多样性。为了解析糖链，应运而生了许多分析手段如液相色谱、质谱、毛细管电泳等。然而，质谱无法分辨同分异构体并且在解析数据中也存在困难，并且色谱、质谱等传统的糖链结构解析方法由于样品前处理步骤多，重复性不好，并且通量不低，难以应用于大规模的临床样品中糖链结构的分析中。
[0003]现有技术公开了凝集素芯片技术是一种非常有吸引力的糖链结构解析技术，其能够快速、高通量、大规模地解析糖链结构并筛选糖基化差异；然而，凝集素和糖间的相互作用(解离常数，Kd=IO-7 -1(T3M)很弱，造成凝集素芯片检测的低灵敏度。而将凝集素芯片技术和液相悬浮芯片技术相结合，由于实现了糖链和凝集素在三维环境中的反应，可大大提高凝集素芯片技术的灵敏度。对于从生物样本中纯化的目标糖蛋白进行糖链结构分析时，可采用抗体辅助反应来提高检测的特异性。所述Bioplex悬浮芯片系统因其具有利用100种不同的微球同时检测100种不同的抗原而越来越受到人们的关注；该系统的检测方法是抗体固定在不同的微球上，利用流式细胞仪的两束激光同时对结合在磁球表面的荧光物以及磁球本身的荧光进行检测；所述悬浮芯片检测技术具有获得数据快速，卓越的灵敏度和特异性以及多重分析的优势。为了使凝集素芯片技术可更好的应用于临床样品糖基化检测和糖基化差异筛选，凝集素芯片技术的检测通量亟待提高。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种抗体辅助的凝集素液相悬浮芯片多重检测糖蛋白糖链结构的方法，提高凝集素芯片技术的通量。本发明所述的芯片系统能够快速地、高灵敏度地、高通量地检测分子标志物的糖基化，是分析糖基化差异的有力手段，具有很好的临床应用前景。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
[0006](I)凝集素与标记有不同染料的磁珠进行共价偶联，制备凝集素液相芯片
[0007]采用清洗缓冲液(偶联试剂盒自带)清洗磁珠后，加入活化缓冲液(偶联试剂盒自带)重悬磁珠；向磁珠内加入50 μ g/ μ L EDC和50 μ g/ μ L suIf0-NHS振荡条件下避光室温反应20分钟；用PBS清洗过量的EDC和sulfo-NHS，并重复清洗过程一次；最后，用PBS重悬活化的磁珠；用PBS配置一系列的凝集素与活化后的磁珠4V过夜反应;离心去上清后，加入“Stabil Guard Choice”无蛋白封闭溶液重悬，室温孵育30分钟。离心后，用贮存缓冲液(偶联试剂盒自带)重悬磁珠；
[0008](2)用氨基反应生物素标记试剂盒标记抗体
[0009]将抗体加入到50kDa MWCO离心超滤管超滤，并用清洗溶液清洗(标记试剂盒自带)；将10 μ L DMSO加入到氨基反应生物素(标记试剂盒自带)，吹打使其溶解；向超滤管中加入反应缓冲液(标记试剂盒自带)和氨基反应生物素溶液，于37°C反应10分钟；超滤除去反应液，收集生物素标记的抗体；
[0010](3)抗体辅助凝集素液相悬浮芯片反应
[0011]向孵育缓冲液(l%Triton X-100PBS)中加入触珠蛋白(Hp)和一种(单重检测)或多种磁珠(多重检测),4°C下反应过夜；反应结束后，加入IOOyL清洗缓冲液(l%TritonX-100PBS)清洗磁珠；加入20 μ g/孔未被生物素标记的Ig G，进一步封闭未与触珠蛋白(Hp)结合的凝集素结合位点；室温下孵育30分钟；孵育反应结束后，加入100 μ L清洗缓冲液(l%Triton X-100PBS)清洗磁珠，重复3次；加入溶于100 μ L孵育缓冲液0.3 μ g/mL生物素标记的触珠蛋白(Hp)抗体，室温下反应I小时；重复清洗步骤；再加入100 μ L孵育缓冲液稀释的I μ g/mL链霉素-藻红蛋白室温下振荡反应30分钟；反应结束后，重复清洗步骤；最后，用清洗缓冲液重悬磁珠；
[0012](4)利用Bio-Plex液相悬浮芯片检测系统对信号进行采集
[0013]每个孔检测50个磁珠，并且记录荧光中位值(MFI);对于多重检测，采集数据时，选择多种磁珠编号。
[0014]本发明中，所述抗体辅助凝集素液相芯片方法表现出了高灵敏度，良好的重现性和很宽的线性范围。本发明中，将不同种类的凝集素偶联在不同染料标记的磁珠上，而Bioplex检测系统中的分类激光可识别标记有不同染料的磁珠，因此可通过在一个反应中加入偶联有不同凝集素的不同编号的磁珠，能同时对同一个蛋白上的不同糖型进行检测，进而显著提高了凝集素液相芯片技术的检测通量，并且节省时间、节约人力、物力。所述的基于抗体辅助反应的凝集素悬浮液相芯片多重检测方法，能够快速地、高通量地、高效地检测分子标志物的糖基化，是分析糖基化差异的有力手段，具有很好的临床应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明所述方法的实验流程。
[0016]图2显示了所述抗体辅助的凝集素液相芯片方法检测触珠蛋白(Hp)的检测限和线性范围，其中，
[0017]ARCA120 检测限；
[0018]BRCA120 线性范围；
[0019]C SNA-1 检测限。
[0020]图3显示了抗体辅助的凝集素液相芯片多重检测方法实验结果，其中，
[0021]A对比抗体辅助凝集素液相悬浮芯片的多重检测方法和单重检测方法；[0022]B抗体辅助凝集素液相悬浮芯片多重检测方法的剂量依赖性曲线。
【具体实施方式】
[0023]下面的实例是对本发明提出的基于抗体辅助的凝集素液相悬浮液相芯片多重检测方法对糖链结构进行检测的进一步说明。
[0024]实施例1抗体辅助凝集素液相悬浮芯片的最低检测限和线性范围实验
[0025]用一系列浓度的触珠蛋白(Hp)溶液，与2.5 μ L磁珠4°C过夜孵育，清洗后加入IgG室温封闭；再清洗后，加入生物素化的抗体溶液，室温孵育I小时后，清洗并加入二抗反应液；室温孵育30分钟后，用Bioplex悬浮芯片检测系统对信号进行采集；用与触珠蛋白(Hp)具有相似的糖链结构，但不能为触珠蛋白(Hp)抗体所识别的转铁蛋白(Tf)则作为阴性对照；当净信号大于标准偏差的3倍，并且信号与噪音的比值大于1.5倍时的最小糖蛋白浓度为检测限。结果如图2A、图2B、图2C所示，RCA120对触珠蛋白(Hp)的检测限为500pg/mL，线性范围为500?25，000pg/mL ；SNA-1对触珠蛋白(Hp)的检测限为60pg/mL。
[0026]实施例2抗体辅助凝集素液相悬浮芯片多重检测方法的特异性实验
[0027]向3ng/mL的触珠蛋白(Hp)溶液中，加入各2.5 μ L RCA120和SNA-1偶联的磁珠，4°C过夜孵育，清洗后加入IgG室温封闭；再清洗后，加入生物素化的触珠蛋白(Hp)抗体溶液，室温孵育I小时后，清洗并加入二抗反应液；室温孵育30分钟后，用Bioplex悬浮芯片检测系统对信号进行采集；用与触珠蛋白(Hp)具有相似的糖链结构，但不能为触珠蛋白(Hp)抗体所识别的转铁蛋白(Tf)则作为阴性对照；结果如图3A所示，多重检测方法和单独检测方法的信号强度相一致，表明多重检测方法可以特异性的识别同一蛋白上的不同糖链结构。
[0028]实施例3抗体辅助凝集素液相悬浮芯片多重检测方法的剂量增加性实验
[0029]配置不同浓度的触珠蛋白(Hp)溶液中，向每个样品中加入各2.5μ L RCA120和SNA-1偶联的磁珠，4°C过夜孵育，清洗后加入IgG室温封闭；再清洗后，加入生物素化的触珠蛋白(Hp)抗体溶液，室温孵育I小时后,清洗并加入二抗反应液；室温孵育30分钟后,用Bioplex悬浮芯片检测系统对信号进行采集；用与触珠蛋白(Hp)具有相似的糖链结构，但不能为触珠蛋白(Hp)抗体所识别的转铁蛋白(Tf)则作为阴性对照；结果如图3B所示，多重检测中，凝集素信号随糖蛋白浓度的增加而增加。
【权利要求】
1.一种抗体辅助的凝集素液相悬浮芯片多重检测糖蛋白糖链结构的方法，其特征是，步骤如下: (1)凝集素与标记有不同染料的磁珠共价偶联，制备凝集素液相芯片， 采用清洗缓冲液清洗磁珠后，加入活化缓冲液重悬磁珠；向磁珠内加入50 μ g/ μ L EDC和50 μ g/ μ L SUIfO-NHS振荡条件下避光室温反应20分钟；用PBS清洗过量的EDC和sulfo-NHS，并重复清洗过程一次；最后，用PBS重悬活化的磁珠；用PBS配置一系列的凝集素与活化后的磁珠4°C过夜反应；离心去上清后，加入“Stabil Guard Choice”无蛋白封闭溶液重悬，室温孵育30分钟；离心后，用贮存缓冲液重悬磁珠； (2)用氨基反应生物素标记试剂盒标记抗体 将抗体加入到50kDa MWCO离心超滤管超滤，并用清洗溶液清洗；将10 μ LDMSO加入到氨基反应生物素，吹打使其溶解；向超滤管中加入反应缓冲液和氨基反应生物素溶液，于37°C反应10分钟；超滤除去反应液，收集生物素标记的抗体； (3)抗体辅助凝集素液相悬浮芯片反应 向孵育缓冲液中加入糖蛋白和一种或多种磁珠，4°C反应过夜；反应结束后，加入100 μ L清洗缓冲液清洗磁珠；加入20 μ g/孔未被生物素标记的Ig G，进一步封闭未与触珠蛋白结合的凝集素结合位点；室温下孵育30分钟；孵育反应结束后，加入?οομ L清洗缓冲液清洗磁珠，重复3次；加入溶于100 μ L孵育缓冲液0.3 μ g/mL生物素标记的蛋白抗体，室温下反应I小时；重复清 洗步骤；再加入100 μ L孵育缓冲液稀释的I μ g/mL链霉素-藻红蛋白室温下振荡反应30分钟；反应结束后，重复清洗步骤；最后，用清洗缓冲液重悬磁珠； (4)利用Bio-Plex液相悬浮芯片检测系统对信号进行采集 每个孔检测50个磁珠，并且记录荧光信号中位值MFI ;对于多重检测，采集数据时，选择多种磁珠编号。
2.根据权利要求1所述的抗体辅助凝集素液相悬浮芯片多重检测新方法，其特征是，所述步骤(2 )中，采用氨基反应生物素标记试剂盒对抗体进行生物素标记。
3.根据权利要求1所述的抗体辅助的凝集素液相悬浮芯片多重检测糖蛋白糖链结构的方法，其特征是，所述步骤(3)中，向反应缓冲液稀释的糖蛋白溶液中加入不同染料标记的偶联有不同凝集素的磁珠，进行孵育。
4.根据权利要求1所述的抗体辅助的凝集素液相悬浮芯片多重检测糖蛋白糖链结构的方法，其特征是，所述步骤(3)中的孵育缓冲液为l%Triton X-1OOPBS0
5.根据权利要求1所述的抗体辅助的凝集素液相悬浮芯片多重检测糖蛋白糖链结构的方法，其特征是，所述步骤(3)中的清洗缓冲液为l%Triton X-1OOPBS0
6.根据权利要求1所述的抗体辅助的凝集素液相悬浮芯片多重检测糖蛋白糖链结构的方法，其特征是，所述步骤(4)中利用Bioplex检测系统对凝集素液相芯片中的偶联有不同凝集素的多种磁珠同时进行检测。
【文档编号】G01N33/68GK103645325SQ201310676898
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】汪泓, 李宏, 余红秀, 杨芃原 申请人:复旦大学