一种用于检测冯维勒布兰德因子的试剂及其制备方法和应用的利记博彩app
【专利摘要】一种用于检测冯维勒布兰德因子的试剂，该试剂为应用胶乳增强免疫比浊法的检测试剂，由试剂1、试剂2和冯维勒布兰德因子标准品或标准曲线组成，其中试剂1为抗冯维勒布兰德因子的抗体胶乳试剂，抗冯维勒布兰德因子的抗体胶乳试剂为抗冯维勒布兰德因子与胶乳颗粒结合而成的抗冯维勒布兰德因子的抗体胶乳试剂；试剂2为应用液；冯维勒布兰德因子标准品为含有不同浓度的冯维勒布兰德因子的反应缓冲液；标准曲线为冯维勒布兰德因子在人体内含量的标准曲线。相较现有技术，本发明的目的是提供一种用于检测冯维勒布兰德因子的试剂，以实现快速检测冯维勒布兰德因子，且具有很高的灵敏度和可靠的重复性，并应用在自动化分析仪器上。
【专利说明】—种用于检测冯维勒布兰德因子的试剂及其制备方法和应
用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测【技术领域】，具体涉及一种检测人血清中冯维勒布兰德因子(vffF, von Willebrand Factor)的试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002]冯维勒布兰德因子(vWF，von Willebrand Factor)，又称血管性血友病因子，是由第12号染色体上的vWF基因编码，是一种大分子量的多亚基糖蛋白，由多个220kD的亚基组成。终产物的聚合度不一，分子量最高者可高达20MD。组装完成后储存于血小板的a颗粒、血管内皮的Weibel-Palade小体中；其是存在于血液中的一种多功能多价的大型粘附糖蛋白。vWF因子在止血和血栓形成过程中具有极其重要的生理作用:一方面，调节介导血小板粘附反应，并且通过与血小板上的受体和胶原蛋白的结合来调节血小板在血管内皮上的粘附，主要过程是:血管内皮受损一暴露胶原纤维一VffF因子连接胶原纤维一血小板表面糖蛋白I b受体结合vWF因子从而粘附在受损血管上，本功能主要由大分子量的多聚体完成；另一方面，还可与VIII (FVIII)的载体蛋白(VIII因子)非共价结合，从而保护VIII因子免于遭受包括活化的蛋白C在内的蛋白酶的攻击，防止VIII因子被过早清除，正常的止血过程就不会因VIII因子受酶切而异常。因此，血液中正常的冯维勒布兰德因子是极为关键的，其水平的降低和功能的缺失则会导致血凝功能相关的疾病发生，此类疾病都是由于止血和血栓形成过程异常造成的；其中最常见的是冯维勒布兰德病和血友病，其中因vffF因子所致的血友病为最常见的血友病，国外报道的患病率高达I %?3%。所以，检测血液中冯维勒布兰德因子的含量至关重要，能够提供对于上述疾病诊断和治疗的关键性参考数据。
[0003]此外，随着近年来科研的发展，冯维勒布兰德因子的一些其他功能逐渐被人们所了解。它在血管生成，平滑肌细胞的增殖，癌细胞的扩散，以及免疫过程中都具有一定的调控作用。因此，它在一些心血管疾病，癌症，肝病和免疫疾病中可以被用作生物标记物来加以研究和使用。总之，检测血液中冯维勒布兰德因子的含量不仅在与止血和血栓形成过程有关的疾病，而且在其他很多疾病的诊断和治疗中都有很高的价值。
[0004]现有技术中，检测冯维勒布兰德因子的方法有多种，例如:冯维勒布兰德因子多聚体法是将样品用琼脂胶来分离从而判断多聚体是否正常；酶联免疫法(ELISA)是用包被在塑料板表面的抗体与样品中的抗原结合从而检测冯维勒布兰德因子的含量；胶原蛋白法与酶联免疫法类似，只不过包被在塑料板表面的不是抗体，而是胶原蛋白，此法利用冯维勒布兰德因子和胶原蛋白可以天然高效结合的特点来进行它的检测。其中，酶联免疫法主要用来检测冯维勒布兰德因子的含量，而多聚体法和胶原蛋白法还可在一定程度上检测其活性。
[0005]以上检测方法各具特点，而它们共同的最大的局限是不能应用于实验室自动分析检测仪器如自动血凝仪上，无法进行大量快速且具有高度重复性的检测。多聚体法需手工制备琼脂胶，而整个实验的时间也较长。酶联免疫法和胶原蛋白法由于包被在塑料板表面时效率的不同导致实验的重复性不好。
[0006]胶乳免疫比浊法具有操作简便、快速、检测灵敏度高、特异、定量准确等优点，在临床应用上得到广泛认可。
[0007]早期免疫分析通过观察沉淀物形成，凝集及溶血现象发生来分析，如免疫扩散、免疫电泳、血凝试验、补体结合等。上世纪50年代末60年代初，利用AG-AB复合物形成使浊度改变，再用比浊计来比浊，但因其敏感性差未被接受。至70年代初，开始有自动检测系统，但因其用的是激光为光源，固定波长，灵敏度较低，而且时间一般要2-3小时，很难满足临床需要。70年代未，速率比浊计的出现，使抗原抗体结合的反应在几十秒内出结果，可以说是免疫化学测定的革命性的发展。
[0008]随着标记技术的发展，免疫化学纳入临床化学检验范畴。免疫浊度测定的基本原理是:抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。当反应液中保持抗体过量时，形成的复合物随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物的含量。
[0009]免疫浊度测定法按照仪器设计的不同可以分为两种，即比浊仪测定(turbidimetermeasure)和散射比池仪测定(nephelomitermeasure)。比池仪测定是测量由于反射、吸收或散射引起的入射光衰减，其读数以吸光度A表示。A反映了入射光与透射光的比率。散射比浊仪测定是测量入射光遇到质点(复合物)后呈一定角度散射的光量，该散射光经放大后以散射值表示。
[0010]经典的比浊试验有4个缺点无法克服，即操作繁琐、敏感度低(10?100 Ug /ml)、时间长和难以自动化。根据抗原与抗体能在液体内快速结合的原理，70年代出现了微量免疫沉淀测定法，即胶乳增强免疫透射比浊法(PETIA)和免疫散射浊度测定法。这2种技术皆已常规用于临床体液蛋白的检测，并已创造出了多种自动化仪器。
[0011]一、传统免疫透射比浊法
[0012]当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。这一方法早在1959年Schultre和Schuick等报道应用于血楽;蛋白与其抗体结合后形成复合物，导致浊度的改变，再进行透射比浊测定，一般采用抗体对抗原定量的透射比浊法，称为免疫透射比浊法。其原理是，利用抗原和抗体的特异性结合形成复合物，通过测定复合物形成量的多少对抗原或抗体进行定量的方法。
[0013]由于免疫复合物的形成有时限变化，当抗原抗体相遇后立即结合成小复合物(〈19S)，几分钟到几小时才形成可见的复合物(>19S)。作为快速比浊测定，这种速度太慢，加入聚合剂(或促聚剂)可加速大的免疫复合物形成。目前促聚剂多用聚乙二醇(MW6000 ?8000)，浓度约为 4%。
[0014]浊度测定亦有其弱点。其一是抗原或抗体量大大过剩时易出现可溶性复合物，造成测定误差，测定单克隆蛋白时这种更易出现；其二是应维持反应管中抗体蛋白量始终过剩，这个值要预先测定，使仪器的测定范围在低于生理范围到高于正常范围之间；其三是受血脂的影响，尤其是低稀释度时，脂蛋白的小颗粒可形成浊度，使测定值假性升高。
[0015]二、胶乳增强免疫透射比浊法[0016]在上述比浊法中，少量的小的抗原抗体复合物极难形成浊度，除非放置较长时间；如形成较大的复合物，则抗原和抗体用量也较大，显然不符合微量化的要求。于是发展了现在广泛应用于生化分析仪的胶乳增强免疫透射比浊法(PETIA):以多克隆抗体为基础的改良免疫比浊分析法，利用基因工程方法将抗体与胶乳颗粒结合，当抗原抗体相结合时便形成了抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，增强了反应吸光度，反应液在一定波长处比浊，与同样处理的标准液比较，计算标本中抗原的含量。利用生化分析仪进行比浊测定，整个分析过程只需几分钟，该方法与传统免疫比浊法比较其灵敏度更高。
[0017]在抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。无论在一定量的抗体中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗体，均可发现只有在两者分子比例合适时才出现最强的反应。以沉淀反应为例，若向一排试管中入一定量的抗体，然后依次向各管中加入递增量的相应可溶性抗原，根据所形成的沉淀物及抗原抗体的比例关系可绘制出反应曲线(如图1所示)。从图中可见，曲线的高峰部分是抗原抗体分子比例合适的范围，称为抗原抗体反应的等价带(zone of equivalence)。在此范围内，抗原抗体充分结合，沉淀物形成快而多。其中有一支反应最快，沉淀物形成最多，上清液中几乎无游离抗原或抗体存在，表明抗原与抗体浓度的比例最为合适，称为最适比(optimal ratio)。在等价带前后分别为抗体过剩则无沉淀物形成，这种现象称为带现象(zone phenomenon)。出现在抗体过量时，称为前带(prozone),出现在抗原过剩时,称为后带(postzone)具体见图1o
[0018]但现有技术中，应用胶乳增强免疫透射比浊法来检测冯维勒布兰德因子的试剂盒具有一定缺陷。主要是检测的线性范围较小，给检测过程带来很多不便。
【发明内容】
[0019]针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的之一是提供一种用于检测冯维勒布兰德因子的试剂盒，以实现快速检测冯维勒布兰德因子，且具有很高的灵敏度和可靠的重复性，并且可应用在自动化分析仪器上。
[0020]为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
[0021]一种用于检测冯维勒布兰德因子的试剂，该试剂为应用胶乳增强免疫比浊法的检测试剂，由试剂I和试剂2组成；其中试剂I为抗冯维勒布兰德因子的抗体胶乳试剂，抗冯维勒布兰德因子的抗体胶乳试剂为抗冯维勒布兰德因子与胶乳颗粒结合而成的抗冯维勒布兰德因子的抗体胶乳试剂；试剂2为应用液。
[0022]优选地，该试剂还进一步包括冯维勒布兰德因子标准品或标准曲线；冯维勒布兰德因子标准品为含有不同浓度的冯维勒布兰德因子的反应缓冲液；标准曲线为冯维勒布兰德因子在人体内含量的标准曲线。
[0023]优选地，抗冯维勒布兰德因子的抗体胶乳试剂是通过将抗冯维勒布兰德因子的抗体的氨基与胶乳颗粒的羧基经二步反应后形成共价键而得到；所述二步反应包括:第一步将胶乳颗粒先与结合剂反应，第二步再将胶乳颗粒与抗冯维勒布兰德因子抗体反应。而现有技术中均是采用一步反应则是将胶乳颗粒和结合剂以及抗冯维勒布兰德因子抗体同时在一起反应。
[0024]更优选地，抗冯维勒布兰德因子的抗体胶乳试剂是通过将抗冯维勒布兰德因子的抗体的氨基与胶乳颗粒的羧基经二步反应后形成共价键而得到；首先由将胶乳颗粒的羧基与结合剂在弱酸性下反应成胶乳颗粒-结合剂中间体，再将胶乳颗粒-结合剂中间体在弱碱性下与抗冯维勒布兰德因子抗体氨基反应制得抗冯维勒布兰德因子抗体胶乳试剂。而现有技术中均是采用一步反应则是将胶乳颗粒和结合剂以及抗冯维勒布兰德因子抗体同时在一起反应，该反应难进行且产率低。而本发明提供的二步反应解决了本领域中胶乳颗粒与抗冯维勒布兰德因子抗体难以反应成胶乳抗体颗粒这一难题，且反应产率高，易于操作，而且产物更加稳定均一。
[0025]更优选地，胶乳颗粒选自苯乙烯胶乳颗粒，最佳为经羧基修饰的苯乙烯乳胶颗粒。
[0026]更优选地，胶乳颗粒的粒径为200?lOOOnm。
[0027]更优选地，抗冯维勒布兰德因子的抗体胶乳试剂通过将胶乳颗粒悬浮于活化缓冲液中与结合剂反应后，再转入结合缓冲液中加入抗冯维勒布兰德因子抗体进行二步反应形成共价键而得。
[0028]更优选地，抗冯维勒布兰德因子的抗体胶乳试剂通过将胶乳颗粒悬浮于活化缓冲液中与结合剂反应后，再转入结合缓冲液中加入抗冯维勒布兰德因子抗体进行二步反应，再加入含有封闭剂的灭活液中反应后加入保存缓存液去除未经反应的胶乳颗粒而得。
[0029]更优选地，活化缓冲液选自甘氨酸缓冲液或磷酸缓冲液，最佳为浓度为0.05M的KH2PO4，其pH为4.5。其酸性的pH是为了保证羧基处于羧基配位稳定状态，更有利于二步反应的进行。
[0030]更优选地,结合剂选自浓度为0.1?5%的碳二亚胺,最佳为I %碳二亚胺；用于与胶乳颗粒的羧基形成中间体，进而与抗冯维勒布兰德因子的抗体的氨基进行反应形成共价键。
[0031]更优选地，结合缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷缓冲液或硼酸缓冲液，最佳为0.2M硼酸缓冲液，且pH为8.5 ;其弱碱性的pH是为了保证氨基处于氨基配位稳定状态，将更有利于二步反应的进行。
[0032]更优选地，抗冯维勒布兰德因子抗体选自羊抗、鼠抗或兔抗冯维勒布兰德因子抗体。
[0033]更优选地，封闭剂选自血清白蛋白或卵清蛋白，浓度为0.1%?5%，最佳为1%牛血清白蛋白；封闭剂用于吸附在未结合抗体的胶乳颗粒表面，而降低检测过程中的非特异性反应。
[0034]更优选地，灭活液选自乙醇胺或甘氨酸，浓度为5?20mM，最佳为IOmM甘氨酸；用于中和反应中过量的活性中间体。
[0035]更优选地，保存缓冲液选自甘氨酸缓冲液，硼酸缓冲液或磷酸缓冲液，最佳由浓度为0.1M pH8.0甘氨酸，浓度分别为0.2%叠氮钠、0.2%牛血清白蛋白和0.05%吐温-20组成。
[0036]优选地，应用液按质量百分比由表面活性剂0.05%?0.5 %、防腐剂0.05%?I %、高分子加速剂0.01 %?5 %、和浓度为0.1 %?10 %的氯化钠组成，上述各组分的质量百分比之和为100%。
[0037]更优选地，表面活性剂选自吐温-20或Triton-XlOO，最佳为吐温-20 ;防腐剂选自Proclin300或叠氮钠，最佳为叠氮钠，高分子加速剂选自牛血清白蛋白或卵清蛋白，缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷、磷酸盐或甘氨酸，最佳为三羟甲基氨基甲烷。
[0038]优选地，含有不同浓度的冯维勒布兰德因子的反应缓冲液选自PBS缓冲液、Hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或以上组合物；反应缓冲液优选为PBS缓冲液、Hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或以上组合物。
[0039]更优选地，反应缓冲液的浓度为20?200mM。
[0040]本发明的另一目的是提供一种用于检测冯维勒布兰德因子的试剂的应用，即将上述任一用于检测冯维勒布兰德因子的试剂作为检测试剂用于制备冯维勒布兰德因子检测试剂盒，试剂盒其包括盒体和上述任一检测试剂的试剂瓶。
[0041]优选地，试剂瓶放置与盒体内。
[0042]本发明的另一目的是提供一种用于检测冯维勒布兰德因子的试剂的制备方法，包括以下步骤:
[0043]步骤a)制备抗冯维勒布兰德因子抗体胶乳:将抗冯维勒布兰德因子抗体与胶乳颗粒经二步反应后交联成抗冯维勒布兰德因子抗体胶乳；
[0044]步骤b)制备应用液或稀释液。
[0045]优选地，步骤a)的具体操作如下:将胶乳颗粒用纯净水清洗后悬浮于活化缓冲液中；加入结合剂在温度小于50°C下搅拌反应，从而活化胶乳颗粒；再加入抗冯维勒布兰德因子抗体在结合缓冲液中在温度小于50度下搅拌反应；再悬浮于含有封闭剂的灭活液中反应，经清洗后悬浮于保存缓冲液中，得抗冯维勒布兰德因子抗体胶乳悬液，置于4°C环境放置。
[0046]更优选地，步骤a)中搅拌反应温度优选为室温，最佳为18?25V。
[0047]更优选地，步骤a)中加入结合剂后搅拌反应时间为10?30分钟，最佳为15分钟；
[0048]更优选地，步骤a)中在结合缓冲液中搅拌反应时间为0.5?6小时，优选为I?2小时，最佳为2小时。
[0049]更优选地,步骤a)中悬浮于含有封闭剂的灭活液中反应I?3小时,最佳为I小时。
[0050]优选地，步骤b)制备应用液是将表面活性剂、防腐剂、高分子加速剂、氯化钠和缓冲剂一并完全溶解于水中，制得应用液。
[0051]更优选地，步骤b)的具体操作如下:将缓冲剂用盐酸调节至pH值为8.0,再加入表面活性剂、防腐剂、高分子加速剂和氯化钠。
[0052]更优选地，步骤b)中应用液pH值为7.4?8.0，最佳为8.0 ;表面活性剂所占的质量百分比为0.05 %?0.5 %，最佳为0.05%，防腐剂所占的质量百分比为0.05 %?I %，最佳为0.2 %，高分子加速剂所占的质量百分比为0.0I %?5 %，最佳为0.2 %;氯化钠所占的质量百分比为0.1%?10%，最佳为1%，缓冲剂的质量百分比为10?IOOmM,最佳为50mM。
[0053]优选地，在未提供冯维勒布兰德因子在人体内的标准曲线的前提下，该制备方法还包括步骤c)配制冯维勒布兰德因子标准品。
[0054]更优选地，步骤c)中选用冯维勒布兰德因子标准品，使用试剂2，即应用液，进行系列稀释:S7:40 μ g / ml, S6:20 μ g / ml, S5:10 μ g / ml, S4:5 μ g / ml, S3:2.5 μ g /ml, S2:1 μ g / ml, S1:0.5 μ g / ml, SO:应用液，分装即可。[0055]更优选地，在步骤c)中，冯维勒布兰德因子标准品可选用商品化高纯度冯维勒布兰德因子标准品。
[0056]更优选地，步骤c)中分装可采用0.5ml /瓶分装。
[0057]本发明亦提供了采用该检测冯维勒布兰德因子的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒在生化分析仪上进行检测的具体条件:
[0058]在生化分析仪上设定参数:
[0059]反应温度:37°C ;
[0060]分析方法:2点终点法；
[0061]主波长:570nm,副波长:800nm(可不用)。
[0062]选择多点定标后，由仪器自动完成定标，然后进行常规血浆样本的冯维勒布兰德因子检测，结果经仪器自动换算直接以Ug / ml为单位报告数值。在使用不同的自动检测仪(血凝分析仪或生化分析仪)时，具体参数应根据仪器不同进行相应调整。
[0063]本发明首创的将目前逐渐得到广泛的应用的颗粒增强免疫透射比浊法应用到冯维勒布兰德因子的检测中。上述检测试剂的检测原理为把交联了抗体的胶乳颗粒与被检测血浆样品混合，血浆中含有的多价冯维勒布兰德因子会因与抗体的结合而导致胶乳颗粒的聚集。引起的聚集则会引起样品的浑浊和吸光度的变化，其吸光度与冯维勒布兰德因子的浓度成正比，与同样处理的校准液比较，可由吸光度推算计算样本中冯维勒布兰德因子浓度。本发明采用颗粒增强免疫透射比浊法来检测冯维勒布兰德因子；可以避免传统的酶联免疫法中抗原和抗体的结合反应是在固相条件下(塑料板反应孔)进行的，二者之一被固定而无法自由移动；而实现抗体和胶乳的反应是在液相条件下进行，反应迅速彻底，更加接近自然状态，通过颗粒增强的方式，放大了抗原抗体反应，弥补了普通透射比浊法灵敏度不高的不足，同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点，克服ELISA和RIA方法操作复杂、重复性不好等的缺点，实现人血冯维勒布兰德因子在生化仪上大批量快速检测血冯维勒布兰德因子水平。
[0064]实验结果表明本发明提供的且具有以下几个方面的显著优点:(I)操作简单；(2)灵敏度较高；(3)不易受人为操作和外界因素干扰，检测稳定性和重复性好，能较真实地反映被测物质的含量；(4)能利用生化分析仪进行检测，容易实现自动化，适于临床推广应用；相比较多聚体法、酶联免疫法和胶原蛋白法，本发明可以应用在自动血凝仪上，并且具有操作简便，灵敏度高和重复性好的特点。因此，本发明可用来进行大量和快速的临床体外检测，有很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0065]图1为现有技术中胶乳颗粒免疫增强透射比浊法的反应曲线图。
【具体实施方式】
[0066]下面结合实施例对本发明作进一步详细完整的说明。如无特殊说明，以下实施例中所用试剂或仪器均为市售产品，并按照其说明书操作使用。
[0067]实施例1
[0068]a)试剂I的制备[0069]试剂I为将表面含有羧基基团的胶乳颗粒在结合剂作用下与抗体的氨基基团反应而得抗冯维勒布兰德因子的抗体胶乳试剂；具体制备方法如下:
[0070]配制0.05M KH2P04pH4.5的活化缓冲液，取粒径为500nm的羧基修饰的胶乳颗粒用纯净水清洗三遍后悬浮于IOml活化缓冲液中，胶乳颗粒终浓度质量体积百分比以g / ml计为I %。活化缓冲液的酸性PH是为了保证羧基处于羧基配位稳定状态，这有利于反应的进行。
[0071]再新鲜配制2%碳二亚胺，取IOml加入等体积胶乳颗粒中，在室温下(18_25°C )搅拌反应15分钟；从而活化胶乳颗粒。
[0072]配制0.2M硼酸缓冲液pH8.5的结合缓冲液；用纯净水清洗三遍活化的胶乳颗粒，悬浮于IOml结合缓冲液中；然后加入等体积的鼠抗冯维勒布兰德因子单克隆抗体，在结合缓冲液中在室温(18-25°C)下搅拌反应2小时，完成二步反应。结合缓冲液的弱碱性pH是为了保证氨基处于氨基配位稳定状态，这有利于反应的进行。
[0073]用纯净水清洗三遍胶乳颗粒后悬浮于含有封闭剂的灭活液中反应I小时；其中的封闭剂为1%牛血清白蛋白，是为了吸附在未结合抗体的胶乳颗粒表面，而降低检测过程中的非特异性反应；灭活液为IOmM甘氨酸，是为了中和掉反应中过量的活性中间体。保存缓冲液为0.1M甘氨酸pH8.0,0.2%叠氮钠，0.2%牛血清白蛋白和0.05%吐温-20。清洗后悬浮于保存缓冲液中。
[0074]b)试剂2的制备
[0075]试剂2为应用液，其制备方法为:三羟甲基氨基甲烷(Tris)浓度为50mM，用盐酸调节后PH值为8.0。再加入如下成分，其终浓度分别为:氯化钠1%，叠氮钠0.2%，牛血清白蛋白0.2%和吐温-200.05%。
[0076]c)配置冯维勒布兰德因子标准品，使用应用液进行系列稀释:S7:40μ g / ml，S6:20 μ g / ml, S5:10 μ g / ml, S4:5 μ g / ml, S3:2.5 μ g / ml, S2:1 μ g / ml, S1:0.5 μ g /ml, SO:应用液。
[0077]检测所得试剂盒的特异性、灵敏度及线性范围见如下实验。
[0078]实施例2
[0079]本实施例与实施例1的差别仅在于所述胶乳颗粒的粒径为lOOOnm，其他操作及配比与实施例1 一致。
[0080]检测所得试剂盒的特异性、灵敏度及线性范围见如下实验。
[0081]试剂盒的特异性、灵敏度及线性范围的检测
[0082]1.在自动检测仪上的检测操作程序，具体如下:
[0083](I)新鲜抽取的静脉血按9:1的比例与枸橼酸抗凝液混匀后离心，分离得到血浆；
[0084](2)在自动检测仪上设定参数:反应温度37°C ;分析方法:2点终点法；主波长:570nm，副波长:800nm;样品量/试剂I /试剂2:20 μ I / 100 μ I / 100 μ I;反应方向:上升;
[0085](3)选用冯维勒布兰德因子标准品，使用应用液进行系列稀释:S7:40μ g / ml,S6:20 μ g / ml, S5:10 μ g / ml, S4:5μ g / ml, S3:2.5μ g / ml, S2:1 μ g / ml, SI:
0.5μ g / ml, SO:应用液。[0086](4)在自动检测仪中加入不同浓度的标准品，试剂I和试剂2(标准品/试剂I /试剂2:20 ill / IOOiU / IOOu I)并启始反应。自动检测仪将自动测量吸光度并制作“浓度-吸光度”标准曲线。
[0087](5)取待测血浆样品，按上述方法测量吸光度。自动检测仪将依照“浓度-吸光度”标准曲线将结果经自动换算直接以Ug / ml为单位报告样本的冯维勒布兰德因子数值。
[0088](6)在使用不同的自动检测仪(血凝分析仪或生化分析仪)时，具体参数应根据仪器不同进行相应调整。
[0089]2.试剂盒特异性的检测
[0090]表1检测冯维勒布兰德因子含量方法特异性
【权利要求】
1.一种用于检测冯维勒布兰德因子的试剂，其特征在于:所述用于检测冯维勒布兰德因子的试剂为应用胶乳增强免疫比浊法的检测试剂，由试剂I和试剂2组成，其中试剂I为抗冯维勒布兰德因子的抗体胶乳试剂，抗冯维勒布兰德因子的抗体胶乳试剂为抗冯维勒布兰德因子与胶乳颗粒结合而成的抗冯维勒布兰德因子的抗体胶乳试剂；试剂2为应用液。
2.根据权利要求1所述的用于检测冯维勒布兰德因子的试剂，其特征在于:所述用于检测冯维勒布兰德因子的试剂还包括冯维勒布兰德因子标准品或标准曲线；所述冯维勒布兰德因子标准品为含有不同浓度的冯维勒布兰德因子的反应缓冲液；标准曲线为冯维勒布兰德因子在人体内含量的标准曲线。
3.根据权利要求1所述的用于检测冯维勒布兰德因子的试剂，其特征在于:所述抗冯维勒布兰德因子的抗体胶乳试剂是通过将抗冯维勒布兰德因子的抗体的氨基与胶乳颗粒的羧基经二步反应后形成共价键而得到；所述二步反应包括:第一步将胶乳颗粒先与结合剂反应，第二步再将胶乳颗粒与抗冯维勒布兰德因子抗体反应。
4.根据权利要求3所述的用于检测冯维勒布兰德因子的试剂，其特征在于:所述抗冯维勒布兰德因子的抗体胶乳试剂是通过将抗冯维勒布兰德因子的抗体的氨基与胶乳颗粒的羧基经二步反应后形成共价键而得到；首先由将胶乳颗粒的羧基与结合剂在弱酸性下反应成胶乳颗粒-结合剂中间体，再将胶乳颗粒-结合剂中间体在弱碱性下与抗冯维勒布兰德因子抗体氨基反应制得抗冯维勒布兰德因子抗体胶乳试剂。
5.根据权利要求1所述的用于检测冯维勒布兰德因子的试剂，其特征在于:所述胶乳颗粒为苯乙烯胶乳颗粒。
6.根据权利要求1所述的用于检测冯维勒布兰德因子的试剂，其特征在于:所述胶乳颗粒的粒径为200?lOOOnm。
7.根据权利要求8所述的用于检测冯维勒布兰德因子的试剂，其特征在于:所述结合剂选自浓度为0.1?5%的碳二亚胺。
8.一种制备权利要求1?7任一所述的用于检测冯维勒布兰德因子的试剂的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤a)制备抗冯维勒布兰德因子抗体胶乳:将抗冯维勒布兰德因子抗体与胶 乳颗粒经二步反应后交联成抗冯维勒布兰德因子抗体胶乳； 步骤b)制备应用液或稀释液。
9.根据权利要求8所述的制备用于检测冯维勒布兰德因子的试剂的方法，其特征在于，步骤a)的具体操作如下:将胶乳颗粒用纯净水清洗后悬浮于活化缓冲液中；加入结合剂在温度小于50°C下搅拌反应，从而活化胶乳颗粒；再加入抗冯维勒布兰德因子抗体在结合缓冲液中在温度小于50度下搅拌反应；再悬浮于含有封闭剂的灭活液中反应，经清洗后悬浮于保存缓冲液中，得抗冯维勒布兰德因子抗体胶乳悬液，置于4°C环境放置。
10.一种制备权利要求1?7任一所述的用于检测冯维勒布兰德因子的试剂的应用，其特征在于:将权利要求1?7任一所述的用于检测冯维勒布兰德因子的试剂作为检测试剂用于制备冯维勒布兰德因子检测产品。
【文档编号】G01N33/68GK103760358SQ201310562657
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】赵铁铭, 李小林, 王枕亚, 喜庆 申请人:赵铁铭, 喜庆