一种检测盐酸克伦特罗化学发光检测试剂盒的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及一种检测盐酸克伦特罗化学发光检测试剂盒，包括发光板、盐酸克伦特罗多克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体、盐酸克伦特罗系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光底物A、发光底物B、阴性对照和阳性对照；本发明的盐酸克伦特罗化学发光检测试剂盒，灵敏度高，其灵敏度可达0.05ng/ml，化学发光免疫分析能够检出放射免疫分析和诊断分析等方法无法检出的物质，检测范围宽、操作简便快速且无毒无污染，对临床上的早期诊断具有十分重要的意义。
【专利说明】一种检测盐酸克伦特罗化学发光检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫检测领域，具体是涉及一种检测盐酸克伦特罗化学发光检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]目前应用于检测食用动物尿液、组织、血清中盐酸克伦特罗的定量检测技术主要有以下几种方法:
1、气相色谱一质谱联用法(Gc-Ms)
GC—MS可用于动物毛发、尿液及组织中克伦特罗等β—兴奋剂的定性定量分析。在气相一质谱测定克伦特罗的方法中检测牛毛中CL的残留，最低检测限为5ng/g。利用喂食大白鼠克伦特罗获得阳性生物材料，经0.01mol/L盐酸溶液提取克伦特罗，乙醚脱脂净化，乙酸乙酯提取后蒸发至干，用乙醇溶解后加样到氧化铝柱上。用0.0lmol/L盐酸溶液洗脱。蒸发至干后，用BSTFA(双三甲基硅烷基三氟乙酰胺)+1% (Ψ)TMCS(三甲基氯硅烷)衍生，最后采用GC-MS进行测定。克伦特罗回收率为75.5%，检测低限为0.5ug/kg。
[0003]GC-MS法优点是能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性，定量分析，而且有较高的灵敏度。缺点是操作复杂，费时，成本高。
[0004]2、高压液相色谱法(HPLC)
在检测CL时，HPLC分析不需要将CL衍生化，且准确、快速、重复性好、假阳性率低，适用于定量检测。β -肾上腺素能激动剂分子可与18C或SC固定相分子相互作用，所以反相柱常应用于HPLC技术中检测β_激动剂类物质。HPLC适合测定热不稳定和强极性的β-激动剂及其代谢产物，而且HPLC可以与柱前提取，纯化及柱后荧光衍生化反应和质谱(MS)等系统联用，容易实现分析过程的自动化。HPLC法可采用不同的检测器，有电化学检测器、紫外检测器、光电二极管阵列检测器和质谱检测器。目前，中国己将HPLC法作为检测CL残留的半确证性方法，最低检测限范围为l_15ng/g，但其缺点是检测过程繁琐，检测时间长，需贵重仪器，难于操作，价格昂贵。
[0005]3、酶联免疫(ELISA)
HPLC或GC-MS —般处理步骤费用昂贵.而通常利用竞争酶标免疫法快速检测试纸条(卡)进行检测比较方便经济，其测定基础是竞争性抗原抗体反应。微孔包被有针对兔IgG(CLENbueroI抗体)的羊抗体。克伦特罗(CLENbuterol)抗体被加入,经过孵育及洗漆步骤后，加入CL与CL酶标记物竞争CL抗体，没有连接的CL酶标记物通过洗涤被除去，用相应的酶底物显色。根据样品孔与标准孔的颜色对照判定结果。
[0006]ELISA较GC-MS和HPLC有其独特的优越性:样品前期处理比较简单，检测出的数据比较稳定，特异性强，检测速度快；设备成本不高，易于推广，灵敏度高，检测限低于
0.5ug/kg。用于EIA的CL抗体有多克隆抗体和单克隆抗体之分，应用多抗存在不同的交叉反应性，应用单抗则大大提高其反应特异性。目前，进口快速检测试纸条(卡)大多应用多抗进行检测。[0007]4、放射免疫分析技术(RlA)
放射免疫分析法检测盐酸克伦特罗残留具有很好的特异性和高灵敏度。1976年Ropitar和Zimmer首次报道用放射免疫分析法检测β —肾上腺索激动剂。DelAhaut等人建立了更为特异的放射免疫方法，最低检测限可达到0.5ng/g。国外已生产出运用RIA测定CL的快速检测试纸条(卡)，还建立了类似放射免疫分析法的放射受体分析法，这种方法是用受体代替抗体结合CL，检测限可达2.4ng/g。国内在此方面的研究尚属空白。但是RIA法存在着仪器价格昂贵，实验条件要求苛刻，放射性同位素对环境和工作人员都不安全的缺点。
[0008]5、荧光免疫分析法(FIA)
Bacigalupo MA等(1995)利用单克隆技术与荧光免疫分析技术检测了在牛的尿液中克伦特罗的残留，其检测限10ng/ml。相较放射免疫分析法，该法无辐射，只需对样品进行比较简单的处理，同时可以一次检测多个样品，但由于其荧光强度取决于激发波长。且对温度强烈依赖，使其应用受到很大的限制。
[0009]6、毛细管区带电泳法(CE)
CE法非常适用于那些难以用传统的液相色谱法分离的离子化样品的分离与分析。其分离效率可达几百万理论塔板数。Gausepohl等应用CE技术检测人尿中CL的残留，最低检测限达0.5ng/mL，而且精确度、准确度均已符合生物样品中残留物的检测标准。该法的优点是操作简便，样品用量极少(一般只需几ng)，而且由于其许多分离参数，如缓冲液的组成和PH值、毛细管的类型以及所使用的电场的波形等都可以调节而显得非常灵活。其缺点是检测所需时间长，仪器复杂，目前缺乏合适、配套的检测仪器。因此CE法的优势必需在开发出灵敏度更高的检测系统的情况下才能充分发挥出来。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种检测盐酸克伦特罗化学发光检测试剂盒，灵敏度高、检测范围宽、操作简便快速且无毒无污染。
本发明为解决上述技术问题的不足，所采用的技术方案是:一种检测盐酸克伦特罗化学发光检测试剂盒，包括发光板、盐酸克伦特罗多克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体、盐酸克伦特罗系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光底物A、发光底物B、阴性对照和阳性对照；
所述发光板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光板，发光板的板孔表面底部包被有包被抗原；
所述包被抗原浓度为3ug/mL ；
所述辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体的工作浓度为1:5000 ；
所述盐酸克伦特罗系列标准溶液浓度分别为0.lng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、lng/ml、2ng/ml 和 5ng/ml ；
所述浓缩洗涤液为含有体积分数0.05%吐温20mmol/l，pH为7.8的磷酸缓冲液；所述包被抗原由盐酸克伦特罗半抗原与牛血清白蛋白(BSA)通过重氮化法偶联制成，具体制备如下:
a、取40mg牛血清白蛋白(BSA)溶于浓度为0.lmol/L的磷酸盐缓冲液中，调整PH至8.6，得到牛血清白蛋白(BSA)溶液备用；
b、取IOmg盐酸克伦特罗半抗原溶于浓度为0.01mol/L的HCl溶液中，预冷至O~_5°C，然后加入IOmg的NaNO2，在4°C下搅拌6h，然后加入步骤a的牛血清白蛋白(BSA)溶液。在4°C下继续搅拌6h，最后用葡聚糖凝胶S印hadex G_25凝胶过滤纯化得到盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白(BSA)偶联物；
所述发光底物液A的制备方法:配置0.2M pH7.4的磷酸盐缓冲液，在此缓冲液中加入鲁米诺和四苯硼钠，混合均匀；
所述发光底物液B的制备方法:配置0.2M pH7.4的磷酸盐缓冲液，在此缓冲液中加入0.1% H2O2 ；
所述阴性对照液的制备方法:选用5份以上盐酸克伦特罗检测为阴性的猪尿混合，除菌过滤保存于2~8°C ;
所述阳性对照液的制备方法:选用5份以上盐酸克伦特罗检测为阳性的猪尿混合，除菌过滤保存于2~8°C。
[0011]有益效果
(O灵敏度高，其灵敏度可达0.05ng/ml，化学发光免疫分析能够检出放射免疫分析和诊断分析等方法无法检出的物质，对临床上的早期诊断具有十分重要的意义。
[0012](2)具有宽的线性动力学范围，线性检测范围可扩宽到0.01~10ng/ml，发光强度在4~6个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系，这与显色的酶免疫分析吸光度(O值)为2.0的范围相比，优势明显.虽然RIA也有较宽的线性动力学范围，但放射性限制了其应用。
[0013](3)、本产品发光底物稳定好，光信号持续时间长.(4)、分析方法简便快速.(5)、结果稳定、误差.(6)安全性好及使用期长，免除了使用放射性物质。到目前为止，还未发现其危害性；试剂稳定，保存期可达六个月至一年以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明的盐酸克伦特罗化学发光检测试剂盒的制备流程图。
图2为本发明的盐酸克伦特罗化学发光检测试剂盒进行结果判定时的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0015]以下是本发明的具体实施例:
所述盐酸克伦特罗特异性抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联后作为包被用抗原，检测抗原溶液外观澄清、无肉眼可见异物、无摇不散的沉淀，纯度较高(均>99%)，并具有较高的效价和很好的活性，特异性和灵敏度较好，可用于生产盐酸克伦特罗检测试剂盒，按最适工作浓度将盐酸克伦特罗特异性抗原用0.05mol/L pH9.6的碳酸缓冲液进行稀释，按每孔100 μ I包被化学发光板,置2_8°C孵育20小时以上,洗板I次后每孔加入150 μ I封闭液于2-8°C孵育20小时以上，吸干封闭液后置相对湿度30%的环境干燥5小时，铝箔袋密封包装，2-8 °C保存。[0016]用过碘酸钠法制备酶标记盐酸克伦特罗抗体，反应体系为:先用5mg/ml的HRP溶液Iml与0.2ml的0.15mlNa104溶液混匀4°C避光0.5小时，加入0.25ml的乙二醇摇匀室温避光I小时，4°C透析过夜，用0.2ml 0.2M pH9.6的CB将透析后的醛化HRP溶液调pH值为9.2-9.5，将一定量的抗原溶于1.0ml 0.01M pH9.6的CB后立即加入上述醛化HRP中于37°C反应一定时间，加入0.1ml NaBH4溶液(3.5毫克/毫升)，混匀于4°C放置2小时，用凝胶过滤层析进行纯化。
[0017]用于检测盐酸克伦特罗检测试剂盒检测样品中盐酸克伦特罗的检测方法
(I)从冰箱中取出试剂盒，室温平衡30分钟以上。
[0018](2)取浓缩洗液一瓶(25ml)，用蒸馏水或去离子水稀释至500ml，使成工作液，混匀备用。
[0019](3)设空白对照I孔，其不加样本和CLEN酶结合物，其余步骤与其他孔相同；设阴性对照2孔、阳性对照2孔；除空白孔外每孔加入100 μ ICLEN酶结合物，然后在相应孔内分别加入阴性对照、阳性对照、待测样本各20 μ 1，用封板膜密封，轻轻混匀后置37°C温箱温育60分钟。
[0020](4)用洗液工作液洗板,将每孔内的液体吸净后注满洗液(每孔至少400μ I),浸泡10-60秒后，吸净每孔中洗液，如此反复5次，最后在吸水纸上拍干。
[0021](5)每孔先后加入化学发光底物A液、B液各50 μ 1，轻轻混匀后于室温(18_30°C)避光反应5分钟。
[0022](6)避光反应结束后立即在化学发光分析仪上测量各孔的相对发光单位(RLU)，测量时间设定为0.1秒/孔。
[0023](7)结果判定:取标准品浓度对数做横坐标，标准品检测发`光值对数做纵坐标，做标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上计算出来。
[0024]
本发明试剂盒的考核结果:经三家猪养殖中心进行测试，检测结果见下表:
【权利要求】
1.一种检测盐酸克伦特罗化学发光检测试剂盒，其特征在于:包括发光板、盐酸克伦特罗单克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体、盐酸克伦特罗系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液、阴性对照和阳性对照； 所述发光板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光发光板，发光板的板孔表面底部包被有包被抗原； 所述包被抗原浓度为3ug/mL ； 所述辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体的工作浓度为1:5000 ； 所述盐酸克伦特罗系列标准溶液浓度分别为0.lng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、lng/ml、2ng/ml 和 5ng/ml ； 所述浓缩洗涤液为含有体积分数0.5%吐温20mmol/l，pH为7.8的磷酸缓冲液； 所述包被抗原由盐酸克伦特罗半抗原与卵白蛋白通过重氮化法偶联制成，具体制备如下: a、取40mg卵白蛋白溶于浓度为0.lmol/L的磷酸盐缓冲液中，调整PH至8.6，得到卵白蛋白溶液备用； b、取IOmg盐酸克伦特罗半抗原溶于浓度为0.0lmol/L的HCl溶液中，预冷至O?_5°C,然后加入IOmg的NaNO2,在4°C下搅拌6h,然后加入步骤a的卵白蛋白溶液； 在4°C下继续搅拌6h,最后用葡聚糖凝胶Sephadex G_25凝胶过滤纯化得到盐酸克伦特罗-卵白蛋白偶联物； 所述发光底物液A的制备方法:配置0.2M pH7.4的磷酸盐缓冲液，在此缓冲液中加入鲁米诺和四苯硼钠，混合均匀； 所述发光底物液B的制备方法:配置0.2M pH7.4的磷酸盐缓冲液，在此缓冲液中加入.0.1% H2O2 ； 所述阴性对照液的制备方法:选用5份以上盐酸克伦特罗检测为阴性的猪尿混合，除菌过滤保存于2?8°C ; 所述阳性对照液的制备方法:选用5份以上盐酸克伦特罗检测为阳性的猪尿混合，除菌过滤保存于2?8°C。
【文档编号】G01N33/577GK103728450SQ201310551775
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】王善普, 闫玉良, 刘姗姗, 刘欢, 王宇东 申请人:洛阳莱普生信息科技有限公司