淮山药x病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用的利记博彩app

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【专利摘要】本发明公开了一种侵染淮山药的马铃薯X病毒属病毒——淮山药X病毒（Yam?virus?X，YVX）的多克隆抗体制备、检测及其应用。基于YVX基因组，发明人通过原核表达纯化YVX的外壳蛋白（Coat?protein，CP）并用于免疫家兔制备多克隆抗体，该多克隆抗体能特异性识别原核表达的YVX的外壳蛋白和侵染淮山药的YVX病毒的外壳蛋白，并产生特异性免疫反应。基于此，发明人还建立了一套高效、高灵敏和准确的IC-RT-PCR、ELISA和Western?blot方法，可以特异性地从感染YVX的淮山药植株中检测出YVX。应用本发明，可为YVX与寄主相互作用研究以及该病毒的快速检测、分型和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑，为该病毒的流行监测和防治打下扎实基础。
【专利说明】淮山药X病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种侵染淮山药的马铃薯X病毒属病毒一淮山药X病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用。
【背景技术】
[0002]淮山药又称山药、淮山，为薯蓣科植物，其块根富含淀粉、蛋白质、维生素、氨基酸及多种药用成分如胆碱、皂甙、粘多糖等，还含有Fe、Zn、Cu、Ca等多种矿物质，依据种和品种的不同，可作药用或食用，具有良好市场前景和产业开发潜势。病毒病严重影响淮山药的产量和品质，在淮山药生产上造成重大损失。文献表明，全球范围内，自然条件下侵染淮山药的病毒有杆状DNA病毒属的参暮杆状病毒(Dioscorea alata bacilliform virus,DaBV)、淮山药花叶病毒(Yam mosaic virus, YMV)、淮山药温和花叶病毒(Yam mild mosaicvirus, YMMV)、中 国淮山药坏死花叶病毒(Chinese yam necrotic mosaic virus, CYNMV)、日本淮山花叶病毒(Japanese yam mosaic virus, JYMV)、香豆萎蔫病毒 2 (Broad bean wiltvirus-2, BBWV-2)。我国已发现DaBV、YMMV、JYMV、CYNMV和BBWV-2侵染淮山药，引发的症状包括花叶、斑驳、脉明、褪绿、生长迟缓和叶片扭曲等。不同淮山药病毒引起症状不同，也可以引起相似症状；其传播介体不一样，有不同的传播途径。为了保证淮山药生产的正常进行，首先要保证种薯不携带病毒，其次是在生产大田及时发现和鉴定病毒，以便制定有针对性的防治措施，包括控制传播介体来切断病毒病的传播。因此，要求有灵敏度高、特异性好的病毒检测技术来对淮山药的种薯和田间样本进行检测。目前，用于植物RNA病毒病原检测的主要技术手段有 RT-PCR、IC-RT-PCR、qRT-PCR、LAMP-PCR、ELISA、Western blot 等，在病毒病原检疫检测方面应用最多的是ELISA和qRT-PCR。
[0003]近年来对中国各主要淮山产区的调查中，发现侵染淮山药的一个新病毒一分类上属于马铃薯X病毒属(Potexvirus)病毒,暂定名为淮山药X病毒(Yam virus X, YVX)?

【发明内容】

[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种淮山药X病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用，以便用于快速检测侵染淮山药的淮山药X病毒。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:淮山药X病毒的多克隆抗体制备方法，原核表达纯化淮山药X病毒的CP蛋白(Coat Protein)并用于免疫家兔制备多克隆抗体。
[0006]淮山药X病毒的CP蛋白具有序列表SEQ.1D.N0.1的氨基酸序列，或由具有序列表SEQ.1D.N0.2的碱基序列的基因所编码。
[0007]上述多克隆抗体制备方法，取纯化后的重组CP蛋白，采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔，以后每2周加强免疫一次，共免疫4次；首次免疫加入与蛋白等量的弗氏完全佐剂，后3次加入与蛋白等量的弗氏不完全佐剂；末次加强免疫7天后，心脏采血，分离血清；再用抗原亲和层析纯化获得该病毒外壳蛋白CP的多克隆抗体。[0008]所得淮山药X病毒的多克隆抗体在检测淮山药X病毒方面的应用。
[0009]基于上述多克隆抗体的淮山药X病毒的ELISA检测方法。
[0010]上述ELISA检测方法，包括以下步骤:
[0011](I)用ImL抗原包被缓冲液研磨0.1g淮山药新鲜叶片，9000rpm离心5min,取上清液稀释20倍，按照100 μ I/孔加入ELISA板；感染YVX的淮山药病叶为阳性对照，相应健康叶为阴性对照，37 °C孵育2h;
[0012](2)用200 μ I PBST洗涤两次后，用5%脱脂奶粉封闭30min ；
[0013](3)用200 μ I PBST洗涤两次后，每个孔中加入用抗体稀释缓冲液按照1:8000稀释的多克隆抗体，100 μ I/孔，37°C孵育Ih或室温孵育3h ；
[0014](4)用200 μ I PBST洗涤两次后，每个孔中加入按说明书稀释3000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG结合物，100 μ I/孔，室温孵育Ih ；
[0015](5)用200 μ I PBST洗涤三次后，用TMB底物显色试剂盒(康为世纪公司)进行显色，室温避光孵育25-30min，反应产物呈蓝色，每孔再加入50 μ 10.5Μ H2SO4终止显色，此时蓝色产物变为亮黄色，立即用酶标仪读取OD45tl的值，以与阴性OD值比值(Ρ/Ν)大于2.1为阳性；
[0016]PBST 含 3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl, 135mM NaCl,0.05%Tween20,pH7.4 ;抗原包被缓冲液为碳酸盐缓冲液(30mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6);抗体稀释缓冲液为 1%BSA, 0.0lM PBS ρΗ7.2。
[0017]基于上述多克隆抗体的淮山药X病毒的Western blot检测方法。
[0018]上述Western blot检测方法,包括以下步骤:
[0019](I)用TCA/丙酮沉淀法或采用植物蛋白质提取试剂盒提取淮山药总蛋白样品，用Bradford法进行蛋白质定量,调整蛋白质浓度为2mg/mL ；
[0020](2)制备蛋白电泳凝胶，进行SDS-PAGE ；
[0021](3)半干式转移:电泳结束后将凝胶割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5minX3次；预先裁好与凝胶同样大小的滤纸和PVDF膜，用甲醇浸泡Imin后，浸入转膜缓冲液中IOmin ;转膜装置从下至上依次按阳极碳板、3层3mm滤纸、PVDF膜、凝胶、3层3mm滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、PVDF膜精确对齐，每一步去除气泡，盖好阴极碳板之后接通电源，恒流ImA/cm2,转移1.5h,转移结束后,断开电源将膜取出；
[0022](4)免疫反应:用0.0lM PBS洗膜，Imin ;加入封闭液,室温封闭I?2h ;弃封闭液，用0.0lM PBST洗膜，5minX3次；加入用抗体稀释缓冲液按照1:5000稀释的YVX的CP多克隆抗体(一抗)，室温孵育2h或4°C放置12h以上；阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同；弃一抗和1%BSA，用0.0lM PBST分别洗膜，5minX4次；加入用抗体稀释缓冲液稀释1000倍的碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔IgG结合物(二抗)，平稳摇动，室温2h ；弃二抗，用0.0lM PBST洗膜，5minX4次；加入BCIP/NBT显色液，显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应；
[0023]转膜缓冲液为25mM Tris, 192mM glycine, 0.01%SDS, 20%methanol, pH8.3 ；0.0lMPBS 含有 3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl，135mM NaCl，pH7.4 ;封闭液为 5%脱脂奶粉或3%BSA。
[0024]基于上述多克隆抗体的淮山药X病毒的IC-RT-PCR检测方法。[0025]上述IC-RT-PCR检测方法，包括以下步骤:
[0026](I)用抗体稀释缓冲液按照1:8000稀释YVX多克隆抗体，每个1.5mL的离心管中加入100 μ I稀释好的抗体，37°C孵育Ih或室温孵育3h ；
[0027](2)将淮山药叶片与含2%PVP的0.02M PBS研磨缓冲液按质量体积比0.2% (w/v)放入研钵中，研磨成叶汁勻衆，吸入1.5mL离心管中，9000rpm离心IOmin ；
[0028](3)将步骤(I)中包被好抗体的1.5mL离心管用PBST洗两次，加入200 μ I步骤
(2)准备好的叶汁上清液，37°C水浴3h，此时暴露的病毒颗粒特异性地附着于离心管内壁上(免疫捕捉);
[0029](4)移去叶汁，PBST洗3次，DEPC水洗I次，洗毕作短暂离心去除管底余液；
[0030](5)用SuperRT —步法RT-PCR试剂盒(康为世纪公司)进行RT-PCR反应，YVX 检测引物为 YVX-F:5’ -CCAGGTCCATCAGTCACTTCT-3’ 和 YVX-R:5’ -CTAATCTACCAGCAGTCACTTCATA-3’，PCR 阶段设置退火温度为 55°C，35 个循环；
[0031](6) RT-PCR结束后，取5 μ I的PCR产物用质量体积浓度1.0% (w/v)琼脂糖凝胶进行电泳检测，预期片段大小为692bp。
[0032]抗体稀释缓冲液为1%BSA, 0.0lM PBS ρΗ7.2。
[0033]为建立淮山药X病毒(YVX)的检测方法，发明人深入研究了 YVX河南分离物(分离自河南省温县的铁棍山药(TG))的全长基因组序列，该病毒的全长基因组序列(见序列表SEQ.1D.N0.3)共有6159个核苷酸，5’非编码区有73个碱基，3’非编码区有235个碱基(不包括poly (A)的长度)，编码5个蛋白质，从5’端到3’端的顺序编码的蛋白大小分别为:1335aa, 232aa, 109aa, 68aa, 227aa。基于YVX基因组，发明人通过原核表达纯化YVX的外壳蛋白(CP)并用于免疫家兔制备多克隆抗体，该多克隆抗体能特异性识别原核表达的YVX的外壳蛋白和在侵染淮山药的YVX病毒的外壳蛋白，并产生特异性免疫反应，其ELISA效价为1:16000。发明人更进一步，基于针对YVX外壳蛋白的特异性抗体，结合针对该病毒YVX的基因组的特异性引物建立了 IC-RT-PCR方法，能够高效、高灵敏和准确地从感染YVX的淮山药植株中检测出YVX ;同理建立的ELISA和Western blot方法也可以特异性地从感染YVX的淮山药植株中检测出YVX。应用本发明提供的YVX全基因组序列以及多克隆抗体，可为YVX与寄主相互作用研究以及该病毒的快速检测、分型和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑，为该病毒的流行监测和防治打下扎实基础。
【专利附图】

【附图说明】
[0034]图1是YVX的5’/3’RACE电泳图，图中:M为DNA分子量标准(O，GeneRulerlOObpPlus DNA Ladder, Thermo Scientific 公司)，I 为 5’ RACE 产物，2 为 3’ RACE 产物。
[0035]图2是YVX的分段PCR扩增电泳图，图中:M为DNA分子量标准(O，GeneRulerlkbDNA Ladder, Thermo Scientific 公司)，I 为 YVX 片段 2，2 为 YVX 片段 3。
[0036]图3是YVX的基因组结构示意图。
[0037]图4是YVX的复制酶基因与其他马铃薯X病毒属病毒代表种的进化关系图。
[0038]图5是YVX的外壳蛋白基因与其他马铃薯X病毒属病毒代表种的进化关系图。
[0039]图6是YVX的外壳蛋白基因PCR扩增电泳图，图中:M为DNA分子量标准(O，GeneRulerlkb DNA Ladder, Thermo Scientific 公司)，泳道 I ?3 为 3 个重复的 YVX的CP蛋白基因的PCR产物。。
[0040]图7是原核表达载体pET30a-YVX_CP的酶切验证电泳图，图中:M为DNA分子量标准(O，GeneRulerlkb DNA Ladder, Thermo Scientific 公司)，泳道 I ?3 为 3 个重复的连接上YVX的CP蛋白基因的pET30a-YVX-CP质粒的酶切产物。
[0041]图8是验证YVX的CP基因的重组蛋白表达形式的SDS-PAGE图，图中:M为蛋白分子量标准(PageRuler Unstained Protein Ladder, Thermo Scientific 公司)，I 为超声波破碎细胞后离心收集的上清样品，2为超声波破碎细胞后离心收集的沉淀样品。
[0042]图9是亲和纯化的YVX的CP基因的重组蛋白的SDS-PAGE图，图中:M为蛋白分子量标准(PageRuler Unstained Protein Ladder, Thermo Scientific 公司)，I 为镇柱纯化的带有6 XHis标签的YVX的CP重组蛋白。
[0043]图10是YVX多克隆抗体效价测定图，图中:1为免疫前血清，2为纯化抗体，3为检测因子。
[0044]图11是ACP-ELISA图，图中:1是感染YVX的淮山药总蛋白样品(三个重复)，2是未感染YVX的健康淮山药总蛋白样品(三个重复)，3是只加蛋白裂解液的空白对照(三个重复)，4是原核表达纯化的YVX-CP蛋白样品(三个重复)。
[0045]图12 是 Western blot 图，图中:M 为蛋白分子量标准(PageRuler PrestainedProtein Ladder, Thermo Scientif ic 公司)，I 为 YVX 阳性样品，2 为 YVX 阳性样品，3 为 YVX阳性样品，4为YVX阴性样品，5为YVX阳性样品，6为YVX阴性样品。
[0046]图13 是 IC-RT-PCR 图，图中:M 为 DNA 分子量标准(O，GeneRulerlOObp DNALadder, Thermo Scientific公司)，I为空白对照,2为阴性对照(健康样品),3为阳性对照(YVX感病样品)，4-6为疑似病毒病的待测样品(其中6号泳道的样品经ELISA检测为YVX阳性)。
【具体实施方式】
[0047]以下所用大肠杆菌(Escherichia coli)株系DH5 α和BL21 (DE3)pLysS菌株由本实验室保存，5’ /3’ RACE试剂盒购自罗氏应用生命科学公司(Roche)，PCR产物克隆载体购自Invitrogen公司，限制性内切酶、PCR Mix等购自Thermo公司。
[0048]一、YVX的全长基因组序列的克隆
[0049]1.1YVX的3’端序列克隆
[0050]根据转录组深度测序获得的YVX的序列，设计互补YVX3’ poly(A)末端、带有oligo (dT)的 cDNA 第一链合成引物 NlT (5，-GACCACGCGTATCGATGTCGAC(T) 17V_3’，见序列表SEQ.1D.N0.4，试剂盒提供)、正向引物YVX-3’ -1F
[0051 ] (5，-TTGCTCGTCGTTCTCTGGCTGC-3，，见序列表 SEQ.1D.N0.5 )和 YVX-3，-2F
[0052](5，-CCTCCTGCTAACTGGTCTGCTCTC-3’，见序列表 SEQ.1D.N0.6)，反向引物 NI
[0053](5，-GACCACGCGTATCGATGTCGAC-3’，见序列表 SEQ.1D.N0.7，试剂盒提供)。利用5’/3’RACE试剂盒(Roche)合成YVX基因组的3’端cDNA。在20 μ I的反应体系中加入7μ IddH20(RNase-Free), 4 μ I 的 5X cDNA synthesis buffer, I μ I NlT 弓丨物(10 μ Μ), 5 μ I 铁棍山药总 RNA (I μ g) 2 μ I dNTP (IOmM), I μ I Transcriptor Reverse Transcriptase(Roche公司)，混匀，55°C反应60分钟，然后在85°C反应5分钟使逆转录酶失活。以反转录获得的第一链cDNA为模板，用正向引物YVX-3 ’ -1F和反向引物NI进行第一次PCR，再以第一次PCR产物稀释100倍为模板，以YVX-3’ -2F和NI为引物进行第二次PCR，得到一条特异性的、预期大小为489bp的DNA片段(图1，泳道2)。利用pCR2.1PCR产物克隆试剂盒(Invitrogen公司)克隆3’ RACE PCR产物。连接反应体系为:1 μ I PCR产物，2μ15Χ连接酶Buffer，I μ I pCR2.lvector,5y I ddH20和I μ I T4DNA连接酶。连接反应液在室温放置，反应30分钟后用于转化Ε.coli DH5a感受态细胞，涂布在加有100 μ g/L的氨苄青霉素、10μ L IPTG (24mg/mL)和 20 μ L X-Gal (20mg/mL)的 LA 培养基上，37°C 培养 18 小时。挑取白色菌落提取质粒，并用EcoR I酶切鉴定，挑选3个酶切图谱正确的阳性克隆进行序列测定，将重组质粒命名为pCR-YVX-3。
[0054]1.2YVX 的 5’ 端 cDNA 的克隆
[0055]根据高通量测序获得的YVX的序列，设计反向引物YVX-5’_1R (5’-TGATGGGTGTTTGAAGTAAGCCTCTG-3’，见序列表 SEQ.1D.N0.8)和 YVX-5’ -2R (5 ’ -TCTGATATGTATGCCACGGGTGTTTG-3’，见序列表SEQ.1D.N0.9)。利用5，/3，RACE试剂盒(Roche)合成YVX的5，端的cDNA:在 20 μ I 的反应体系中加入 7 μ I ddH20，4 μ I 的 cDNA synthesis buffer, 2 μ I dNTP(I OmM), I μ I YVX-5’ _1R(10 μ Μ)，5 μ I 铁棍山药总 RNA (Iyg)和 I μ I TranscriptorReverse Transcriptase,混勻，55°C反应60分钟,然后在85°C反应5分钟使转录酶失活。反应结束后，用PCR产物纯化试剂盒(Roche商品名)纯化第一链cDNA产物。取19 μ I纯化的第一链cDNA产物，加入2.5 μ IlOXReaction Buffer, 2mM dATP，轻柔混匀并短暂离心，于94°C反应3分钟,立即置于冰上。短暂离心,加入I μ I末端转移酶Terminal Transferase(Roche公司)，轻柔混匀并置于37 V反应20分钟，然后在70°C反应10分钟以使末端转移酶失活。取5μ I已经加了 A尾巴的cDNA作为模板，加入1μ I引物NlT (ΙΟμΜ),Ιμ IYVX-5，-1R (10μΜ)，1μ I dNTP (10mM)，5 μ 110 X Reaction Buffer, 0.5 μ I Taq DNAPolymerase (5U/μ I)和36.5 μ I ddH20，进行第一次PCR，再以第一次PCR产物稀释100倍为模板，以YVX-5’ -2R (ΙΟμΜ)和NI (10 μ Μ)为引物进行第二次PCR，扩增出一条特异性预期大小为541bp的带(图1，泳道I)。利用pCR2.1PCR产物克隆试剂盒(Invitrogen公司)克隆5’RACE PCR产物。连接反应体系为:1 μ I新鲜PCR产物，2 μ 15 X连接酶Buffer，I μ I pCR2.lvector, 5 μ I ddH20和I μ I T4DNA连接酶。连接反应液在室温放置，反应30分钟后用于转化Ε.coli DH5a的感受态细胞，涂布在加有100 μ g/L的氨苄青霉素、10 μ LIPTG (24mg/mL)和20 μ L X-Gal (20mg/mL)的LA培养基上，37°C培养18小时。挑取白色菌落提取质粒，并用EcoR I酶切鉴定，挑选3个鉴定正确的阳性克隆进行序列测定，将重组质粒命名为pCR-YVX-5。
[0056]1.3克隆测序验证高通量测序结果
[0057]分别挑取3 ’ -cDNA片段和5 ’ -cDNA片段的3个克隆进行序列测定，获得病毒基因组部分片段序列(图1)。根据获得的序列设计两对引物:正向引物YVX-268F(5，-ACATACCCATGCCGCCTGTAAAG-3’，见序列表 SEQ.1D.N0.10)和反向引物 YVX-3446R(5，-GCATTGCTCCGTCCTGAGATTGAT-3’，见序列表 SEQ.1D.N0.11);正向引物 YVX-3277F(5，-CGTCCGCCGTCGAAGTTCAA-3’，见序列表 SEQ.1D.N0.12)和反向引物 YVX-5824R(5’-CACGCTCAATCTCTGTAGGCTCTC-3，，见序列表 SEQ.1D.N0.13)。预期 PCR 扩增片段大小分别为3179bp和2771bp。以3’ RACE的cDNA为模板，分别用这两对引物进行PCR扩增获得预期大小的目的片段(图2)，分别克隆至pCR2.1vector并挑取3个克隆进行测序。
[0058]通过3’ RACE、5’ RACE和分段克隆测序最终拼接获得包含6139nt的YVX的全长基因组序列(见序列表SEQ.1D.N0.3),经结构域预测和同源序列比对分析，发现其编码5个病毒蛋白，分别为复制酶多聚蛋白(replicase polyprotein,见序列表SEQ.1D.N0.18),三重基因块蛋白I (triple gene block proteinl,见序列表SEQ.1D.N0.19),三重基因区蛋白2 (triple gene block protein2,见序列表 SEQ.1D.N0.20),三重基因区蛋白 3 (triplegene block protein3,见序列表SEQ.1D.N0.21)和外壳蛋白(coat protein,见序列表SEQ.1D.N0.1)(图 3)。
[0059]选取复制酶多聚蛋白和外壳蛋白的氨基酸序列，用MEGA4.0软件的邻接法构建系统进化树。两个进化树均显示，该病毒与Nerine virus X在进化上的关系最近(图4和图5)。二、YVX病毒外壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
[0060]2.1YVX外壳蛋白基因的克隆
[0061]根据已获得的YVX的CP基因序列设计一对特异性引物:正向引物YVX-CP-F (3’_CCCGAATTCATGATTGAAAGTATGTCTACACC-5，,见序列表 SEQ.1D.N0.14，其 5’ 端加入 EcoR I 酶切位点)，反向引物 YVX-CP-R (3 ’ -TTTGTCGACTTAAGGTTCAGGCAAGTTGAG-5 ’，，见序列表 SEQ.1D.N0.15，其5’端加入Sal I酶切位点)，预期产物为771bp<^5RT_PCR，获得大小约750bp的YVX的CP基因片段(图6)。将该产物克隆至pUC19，构建pUC19-YVX-CP，转化E.coli DH5 α感受态细胞。挑取3个阳性克隆测序，结果表明pUC19-YVX-CP包含YVX的CP基因的完整序列。BLASTX比对结果表明，与YVX的CP同源性最高的为Nerine virus X的CP (46%)，其次为 White clover mosaic virus 的 CP (44%)。
[0062]2.2蛋白的诱导表达及纯化
[0063]用EcoR I和Sal I双酶切pUC19_YVX_CP质粒，经凝胶电泳分离，回收YVX的CP片段(图7)并克隆至原核表达载体pET30a，构建原核表达质粒pET30a-YVX-CP。用pET30a-YVX-CP转化E.coli BL21 (DE3) pLysS感受态细胞，用PCR和双酶切方法筛选阳性克隆。挑取新鲜培养的含pET30a-YVX-CP的BL21 (DE3)pLysS单菌落，接种于IOmL含50 μ g/L卡那霉素的LB培养基中，37°C振荡培养过夜。按1:100的比例将过夜培养的菌液加入到200mL新鲜的含25 μ g/L卡那霉素的LB培养基中，37°C振摇培养至OD6tltl=0.4~0.6。加入终浓度0.5mM的IPTG，于20°C，160rpm振荡培养诱导表达5h。离心收集菌体，用1/20培养体积的细胞裂解缓冲液(50mM NaH2P04,300mM NaCl, IOmM Imidazole，IOmMβ _ΜΕ，ρΗ8.0)进行悬浮，然后进行超声波破碎。离心后取少量上清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析，确定该蛋白为可溶性表达(图8)。用N1-NTA树脂(QIAgen公司)对超声波破碎的细胞离心上清液进行YVX-CP蛋白的亲和纯化。SDS-PAGE检测显示，亲和纯化后的YVX-CP蛋白为单一条带，分子量约为35kDa (图9)。
[0064]2.3多克隆抗体制备及效价测定
[0065]免疫用兔为新西兰大白兔(2只)。免疫前采集正常血清作为阴性对照。取纯化后的重组蛋白2mL(蛋白浓度为lmg/mL)，采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔，以后每2周加强免疫一次，共免疫4次。首次免疫加入与蛋白等量的弗氏完全佐剂，后3次加入与蛋白等量的弗氏不完全佐剂。末次加强免疫7天后，心脏采血，分离血清，再用抗原亲和层析，得到纯化的多克隆抗体。以原核表达的YVX CP为抗原，经ELISA法测定，纯化后的多克隆抗体效价为1:16000 (图10)。
[0066]三、基于YVX外壳蛋白多克隆抗体的检测方法
[0067]3.1间接抗原包被ELISA (ACP-ELISA)方法检测病毒
[0068]ACP-ELISA方法的操作步骤:
[0069](I)用ImL抗原包被缓冲液研磨0.1g淮山药新鲜叶片，9000rpm离心5min,取上清液稀释20倍，按照100 μ I/孔加入ELISA板；感染YVX的淮山药病叶为阳性对照，相应健康叶为阴性对照，37 °C孵育2h;
[0070](2)用 200μ1 PBST (3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl, 135mM NaCl,0.05%Tween20, pH7.4)洗涤两次后，用5%脱脂奶粉封闭30min ；
[0071](3)用200 μ I PBST洗涤两次后，每个孔中加入用抗体稀释缓冲液按照1:8000稀释的YVX多克隆抗体，100 μ I/孔，37°C孵育Ih或室温孵育3h ；
[0072](4)用200 μ I PBST洗涤两次后，每个孔中加入按说明书稀释3000倍的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG结合物(Abmart公司)，100 μ I/孔，室温孵育Ih ；
[0073](5)用200 μ I PBST洗涤三次后，用TMB底物显色试剂盒(康为世纪公司)进行显色(图11)，室温避光孵育25-3011^11，反应产物呈蓝色，每孔再加入5(^10.51 H2SO4终止显色，此时蓝色产物变为亮黄色，立即用酶标仪读取OD45tl的值，以与阴性OD值比值(Ρ/Ν)大于
2.1为阳性；
[0074]其中，PBST含 3.2mM Na2HPO4, 0.5mM KH2PO4, 1.3mM KCl，135mM NaCl,
0.05%Tween20, pH7.4 ;抗原包被缓冲液为碳酸盐缓冲液(30mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，ρΗ9.6);抗体稀释缓冲液为 1%BSA, 0.01M PBS ρΗ7.2。
[0075]3.2蛋白质免疫印记(Western blot)方法检测病毒
[0076]操作步骤:
[0077](I)用TCA/丙酮沉淀法或采用植物蛋白质提取试剂盒(康为世纪公司)提取淮山药总蛋白样品，用Bradford法进行蛋白质定量,调整蛋白质浓度为2mg/mL ；
[0078](2)制备蛋白电泳凝胶，进行SDS-PAGE ；
[0079](3)半干式转移:电泳结束后将凝胶割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5minX3次；预先裁好与凝胶同样大小的滤纸和PVDF膜，用甲醇浸泡Imin后，浸入转膜缓冲液中IOmin ;转膜装置从下至上依次按阳极碳板、3层3mm滤纸、PVDF膜、凝胶、3层3mm滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、PVDF膜精确对齐，每一步去除气泡，盖好阴极碳板之后接通电源，恒流ImA/cm2,转移1.5h,转移结束后,断开电源将膜取出；
[0080](4)免疫反应:用 0.01M PBS (3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl, 135mMNaCl，pH7.4)洗膜，Imin ;加入封闭液(5%脱脂奶粉或3%BSA)，室温封闭I~2h ;弃封闭液，用0.01M PBST洗膜，5minX3次；加入用抗体稀释缓冲液按照1:5000稀释的YVX的CP多克隆抗体(一抗)，室温孵育2h或4°C放置12h以上；阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同；弃一抗和1%BSA，用0.01M PBST分别洗膜，5minX4次；加入用抗体稀释缓冲液稀释1000倍的碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔IgG结合物(二抗)，平稳摇动，室温2h ；弃二抗，用0.01M PBST洗膜，5minX4次；加入BCIP/NBT显色液，显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应(图12)；
[0081]其中，转膜缓冲液为25mM Tris, 192mM glycine, 0.01%SDS, 20%methanol, pH8.3 ；0.0lM PBS 含有 3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl，135mM NaCl，pH7.4 ;封闭液为 5%脱脂奶粉或3%BSA。
[0082]3.3用免疫捕获反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)方法检测病毒
[0083]IC-RT-PCR方法的操作步骤:
[0084](I)用抗体稀释缓冲液按照1:8000稀释YVX多克隆抗体，每个1.5mL的离心管中加入100 μ I稀释好的抗体，37°C孵育Ih或室温孵育3h ；
[0085](2)将淮山药叶片与含2%PVP的0.02M PBS研磨缓冲液按质量体积比0.2% (w/v)放入研钵中，研磨成叶汁勻衆，吸入1.5mL离心管中，9000rpm离心IOmin ；
[0086](3)将步骤(I)中包被好抗体的1.5mL离心管用PBST洗两次，加入200 μ I步骤
(2)准备好的叶汁上清液，37°C水浴3h，此时暴露的病毒颗粒特异性地附着于离心管内壁上(免疫捕捉);
[0087](4)移去叶汁，PBST洗3次，DEPC水洗I次，洗毕作短暂离心去除管底余液；
[0088](5)用SuperRT —步法RT-PCR试剂盒(康为世纪公司)按照说明书进行RT-PCR反应，YVX 检测引物为 YVX-F:5’ -CCAGGTCCATCAGTCACTTCT-3’(见序列表 SEQ.1D.N0.16)和YVX-R:5’ -CTAATCTACCAGCAGTCACTTCATA-3’(见序列表 SEQ.1D.N0.17)，PCR 阶段设置退火温度为55°C，35个循环；
[0089](6) RT-PCR结束后，取5 μ I的PCR产物用质量体积浓度1.0% (w/v)琼脂糖凝胶进行电泳检测，预期片段大小为692bp (图13)。
[0090]其中，抗体稀释缓冲液为1%BSA，0.0lM PBS pH7.2。
【权利要求】
1.一种淮山药X病毒的多克隆抗体制备方法，其特征在于:原核表达纯化淮山药X病毒的CP蛋白并用于免疫家兔制备多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的淮山药X病毒的多克隆抗体制备方法，其特征在于:所述淮山药X病毒的CP蛋白具有序列表SEQ.1D.N0.1的氨基酸序列，或由具有序列表SEQ.1D.N0.2的碱基序列的基因所编码。
3.根据权利要求2所述的淮山药X病毒的多克隆抗体制备方法，其特征在于:取纯化后的重组CP蛋白，采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔，以后每2周加强免疫一次，共免疫4次；首次免疫加入与蛋白等量的弗氏完全佐剂，后3次加入与蛋白等量的弗氏不完全佐剂；末次加强免疫7天后，心脏采血，分离血清；再用抗原亲和层析纯化获得该病毒外壳蛋白CP的多克隆抗体。
4.权利要求1至3所得淮山药X病毒的多克隆抗体在检测淮山药X病毒方面的应用。
5.基于权利要求1所述多克隆抗体的淮山药X病毒的ELISA检测方法。
6.根据权利要求5所述的ELISA检测方法，其特征在于包括以下步骤: (1)用ImL抗原包被缓冲液研磨0.1g淮山药新鲜叶片，9000rpm离心5min,取上清液稀释20倍，按照100 μ I/孔加入ELISA板；感染YVX的淮山药病叶为阳性对照，相应健康叶为阴性对照，37 °C孵育2h ； (2)用200μ I PBST洗涤两次后，用5%脱脂奶粉封闭30min ； (3)用200μ I PBST洗涤两次后，每个孔中加入用抗体稀释缓冲液按照1:8000稀释的多克隆抗体，100 μ I/孔，37°C孵育Ih或室温孵育3h ； (4)用200μ I PBST洗涤两次后，每个孔中加入按说明书稀释3000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG结合物，100 μ I/孔，室温孵育Ih ； (5)用200μ I PBST洗涤三次后，用TMB底物显色试剂盒进行显色，室温避光孵育25-30min，反应产物呈蓝色，每孔再加入50μ10.5Μ H2SOjS止显色，此时蓝色产物变为亮黄色，立即用酶标仪读取OD45tl的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性；
所述 PBST 含 3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl, 135mM NaCl，0.05%Tween20,pH7.4 ;所述抗原包被缓冲液为碳酸盐缓冲液，30mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6 ;所述抗体稀释缓冲液为P/oBSA, 0.01M PBS ρΗ7.2。
7.基于权利要求1所述多克隆抗体的淮山药X病毒的Westernblot检测方法。
8.根据权利要求7所述的Westernblot检测方法,其特征在于包括以下步骤: (1)用TCA/丙酮沉淀法或采用植物蛋白质提取试剂盒提取淮山药总蛋白样品，用Bradford法进行蛋白质定量,调整蛋白质浓度为2mg/mL ； (2)制备蛋白电泳凝胶，进行SDS-PAGE； (3)半干式转移:电泳结束后将凝胶割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5minX3次；预先裁好与凝胶同样大小的滤纸和PVDF膜，用甲醇浸泡Imin后，浸入转膜缓冲液中IOmin ；转膜装置从下至上依次按阳极碳板、3层3mm滤纸、PVDF膜、凝胶、3层3mm滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、PVDF膜精确对齐，每一步去除气泡，盖好阴极碳板之后接通电源，恒流ImA/cm2,转移1.5h,转移结束后,断开电源将膜取出； (4)免疫反应:用0.01M PBS洗膜，Imin ;加入封闭液,室温封闭1~2h ;弃封闭液,用0.01M PBST洗膜，5minX3次；加入用抗体稀释缓冲液按照1:5000稀释的YVX的CP蛋白多克隆抗体，室温孵育2h或4°C放置12h以上；阴性对照，以1%BSA取代ー抗，其余步骤与实验组相同；弃ー抗和1%BSA，用0.01M PBST分别洗膜，5minX4次；加入用0.01M PBS用抗体稀释缓冲液稀释1000倍的碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG结合物，平稳摇动，室温2h ;弃二抗，用0.01M PBST洗膜，5minX4次；加入BCIP/NBT显色液，显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应； 所述转膜缓冲液为 25mM Tris, 192mM glycine, 0. 01%SDS, 20%methanol, pH8. 3 ;所述0.01M PBS 含有 3. 2mM Na2HPO4,0. 5mM KH2PO4,1. 3mM KCl，135mM NaCl，pH7. 4 ;所述封闭液为5%脱脂奶粉或3%BSA。
9.基于权利要求1所述多克隆抗体的淮山药X病毒的IC-RT-PCR检测方法。
10.根据权利要求9所述的IC-RT-PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤： (1)用抗体稀释缓冲液按照1:8000稀释YVX多克隆抗体，每个1.5mL的离心管中加入100 u I稀释好的抗体，37°C孵育Ih或室温孵育3h ； (2)将淮山药叶片与含2%PVP的0.02M PBS研磨缓冲液按质量体积比0. 2%放入研钵中，研磨成叶汁匀衆，吸入I. 5mL离心管中，9000rpm离心IOmin ； (3)将步骤（I)中包被好抗体的I.5mL离心管用PBST洗两次，加入200 U I步骤（2)准备好的叶汁上清液，37°C水浴3h ； (4)移去叶汁，PBST洗3次，DEPC水洗I次，洗毕作短暂离心去除管底余液； (5)用SuperRT—步法RT-PCR试剂盒进行RT-PCR反应，检测引物为YVX-F ：5’ -CCAGGTCCATCAGTCACTTCT-3’ 和 YVX-R :5’ -CTAATCTACCAGCAGTCACTTCATA-3’，PCR 阶段设置退火温度为55°C，35个循环； (6)RT-PCR结束后，取5 u I的PCR产物用质量体积浓度I. 0%琼脂糖凝胶进行电泳检測； 所述抗体稀释缓冲液为1%BSA，0.01M PBS pH7. 2。
【文档编号】G01N33/569GK103543264SQ201310541274
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】陈保善, 邹承武, 蒙姣荣 申请人:广西大学