适配体修饰的纳米金探针及其试剂盒与在检测pdgf-bb中的应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种适配体修饰的纳米金探针，它以直径为20-30nm的纳米金球为内核，金球外表面键合有适配体链和寡核苷酸链。本发明还公开了包含上述探针的试剂盒及其在检测PDGF-BB中的应用。本发明的纳米金探针与显色剂联用能提高显色可视化检测的灵敏度，检测PDGF-BB的线性范围为6.25ng/mL-100ng/mL,检测限低，特异性好。纳米金探针的合成及修饰方法成熟，显色剂性能好，两者的联合可以使检测PDGF-BB的灵敏度大大提高，检测过程大大简化。
【专利说明】适配体修饰的纳米金探针及其试剂盒与在检测PDGF-BB中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测【技术领域】，具体涉及一种适配体修饰的纳米金探针及其试剂盒在检测roGF-ΒΒ中的应用。
【背景技术】
[0002]血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,F1DGF)是一种强效的丝裂原和重要的促肿瘤血管生成生长因子,可由多种血细胞、组织细胞和一些肿瘤细胞产生。目前对肿瘤细胞中I3DGF表达与检测的研究已成为生物医学研究领域的热点之一。适配体是具有三维空间结构能特异性识别目标蛋白质的DNA或RNA分子，合成容易，易于修饰且稳定。我们利用适配体功能化的纳米金可以实现对血小板衍生生长因子-BB(即TOGF-BB)的特异识别。
[0003]纳米金具有优良的表面催化特性，当金属离子和还原剂分子吸附到其表面时，纳米金催化氧化还原反应并在其表面形成一层金属膜。基于此原理，我们合成了适配体修饰的纳米金探针，通过其催化金属沉积实现对TOGF-BB的高灵敏，特异性可视化分析检测。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种适配体修饰的纳米金探针，用于TOGF-BB的检测。
[0005]本发明还要解决的技术问题，是提供包含上述功能化纳米金材料的试剂盒，用于PDGF-BB的检测。
[0006]本发明最后要解决的技术问题，是提供上述试剂盒在检测TOGF-BB中的应用。
[0007]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0008]一种适配体修饰的纳米金探针，它以直径为20_30nm的纳米金球为内核，金球外表面键合有适配体链和寡核苷酸链；
[0009]其中，所述的适配体链为:
[0010]5，-SH-(CH2) 6-TTTTTTCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG ；
[0011]其中，所述的寡核苷酸链为:
[0012]5，-SH- (CH2) 6-TTTTTTTTTTTTTTT-3，。
[0013]上述适配体修饰的纳米金探针的制备方法，它包括如下步骤:
[0014](I)将150mL，2.2mM的柠檬酸钠溶液煮沸，然后迅速加入lmL，25mM的HAuCl4溶液，溶液颜色先从黄色变为蓝灰色最终形成粉红色的金种，反应IOmin后将温度下降到85?950C，加入lmL25mM的HAuCl4溶液反应25?40min ;重复加入lmL25mM的HAuCl4溶液反应25?40min的步骤I?4次，最后搅拌使其自然冷却至室温，4°C保存；
[0015](2)将适配体链和寡核苷酸链按摩尔比(I?99): (I?9)加入步骤⑴得到的纳米金溶液中，静置10?24小时，适配体链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米金摩尔量之比为(100-1000):1 ；
[0016]所述的适配体链为:
[0017]5，-SH-(CH2) 6-TTTTTTCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG ；
[0018]所述的寡核苷酸链为:
[0019]5’-SH-(CH2) 6-TTTTTTTTTTTTTTT-3’ ；
[0020](3)向步骤(2)得到的混合体系中加入PBS缓冲溶液，使得混合体系中的PBS缓冲溶液的浓度为0.1XPBS，静置3?10小时；
[0021](4)向步骤(3)得到的混合体系中加入I?5mol/L氯化钠溶液，静置2?4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤I?4次，使得氯化钠的终浓度为0.1?0.3mol/L ；
[0022](5)将步骤(4)得到的混合体系静置24?72小时；
[0023](6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，取沉淀加入IXPBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2?4次，IXPBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1?5倍；最后离心得到的沉淀用I XPBSM缓冲溶液重悬即得备用探针。
[0024]步骤⑵中，适配体链和寡核苷酸链摩尔比优选为(I?10): (I?1:10)，最优选为1:1 ;静置时间优选为15?20h，最优选为18h ;适配体链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米金摩尔量之比优选为(200?300):1，最优选为288:1。
[0025]步骤(3)中，PBS缓冲溶液优选为I XPBS，即包含如下物质的水溶液:137mM NaCl，2.7mM KCl, IOmM Na2HPO4.12H20,2mM KH2PO4 ;静置时间优选为 6h。
[0026]步骤(4)中，氯化钠溶液的浓度优选为2mol/L ;氯化钠的终浓度优选为0.2mol/L ；静置时间优选为3h。
[0027]步骤(5)中，静置时间优选为48h。
[0028]步骤(6)中，所述的离心条件为10000?20000rpm条件下离心10?30分钟,优选15000条件下离心15分钟。所述的I XPBSM配方为I XPBS和lmmol/L MgCl20
[0029]上述适配体修饰的纳米金探针在制备检测TOGF-BB的试剂中的应用。
[0030]一种用于检测TOGF-BB的试剂盒，该试剂盒包含如下试剂:适配体修饰的纳米金探针、磷酸盐缓冲液、Tween-20 ,ant1-PDGF-BB抗体、PDGF-BB蛋白、氯金酸、盐酸羟胺、牛血清白蛋白、醒基片基。
[0031 ] 上述用于检测TOGF-BB的试剂盒在检测I3DGF-BB中的应用。
[0032]利用检测TOGF-BB的试剂盒检测I3DGF-BB含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤:
[0033](I)配制溶液:
[0034]稀释液:将20 X PBS用二次水稀释20倍至IXPBS ;
[0035]洗涤液:I X PBS溶液按0.05%的体积比加入吐温-20溶液；
[0036]阴性对照:将0.1g牛血清白蛋白溶解于IOOmLlXPBS溶液中，得lmg/mL BSA溶液；
[0037]封闭液:将Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLl XPBS溶液中即得10mg/mL BSA封闭液；
[0038]底物:用lmg/mL BSA配制所需浓度的anti_PDGF_BB标准样品溶液；
[0039]显色剂:10mmol/L氯金酸和2mmol/L盐酸轻胺等体积混合；[0040]探针:用IXPBSM溶液配制0.31nmol/L的适配体修饰的纳米金探针；其中，I X PBSM 配方为 I X PBS 和 lmmol/L MgCl2 ；
[0041](2)将不同浓度的ant1-PDGF-BB溶液、待测样品和阴性对照在醛基片上点样，37°C条件下固定2h;
[0042](3)每孔加入10?50 μ L封闭液，在37°C条件下封闭I?3小时，用洗涤液荡洗5?15min,洗漆3?4次,拍干；
[0043](4)在不同的孔中加入不同浓度的I3DGF-BB标准样品溶液30 μ L，在37°C条件下反应I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3?4次，拍干；在其余的孔中加入30 μ L样品溶液，在37°C条件下反应I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3?4次，拍干；
[0044](5)每孔加入0.31nmol/L适配体修饰的纳米金探针30 μ L,在37°C条件下反应I?3小时，用洗涤液荡洗5?15min，洗涤3?4次，拍干；
[0045](6)每孔加入30 μ L显色剂，避光反应I?8min，去离子水冲洗3?4次，拍干；
[0046](7)用扫描仪(Scanmaker i900)扫描，LuxScan3.0芯片图像分析软件对图像进行处理，不同浓度的I3DGF-BB标准样品溶液对应不同的灰度值，得到I3DGF-BB标准曲线，由标准曲线计算得到样品中I3DGF-BB的浓度。
[0047]有益效果:本发明的纳米金探针耦合显色剂的方法能大大提高显色检测的灵敏度，只需要通过普通的扫描仪采集信号，普适性和实用性高。此种探针的合成及修饰方法成熟，显色剂显色性能好，为蛋白质的显色分析检测提供了一种极好的方法。
[0048]本发明利用适配体分子对蛋白质的特异性识别作用实现对TOGF-BB的高灵敏特异性检测，对I3DGF-BB的分析范围为6.25ng/mL-100ng/mL,且特异性好，人免疫球蛋白IgG、血清serum没有干扰。本发明试剂盒中所采用的显色剂可替代商品化的银增强试剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0049]图1纳米金探针的紫外-可见吸收光谱图。其中，1-纳米金(AuNPs，1.80nmol/L)，2_未离心的适配体修饰的纳米金探针(Au-apt)，3-离心后适配体修饰的纳米金探针(Au-apt,0.95nmol/L)。
[0050]图2检测TOGF-BB浓度的信号相关性曲线及扫描图。
[0051]图3显色后芯片表面的扫描电子显微镜图
[0052]图4为检测TOGF-BB的特异性曲线。
【具体实施方式】
[0053]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0054]实施例1:纳米金探针的制备。
[0055](I)金纳米粒子采用柠檬酸钠与氯金酸的水热反应合成。将150mL，2.2mM的柠檬酸钠溶液煮沸。然后迅速加入lmL，25mM的HAuCl4，溶液颜色先从黄色变为蓝灰色最终形成粉红色的金种溶液，反应IOmin后将温度下降到90°C，再加入lmL，25mM的HAuCl4, 30min后反应完成。重复加入lmL25mM的HAuCl4溶液反应30min的步骤2次，最后搅拌使其自然冷却至室温，4 °C保存。
[0056](2)将适配体链和寡核苷酸链按摩尔比3:1加入步骤(I)得到的纳米金溶液中，静置18小时。适配体链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米金摩尔量之比为288。
[0057]所述的适配体链，其核苷酸序列为:
[0058]5，SH- (CH2) 6_TTTTTTCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG，其 5’ 端由巯基修饰；
[0059]所述的寡核苷酸链，其核苷酸序列为:5’ SH-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTT_3’，其5’端由疏基修饰；
[0060](3)向步骤(2)得到的混合体系中加入IXPBS (137mM NaCl, 2.7mMKCl, IOmM, Na2HPO4.12H20, 2mM KH2PO4)溶液，使 PBS 的浓度为 0.1 X，静置 6 小时。
[0061](4)向步骤(3)得到的混合体系中加入2mol/L氯化钠溶液，每隔3小时加一次氯化钠，静置，使氯化钠的终浓度为0.2mol/L。
[0062](5)将步骤(4)得到的混合体系静置48小时。
[0063](6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，沉淀加入IXPBS溶液重悬，重复离心与重悬的步骤3次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的I倍；最后离心得到的沉淀经I XPBSM重悬即得适配体修饰的纳米金探针。图1为紫外-可见吸收光谱图。
[0064]实施例2:纳米金探针的制备。
[0065](I)金纳米粒子采用柠檬酸钠与氯金酸的水热反应合成。将150mL，2.2mM的柠檬酸钠溶液煮沸。然后迅速加入lmL，25mM的HAuCl4，溶液颜色先从黄色变为蓝灰色最终形成粉红色的金种溶液，反应IOmin后将温度下降到90°C，再加入lmL，25mM的HAuCl4, 30min后反应完成。重复加入lmL25mM的HAuCl4溶液反应30min的步骤2次，最后搅拌使其自然冷
却至室温，4 °C保存。
[0066](2)将适配体链和寡核苷酸链按摩尔比1:1加入步骤(I)得到的纳米金溶液中，静置10小时。适配体链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米金摩尔量之比为100。
[0067]所述的适配体链，其核苷酸序列为:
[0068]5，SH- (CH2) 6_TTTTTTCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG，其 5，端由巯基修饰，且末端为碱基T ；
[0069]所述的寡核苷酸链，其核苷酸序列为:5’ SH-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTT_3’，其5’端由疏基修饰；
[0070](3)向步骤(2)得到的混合体系中加入IXPBS (137mM NaCl, 2.7mMKCl, IOmM, Na2HPO4.12H20, 2mM KH2PO4)溶液，使 PBS 的浓度为 0.1 X，静置 3 小时。
[0071](4)向步骤(3)得到的混合体系中加入lmol/L氯化钠溶液，静置2小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤I次，使氯化钠的终浓度为0.lmol/L。
[0072](5)将步骤(4)得到的混合体系静置24小时。
[0073](6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，沉淀加入IXPBS溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1倍；最后离心得到的沉淀经I XPBSM重悬即得适配体修饰的纳米金探针。
[0074]实施例3:纳米金探针的制备。[0075](I)金纳米粒子采用柠檬酸钠与氯金酸的水热反应合成。将150mL，2.2mM的柠檬酸钠溶液煮沸。然后迅速加入lmL，25mM的HAuCl4，溶液颜色先从黄色变为蓝灰色最终形成粉红色的金种溶液，反应IOmin后将温度下降到90°C，再加入lmL，25mM的HAuCl4, 30min后反应完成。重复加入lmL25mM的HAuCl4溶液反应30min的步骤2次，最后搅拌使其自然冷
却至室温，4 °C保存。
[0076](2)将适配体链和寡核苷酸链按摩尔比99:9加入步骤(I)得到的纳米金溶液中，静置24小时。适配体链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米金摩尔量之比为1000。
[0077]所述的适配体链，其核苷酸序列为:
[0078]5，SH- (CH2) 6_TTTTTTCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG，其 5’ 端由巯基修饰，且末端为碱基T ；
[0079]所述的寡核苷酸链，其核苷酸序列为:5’ SH-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTT_3’，其5’端由疏基修饰；
[0080](3)向步骤(2)得到的混合体系中加入IXPBS (137mM NaCl, 2.7mMKCl, IOmM, Na2HPO4.12H20, 2mM KH2PO4)溶液，使 PBS 的浓度为 0.1 X，静置 10 小时。
[0081](4)向步骤(3)得到的混合体系中加入5mol/L氯化钠溶液，静置4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤4次,使氯化钠的终浓度为0.3mol/L0
[0082](5)将步骤(4)得到的混合体系静置72小时。
[0083](6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，沉淀加入IXPBS溶液重悬，重复离心与重悬的步骤4次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的5倍；最后离心得到的沉淀经I XPBSM重悬即得适配体修饰的纳米金探针。
[0084]实施例4:用于检测TOGF-BB的试剂盒。
[0085]适配体修饰的纳米金探针实施例1?3的方法合成；
[0086]PBS (购自上海生工生物工程有限公司)及Tween-20 (购自天津科美有限公司)用于配制洗涤液；
[0087]牛血清白蛋白购自北京博奥森生物技术有限公司；
[0088]ant1-PDGF-BB 购自 Abeam, USA ；
[0089]F1DGF-BB 蛋白购自于 R&D Systems, Minneapolis, USA ；
[0090]氯金酸购自于(上海试剂一厂)；
[0091]盐酸羟胺购自于(江苏强盛功能化学股份有限公司)；
[0092]醛基片基购自于(上海百傲科技有限公司)。
[0093]所有溶液均用高纯水配制(除特殊说明)。
[0094]实施例5:检测TOGF-BB含量的方法。
[0095]利用实施例4的试剂盒检测I3DGF-BB含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤:
[0096](I)配制溶液:
[0097]稀释液:将20 X PBS用二次水稀释20倍至IXPBS ;
[0098]洗涤液:I X PBS溶液按0.05%的体积比加入吐温-20溶液；
[0099]阴性对照:将0.1g牛血清白蛋白溶解于IOOmLlXPBS溶液中，得lmg/mL BSA溶液；
[0100]封闭液:将Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLl XPBS溶液中即得10mg/mL BSA封闭液；
[0101]底物:用lmg/mL BSA配制所需浓度的anti_PDGF_BB标准样品溶液；
[0102]显色剂:10mmol/L氯金酸和2mmol/L盐酸轻胺等体积混合；
[0103]探针:用I XPBSM溶液配制0.31nmol/L的适配体修饰的纳米金探针；
[0104](2)将ant1-PDGF-BB和阴性对照物BSA在醛基片上点样，37°C条件下固定2h ；
[0105](3)每孔加入30 μ L封闭液，在37°C条件下封闭I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；
[0106](4)在不同的孔中加入1.56ng/mL-100ng/mL的PDGF-BB标准样品溶液30 μ L，在其余的孔中加入30 μ L样品溶液，在37°C条件下反应I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3?4次，拍干；
[0107](5)每孔加入0.31nmol/L适配体修饰的纳米金探针30μ L,在37°C条件下反应I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；
[0108](6)每孔加入30 μ L显色剂，避光反应7min，去离子水冲洗3次，拍干；
[0109](7)用扫描仪(Scanmaker i900)扫描，LuxScan3.0芯片图像分析软件对图像进行处理，不同浓度的I3DGF-BB标准样品溶液对应不同的灰度值，得到I3DGF-BB标准曲线，由标准曲线计算得到样品中TOGF-BB的浓度。结果见图2。
[0110]实施例6 =PDGF-BB的特异性。
[0111]试验方法:
[0112](I)配制溶液:
[0113]稀释液:将20 X PBS用二次水稀释20倍至IXPBS ;
[0114]洗涤液:I X PBS溶液按0.05%的体积比加入吐温-20溶液；
[0115]阴性对照:将0.1g牛血清白蛋白溶解于IOOmLlXPBS溶液中，得lmg/mL BSA溶液；
[0116]封闭液:将Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLl XPBS溶液中即得10mg/mL BSA封闭液；
[0117]底物:用lmg/mL BSA配制所需浓度的anti_PDGF_BB标准样品溶液；
[0118]显色剂:10mmol/L氯金酸和2mmol/L盐酸轻胺等体积混合；
[0119]探针:用IXPBS溶液配制0.31nmol/L的适配体修饰的纳米金探针；
[0120](2)将ant1-PDGF-BB和阴性对照物BSA在醛基片上点样，37°C条件下固定2h ；
[0121](3)每孔加入30 μ L BSA (10mg/mL)，在37°C条件下封闭I小时，用洗涤液荡洗5min,洗漆3次,拍干；
[0122](4)在不同的孔中分别加入 10%serum+PDGF-BB (50ng/mL)、50ng/mL PDGF-BB,10%serum>50 μ g/mL人免疫球蛋白IgG、lmg/mL BSA各30μ L,在37°C条件下反应I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；
[0123](5)每孔加入0.31nmol/L适配体修饰的纳米金探针30 μ L,在37°C条件下反应I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；
[0124](6)每孔加入30 μ L显色剂，避光反应15min，去离子水冲洗3次，拍干；
[0125](7)用扫描仪(Scanmaker i900)扫描，得到TOGF-BB特异性的数据。结果见图4。
[0126]本发明将纳米金探针应用于I3DGF-BB的分析检测中，当I3DGF-BB的浓度在6.25ng/mL-lOOng/mL之间，荧光信号强度与浓度具有很好的相关性，相关系数为0.9855。纳米金探针与我们自制的显色剂耦合能显著增强显色信号。在同等的条件下，我们将商品化的银增强试剂与纳米金探针联用，其线性范围也在6.25ng/mL-100ng/mL之间，说明我们自制的显色剂可以替代商品化的银增强试剂。而且此显色体系在复杂生物样本中也具有很好的特异性，不受复杂体系(如人血清)中其它因素的干扰。
【权利要求】
1.一种适配体修饰的纳米金探针，其特征在于，它以直径为20-30nm的纳米金球为内核，金球外表面键合有适配体链和寡核苷酸链； 其中，所述的适配体链为:
5’ -SH-(CH2) 6-TTTTTTCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG ； 其中，所述的寡核苷酸链为:
5’ -SH-(CH2) 6-ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ-3?。
2.权利要求1所述的适配体修饰的纳米金探针的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤: (1)将150mL，2.2mM的柠檬酸钠溶液煮沸，然后迅速加入lmL，25mM的HAuCl4溶液，溶液颜色先从黄色变为蓝灰色最终形成粉红色的金种，反应10min后将温度下降到85~95°C，加入lmL25mM的HAuCl4溶液反应2 5~40min ;重复加入lmL25mM的HAuCl4溶液反应25~40min的步骤I~4次，最后搅拌使其自然冷却至室温，4°C保存； (2)将适配体链和寡核苷酸链按摩尔比(I~99): (I~9)加入步骤(1)得到的纳米金溶液中，静置10~24小时，适配体链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米金摩尔量之比为(100-1000):1 ； 所述的适配体链为:
5’ -SH-(CH2) 6-TTTTTTCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG ； 所述的寡核苷酸链为:
5’ -SH-(CH2) 6-ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ-3?； (3)向步骤⑵得到的混合体系中加入PBS缓冲溶液，使得混合体系中的PBS缓冲溶液的浓度为0.1XPBS，静置3~10小时； (4)向步骤(3)得到的混合体系中加入I~5mol/L氯化钠溶液，静置2~4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤I~4次，使得氯化钠的终浓度为0.1~0.3mol/L ； (5)将步骤(4)得到的混合体系静置24~72小时； (6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，取沉淀加入IXPBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2~4次，IXPBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1~5倍；最后离心得到的沉淀用I XPBSM缓冲溶液重悬即得备用探针。
3.根据权利要求2所述的适配体修饰的纳米金探针的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的离心条件为10000~20000rpm条件下离心10~30分钟。
4.权利要求1所述的适配体修饰的纳米金探针在制备检测I3DGF-BB的试剂中的应用。
5.一种用于检测I3DGF-BB的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如下试剂:适配体修饰的纳米金探针、磷酸盐缓冲液、Tween-20、ant1-PDGF-BB抗体、PDGF-BB蛋白、氯金酸、盐酸羟胺、牛血清白蛋白、醛基片基。
6.权利要求5所述的用于检测I3DGF-BB的试剂盒在检测I3DGF-BB中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用检测I3DGF-BB的试剂盒检测I3DGF-BB含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤: (I)配制溶液: 稀释液:将20 X PBS用二次水稀释20倍至IXPBS ； 洗涤液:1 XPBS溶液按0.05%的体积比加入吐温-20溶液；阴性对照:将0.1g牛血清白蛋白溶解于IOOmLlXPBS溶液中，得lmg/mL BSA溶液； 封闭液:将Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLlXPBS溶液中即得10mg/mL BSA封闭液； 底物:用lmg/mL BSA配制所需浓度的anti_PDGF_BB标准样品溶液； 显色剂:10mmol/L氯金酸和2mmol/L盐酸轻胺等体积混合； 探针:用I XPBSM溶液配制0.31nmol/L的适配体修饰的纳米金探针； (2)将不同浓度的ant1-PDGF-BB溶液、待测样品和阴性对照在醛基片上点样，37°C条件下固定2h ； (3)每孔加入10~50μ L封闭液，在37°C条件下封闭I~3小时，用洗涤液荡洗5~15min,洗漆3~4次,拍干； (4)在不同的孔中加入不同浓度的TOGF-BB标准样品溶液30μL，在37°C条件下反应I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3~4次，拍干；在其余的孔中加入30 μ L样品溶液，在37°C条件下反应I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3~4次，拍干； (5)每孔加入0.31nmol/L适配体修饰的纳米金探针30 μ L,在37°C条件下反应I~3小时，用洗涤液荡洗5~15min，洗涤3~4次，拍干； (6)每孔加入30μ L显色剂，避光反应I~8min，去离子水冲洗3~4次，拍干； (7)用扫描仪扫描，LuxScan3.0芯片图像分析软件对图像进行处理，不同浓度的PDGF-BB标准样品溶液对应不同的灰度值，得到I3DGF-BB标准曲线，由标准曲线计算得到样品中TOGF-BB的浓度。
【文档编号】G01N21/78GK103529197SQ201310517588
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】许丹科, 胡红婷, 李慧, 李伟, 赵亚菊, 董诗羽, 羌维兵 申请人:南京大学