一种牛病毒性腹泻病毒内标分型荧光pcr检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种牛病毒性腹泻病毒内标分型荧光PCR检测试剂盒及其制备。通过引物设计，用单重PCR扩增，获得了BVDV?I、BVDV?II和监控内标的PCR模板，通过引物设计和PCR扩增，并对反应条件进行了优化，建立了BVDV内标分型荧光PCR检测检测体系，实现了对BVDV?I和BVDV?II单独检测或同步检测，并可对检测结果进行质量监测。制备的检测试剂盒由cDNA合成体系和SYBR荧光PCR反应扩增体系两部分组成。该试剂盒对三种基因的最低检测限为102拷贝，且具有较好的特异性和可重复性，确保检测质量，具有较好的应用价值。
【专利说明】—种牛病毒性腹泻病毒内标分型荧光PCR检测试剂盒及其制备
发明领域
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体的，本发明涉及一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)内标分型荧光PCR检测试剂盒及其制备的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]BVDV为黄病毒科痕病毒属成员，对养牛业的危害性较大。我国现有的检测标准中，对BVDV的检测方法有基于细胞培养技术的荧光抗体法、免疫过氧化物酶单层检测法、微量血清中和试验、抗原捕获ELISA和PCR，前三种检测方法操作复杂，且对人员和环境的要求较高，不便于大批量进出口检验检疫的应用。抗原捕获ELISA检测方法灵敏度较低。随着分子生物学技术的快速发展，已有很多采用PCR或荧光PCR法对该病进行检测的报道，这些方法有效的提高了检测方法的灵敏度和可操作性。
[0003]已有的研究表明，由于样品中存在大量复杂的未知成分，以及样品处理过程中，一些物质的残留会影响PCR扩增，或样品处理过程中核酸的丢失，均可使检测测得的灵敏度降低甚至造成假阴性结果。已有许多学者对如何监控这些影响因素，校正PCR反应的结果做过大量的工作，其中采用在PCR反应体系中加入指示假阴性的扩增内标(internalamplification control, IAC)已得到普遍认可,如在反应体系中加入看家基因或者进行人工质粒合成等。磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)广泛存在于真核和原核生物的细胞核、细胞质和生物膜中，具有高度保守性，可用来作为内标监控基因，该基因可同时参与核酸提取和RT-PCR扩增的全过程。
[0004]经检索，国内外也未见有关检测灵敏度高，特异性好，操作方便，且通过内标的添加，指示并校准假阴性结果，也未见能够同时检测牛病毒性腹泻病毒基因I型(BVDV I)和牛病毒性腹泻病毒基因II型(BVDV II)的内标分型荧光PCR方法的报道。因此，探索和研究检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校准假阴性结果的方法，对于及时准确有效的检测BVDV，保护畜牧业健康发展、促进我国农产品出口和保护我国在国际贸易中的良好形象等方面均具有重要意义。
【发明内容】
[0005]针对目前国内外未见有关检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校正假阴性结果，提高检测结果的准确率，也未见能够同时对BVDV分型，且可对检测结果进行质量监控的荧光PCR检测方法，本发明提供一种BVDV内标分型荧光PCR检测试剂盒，旨在于提供一种检测灵敏度高、特异性好、试验周期短，且能够指示并校正假阴性结果，同时对BVDV I和BVDV II进行检测，并提高检测结果准确性的内标分型荧光PCR检测方法。通过引物设计，用单重PCR扩增，获得了 BVDV I,BVDV II和监控内标的PCR模板，并对反应条件进行了优化，建立了 BVDV`内标分型荧光PCR检测检测体系，实现了对BVDV I和BVDV II单独检测或同步检测，且可通过内标对检测结果进行质量监控，从而实现对牛BVDV的灵敏、高效、快速、准确检测。
[0006]本发明的主要技术方案:通过在双重SYBR Green I荧光PCR反应体系中引入指示假阴性的内标，通过引物设计和PCR扩增，经反应条件优化，构建了能够对BVDV I和BVDVII进行同步检测，且含有对反应体系进行监控的内标SYBR Green I荧光PCR方法，并制备了检测试剂盒，试剂盒由cDNA合成体系和SYBR荧光PCR反应体系两部分组成，cDNA合成体系包括:引物混合液(含引物BRl、BR2和GR)、cDNA合成buffer、M-MLV和RNase抑制剂；SYBR荧光PCR反应体系包括:引物混合液(含8?1、8町、8?2、81?2、6?、610、2\3￥81? PremixDimer Eraser和DEPC水。从而建立了 BVDV内标分型荧光PCR检测方法，采用在双重荧光PCR反应体系中引入IAC，通过引物设计和PCR扩增，经反应条件优化，成功的建立了含有内标的荧光分型PCR反应体系，可以对核酸提取和PCR扩增过程进行监测，利用该试剂盒对三种基因的最低检测限为IO2拷贝，且具有较好的特异性和可重复性，并可对检测结果进行质量监控，确保检测质量，具有较好的应用价值。
[0007]本发明具体提 供一种BVDV内标分型荧光PCR检测试剂盒，所述的内标分型荧光PCR检测试剂盒通过如下具体方法获得:
[0008](I)引物的设计与合成:
[0009]根据GenBank 登录号为 M31182.1 的 BVDV I 和登录号为 AY149216.1 的 BVDV II的5' -UTR保守区，登录号为NM001034034.2牛GAPDH的mRNA保守区，各设计一对特异性引物，扩增的目的片段长度分别为127bp、169bp、152bp。
[0010](2)模板RNA的制备与阳性重组质粒的构建:
[0011]全血、血清、组织、肛拭子生物组织材料用Trizol常规试剂进行提取；牛奶经12000rpm离心lOmin，取沉淀加PBS稀释后用Trizol常规方法进行提取；提取的核酸于-20°C保存备用。
[0012]本发明中，以BVDV I的RNA为模板，反转录成cDNA后，用引物BFl和BRl扩增出长度为127bp的片段；以BVDV II的RNA为模板，反转录成cDNA后，用引物BF2和BR2扩增出长度为169bp的片段；以牛GAPDH的mRNA为模板，反转录成cDNA后，用引物GF和GR扩增出长度为152bp的片段。以上扩增片段分别克隆至PMD18-T载体，构建阳性重组质粒。
[0013](3)内标分型荧光PCR检测体系建立:
[0014]单重条件优化，以两步法进行，第一步，引物BR1、BR2和GR的浓度分别为0.6 μ M、
0.75口]?和0.4 4]\1，1?應模板1(^1^701:水浴101^11，置冰上21^11 ;取以上反应溶液6 μ L，加入50u M-MLV和IOu RNase抑制剂，加入dNTPs终浓度为0.5mM,补去离子水至10 μ L, 42°C保温lh，完成cDNA制备；第二步，20μL体系，取第一步所得cDNA2-5μL，BVDV 1、BVDV II和GAPDH三种基因上下游引物终浓度分别为0.05μΜ、0.1μΜ、0.15 μ Μ、0.2 μ Μ、0.25 μ Μ、
0.3 μ Μ、0.35 μ M和 0.4μ M进行优化，2 X SYBR Premix Dimer EraserlO μ L，荧光定量 PCR反应程序为:95°C预变性2min ;95°C变性10s，56°C退火30s，72°C延伸30s，循环40次，在每个循环的最后一步收集荧光，并制作融解曲线。
[0015]本发明经过二重荧光PCR条件的优化，在单重荧光PCR最佳条件基础上，固定一对引物用量，确定另一对引物的用量。
[0016]本发明经过内标分型荧光PCR条件的优化，在二重荧光PCR最佳反应条件的基础上，优化第三对引物用量，获得最佳扩增条件。[0017]优化后的检测体系为，第一步，25 μ L反转录体系，引物BR1、BR2和GR的浓度分别为 0.6μΜ、0.75 μ M 0.4 μ Μ, RNA 模板 10μ L，70°C水浴 lOmin，置冰上 2min，取以上反应溶液6 μ L，加入50u M-MLV和IOu RNase抑制剂，加入dNTPs终浓度为0.5mM,补去离子水至1(^匕421:保温111，完成00嫩制备；第二步，2(^1^ SYBR荧光PCR体系，BVDV 1、BVDV
II和 GAPDH 上下游引物浓度分别为 0.1μΜ、0.35 μ M 和 0.1 μ Μ, 2 X SYBR Premix DimerEraserlOy L,试剂扩增条件:95°C,2min ；95 °C, 10s, 56 °C, 30s, 72 °C, 30s,40 个循环，每个循环最后一步检测荧光，制备融解曲线。BVDV 1、BVDV II及GAPDH的融解温度分别为84.6±0.3°C、81.4±0.3°C>87.0±0.3°C。
[0018](4)试剂盒的制备:
[0019]根据本专业通用做法，本发明按可进行50份样品扩增量组装检测试剂盒，试剂盒由cDNA合成体系和SYBR荧光PCR反应体系两部分组成:一是cDNA合成体系:含引物BR130 μ Μ, BR237.5 μ M, GR20 μ M 引物混合液 250 μ L, cDNA 合成 buffer 125 μ L, buffer 含Tris-HC1200mM、KC1300mM、MgCl212mM、DTT40mM、dNTP2mM, 200U / μ L 的 M-MLV12.5 μ L,40U / μ L的RNase抑制剂12.5μ L ; 二是SYBR荧光PCR反应体系:含BFl和BRl均为
0.4 μ M，BF2 和 BR2 均为 L 4 μ M，GF 和 GR 均为 0.4 μ M 引物混合液 700 μ L，2 X SYBR PremixDimer Eraser500μ L ；DEPC 水 1.0mL。
[0020]试剂盒反操作方法:第一步，cDNA合成，引物混合液5 μ L，RNAlO μ L，补DEPC水至25“1^，701:水浴101^11，置冰上21^11，取上述反应液6 4 1^加入0.25μ LM_MLV、0.25 μ LRNase抑制剂和cDNA合成buffer2.5μ L，补DEPC水至10μ L，42°C保温lh，完成cDNA制备；第二步，内标分型荧光PCR体系20yL，PCR反应混合液5μ L，2XSYBR Premix DimerEraserlO μ L, cDNA2 μ L,扩增条件:95°C，2min ；95°C，10s, 56°C，30s, 72°C，30s, 40 个循环，每个循环最后一步检测荧光，制备融解曲线。BVDV I,BVDV II及GAPDH的融解温度分别为84.6±0.3°C、81.4±0.3°C>87.0±0.3°C。
[0021]本发明通过对BVDV内标分型荧光PCR检测试剂盒的特异性、灵敏度和重复性进行确证，通过对模板提取和RT-PCR扩增过程进行监测，证明了上述步骤制备的BVDV内标分型荧光PCR检测试剂盒具有检测灵敏度高、特异性好、试验周期短，且能够指示并校正假阴性结果，确保检测结果的准确性。
[0022]进一步，对本发明制备的试剂盒进行了应用，用本发明提供的试剂盒分别对口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)、边界病毒(BDV)和猪瘟病毒(CSFV)核酸反转录后进行扩增，结果表明方法具有较好的特异性。
[0023]采用本发明制备的试剂盒分别对108_10°拷贝的三种阳性重组质粒进行扩增，内标分型荧光PCR对三种基因的最低检测限为IO2拷贝；同时对已知滴度的BVDV I和BVDVII混合物进行扩增，该多重荧光PCR对两种病毒的检测灵敏度均为KT1TCID5c^
[0024]采用本发明制备的试剂盒分别对BVDV 1、BVDV II和GAPDH的阳性质粒进行三次重复性检测，结果表明，该方法具有很好的重复性。
[0025]通过实施本发明具体的
【发明内容】
，可以达到以下有益效果:
[0026](I)检测时间短:采用传统方法的检测时间至少需要在5天上，常规单重PCR检测对两种病的时间至少需要I天，采用本发明提供的试剂盒检测时间包括样品前处理到获得检测结果在3小时之内，缩短`了检测时间。[0027](2)检测灵敏度高:本发明对三种阳性质粒的最低检测限为IO2拷贝，对BVDV I和BVDV II的检测灵敏度均为KT1TCID5ci，具有较好的灵敏度。
[0028](3)特异性好:分别对FMDV、BTV、BDV、CSFV核酸反转录后进行扩增，结果表明，各引物对各自模板具有较好的特异性。
[0029](4)重复性好:用建立的内标分型荧光PCR方法分别对BVDV 1、BVDV II和GAPDH的阳性质粒进行三次重复性检测，结果表明，该方法具有很好的重复性。
[0030](5)污染少:与常规单重PCR检测相比，本发明提供的方法免去了电泳的过程，减少了过多操作过程造成的污染。
[0031](6)成本低:使用的试剂为分子生物学常用试剂，价格便宜，易于采购，用量少。
[0032](7)内标设计合理=GAPDH广泛存在于真核和原核生物的细胞核、细胞质和生物膜中，具有高度保守性，可用来作为内标监控基因，该基因可同时参与核酸提取和RT-PCR扩增的全过程。本实验通过对牛的不同组织样品提取核酸对GAPDH的mRNA经反转录后扩增，也均证明了该目的片段的稳定性。所设计的引物具有较好的特异性，经反应条件的优化，能够保证内标片段与两目的基因共扩增的进行，且内标基因的扩增不影响检测的灵敏度，从而通过内标的扩增可对模板提取和PCR扩增的全过程进行监控。
[0033](8)实用价值高:本发明实现对试验过程实施监测，有效的解决了现有技术传统检测方法中存在的假阴性结果，可以对实验室进行质量监控，确保检测结果的准确性。
[0034](9)应用效果好:采用本发明对临床收集的506份样品用该体系进行检测，均得到预期结果。
[0035](10)借鉴意义大:采用本发明，为相关动物病检验检疫技术的研究提供了较好的借鉴意义，并为规范检测试剂向标准化水平的发展具有指导借鉴意义。
[0036](11)应用前景广阔:本发明能够广泛应用于出入境检验检疫部门、畜牧兽医部门和养殖单位，为疫病的有效防控具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1所示为内标分型荧光PCR产物电泳结果，其中，A中I为BVDV I扩增片段的电泳结果，片段大小为127p，B中I为BVDV II扩增片段的电泳结果，片段大小为169bp，C中I为GAPDH扩增片段的电泳结果，片段大小为152bp ;A、B、C中M均为DL2000DNA标准。
[0038]图2所示为内标分型荧光PCR的特异性试验结果，其中，I为FMDV，2为BTV，3为BDV，4为CSFV，5为空白对照。
[0039]图3所示内标多重SYBR Green I荧光PCR灵敏度检测结果，其中，左图动力学曲线(以BVDV I为例，1-8依次为108-10°拷贝的BVDV I阳性质粒)，右图为含量为IO8-1Oq拷贝的三种阳性质粒等量混合物扩增溶解曲线。
[0040]图4所示为内标分型荧光PCR重复性试验结果，其中，I为内标分型荧光PCR方法分别对BVDV I阳性质粒进行三次重复性检测，2为阴性对照。
【具体实施方式】
[0041]下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施。
[0042]本发明中参照GenBank登录号为M31182.1的BVDV I和登录号为AY149216.1的BVDV II的Y -UTR保守区，登录号为NM001034034.2牛GAPDH的mRNA保守区，各设计一对特异性引物，扩增的目的片段长度分别为127bp、169bp、152bp。
[0043]本发明中选用的阳性核酸、样品:BVDV I型Oregon C24V标准毒株种毒、DH5 α菌株及FMDV、BTV、BDV和CSFV核酸保存于新疆出入境检验检疫局技术中心。MDBK细胞、BVDVII279株由美国Ohio动物疾控中心张彦教授赠送.，全血、血清、组织、肛拭子等样品采自南北疆不同地区的奶牛场。以上样品本领域普通技术人员也可获得。
[0044]本发明中选用的主要试剂=M-MLV反转录酶、RNase抑制剂、PMD18-T载体、2 X SYBRPremix Dimer Eraser购自大连宝生物工程(大连)有限公司，Trizol、DL2000DNA Maker、dNTPs Mixture、Taq酶(2.5U / μ L)、高纯质粒小量制备试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，DEPC水购自鼎国公司。本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
[0045]实施例一:模板的制备与阳性重组质粒的构建
[0046]1.引物和探针的设计与合成
[0047]本发明的引物信息见表1。其中，参照GenBank登录号为M31182.1的BVDV I和登录号为AY149216.1的BVDV II的5' -UTR保守区，登录号为NM001034034.2牛GAPDH的mRNA保守区，各设计一对特异性引物，扩增的目的片段长度分别为127bp、169bp、152bp。具体参见附后的基因序列表。
[0048]表1内标分型荧光PCR引物设计结果
[0049]
【权利要求】
1.一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)内标分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒由cDNA合成体系和SYBR荧光PCR反应扩增体系两部分组成: (1)cDNA合成体系:引物混合液250 μ L，引物混合液含引物BR130 μ M，BR237.5 μ Μ，GR20 μ M, cDNA 合成 bufferl25yL，buffer 含 Tris-HC1200mM、KC1300mM、MgCl212mM、DTT40mM、dNTP2mM, 200U / μ L 的 M-MLV12.5 μ L，40U / μ L 的 RNase 抑制剂 12.5 μ L ; ⑵SYBR荧光PCR反应体系:引物混合液700 μ L，引物混合液含BFl和BRl均为 0.4 μ M、BF2 和 BR2 均为 1.4 μ M、GF 和 GR 均为 0.4 μ Μ，2 X SYBR Premix DimerEraser500μ L ；DEPC 水 1.0mL。
2.如权利要求1所述BVDV内标分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所用的检测引物为: (1)BVDVI检测引物
上游引物(BFl):CGAGATGCCACGTGGACG ；
下游引物(BRl):TACAGTGGGCCTCTGCAGC ； 可以扩增GeneBank登录号为M31182.1，226-352位BVDV 15' -UTR区的保守序列； (2)BVDVII检测引物
上游引物(BF2):TTGCATGGGTGAAAGCGC ；
下游引物(BR2):GTTCCACAACACCTGCTGG ； 可以扩增GeneBank登录号为AY149216.1，283-451位BVDV25' -UTR区的保守序列； (3)GAPDH内标检测引物
上游引物(GF):TCAGCAAAGTATAAACCGATAGC ；
下游引物(GR):CAATCTCTATGGCCCTCGA ； 可以扩增GeneBank登录号为NM001034034.2，514-665位牛GAPDH的mRNA特异性核苷酸序列。
3.如权利要求1所述BVDV内标分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，BVDV内标分型荧光PCR检测试剂盒具体检测方法为: (1)内标多重PCR扩增 第一步:cDNA合成引物混合液5yL，RNAlO μ L，补DEPC水至25 μ L，70°C水浴lOmin，置冰上2min,取上述反应液6 μ L加入0.25 μ L M_MLV、0.25 μ LRNase抑制剂和cDNA合成buffer2.5 μ L，补 DEPC 水至 10uL，42°C 保温 lh，完成 cDNA 制备；第二步:SYBR 荧光 PCR体系为 20 μ L，引物混合液 5 μ L，2 X SYBR Premix Dimer EraserlOuL, cDNA2yL，扩增条件:95°C，2min ;95 °C，10s，56 °C，30s，72 °C，30s，40个循环，每个循环最后一步检测荧光，制备融解曲线。BVDV1、BVDV2及GAPDH的融解温度分别为84.6±0.3°C、81.4±0.3°C、.87.0±0.3°C ； (2)检测结果分析 如果目标模板和内标模板均能得到目的溶解曲线，表明反应体系正常，被检样品为阳性； 如果仅有内标溶解曲线，表明被检样品为阴性； 如果目的基因和内标基因均无扩增溶解曲线，表明反应体系中有抑制成分或核酸丢失，需要重新提取或进一步纯化核酸后再进行PCR反应。
【文档编号】G01N21/64GK103725796SQ201310516849
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】冉多良, 季新成, 王克栋, 史茜, 刘建华, 王科珂 申请人:新疆农业大学, 新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心