血小板源性生长因子受体β检测试剂盒及其用途
【专利摘要】本发明属于生物医学【技术领域】，具体涉及血小板源性生长因子受体β检测试剂盒及其用途。本发明的目的是为非肌层侵袭性膀胱癌的预后分析提供一种新选择。本发明的技术方案是血小板源性生长因子受体β检测试剂盒，包含能特异识别尿液中肿瘤蛋白标志物血小板源性生长因子受体β的检测剂和捕捉剂。本发明的血小板源性生长因子受体β检测试剂盒将会对临床判断膀胱癌患者的预后具有重要作用，肌层侵袭性膀胱癌的预后分析提供一种新选择。
【专利说明】血小板源性生长因子受体β检测试剂盒及其用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学【技术领域】，具体涉及血小板源性生长因子受体β检测试剂盒及其用途。
【背景技术】
[0002]泌尿系统的微环境情况对于泌尿系统肿瘤的发生和演进具有重要作用。尿液蛋白能够反映泌尿系统的微环境情况，而尿液来源简单方便无损伤，病人容易接受，无不适感，没有禁忌症。因此尿液是一种理想的用于泌尿系统疾病诊断的生物样品。
[0003]目前临床上通过检测尿液的各项生化指标来反映泌尿系统功能的改变，协助临床诊疗。但这些指标是不能对泌尿系统肿瘤的发生或发展给予提示。对此，大量的研究集中在尿液中寻找一些疾病相关蛋白标志物，或能够早期灵敏地提示泌尿系统肿瘤的发生并对其预后提供参考。近年来，有文献报道了一些蛋白标志物。然而，由于尿液蛋白的来源十分复杂，并且受环境饮食等因素影响，生理波动十分巨大，从而导致了这些疾病相关蛋白标志物由于特异性和稳定性等问题都没有被临床广泛应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为非肌层侵袭性膀胱癌的预后分析提供一种新选择。
[0005]本发明的技术方案是血小板源性生长因子受体β检测试剂盒，包含能特异识别尿液中肿瘤蛋白标志物I3DGFRB的检测剂和捕捉剂。
[0006]具体的，所述的捕捉剂为人TOGFRB蛋白抗体。
[0007]进一步的，所述的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。
[0008]具体的，所述的检测剂为可检测的标记物。
[0009]进一步的，所述的可检测的标记物成份包括酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质或放射活性物质。
[0010]进一步的，所述的酶是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、beta —半乳糖酶或乙酰胆碱醋酶。
[0011]进一步的，所述的辅基为链霉菌抗生物素蛋白/生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素蛋白。
[0012]进一步的，所述的荧光物质为伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸醋、若丹明、丹磺酰氯或藻红蛋白。
[0013]进一步的，所述的发光物质为发光氨。
[0014]进一步的，所述的生物发光物质为荧光素酶、荧光素或水母发光蛋白。
[0015]进一步的，所述的放射活性物质为1251、35S、14C、3H或52Mg。
[0016]本发明还提供了所述试剂盒在非肌层侵袭性膀胱癌预后分析中的用途。
[0017]上述捕捉剂可以和TOGFRB蛋白分装，也可以偶联。
[0018]本发明的检测样品为非肌层侵袭性膀胱癌患者的尿液；上述检测试剂盒还含有必要的检测所需的稀释试剂或缓冲试剂，及用作诊断标准用途的特定浓度的TOGFRB蛋白标准品。
[0019]上述抗体可通过商业途径获得，还可以通过抗体制备的常规方法来完成，如通过重组方法制备的杭体，如噬菌体展示抗体，从转基因动物(如小鼠)中分离的抗体，用转入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体，从重组组合抗体文库中分离的抗体。此外，也可以通过表达和纯化上述人源TOGFRB蛋白，用其免疫动物以获得免疫血清，再用常规的方法纯化血清中的抗体而获得。
[0020]制备本发明检测试剂盒，可以通过市场商业途径获得试剂盒中的捕捉剂、和必要的稀释缓冲液，其中本发明的实施例中的捕捉试剂采用的是商业来源的特异抗体，当然也可以按常规抗体制备的方法制备得到。上述试剂盒的各组分只需常规使用，无需特别操作，可以按照各组成试剂使用说明来进行或按照常规实验方法操作，本领域技术人员能够结合样品的特点正确使用检测试剂盒。
[0021]上述TOGFRB蛋白的识别检测载体不限于试剂盒的方式，其它检测载体如蛋白芯片、检测试纸等也可以被用来检测上述蛋白标志物。
[0022]上述TOGFRB蛋白具有制备用于非肌层侵袭性膀胱癌预后分析的特异抗体的用途，利用其特异抗体可以制备用于非肌层侵袭性膀胱癌预后判断的试剂盒、蛋白芯片或检测试纸等检测产品。
[0023]本发明通过对大规模健康人群尿液进行蛋白质组学系统分析、GO分析，肿瘤相关蛋白间相互作用(PPI)网络分析，并通过酶联免疫吸附试验验证，最终寻找到了 TOGFRB作为非肌层侵袭性膀胱癌复发的标志蛋白。本发明的TOGFRB检测试剂盒将会对临床判断膀胱癌患者的预后具有重要作用，肌层侵袭性膀胱癌的预后分析提供一种新选择，并将产生极大的市场价值。本发明利用生物化学试验来分析非肌层侵袭性膀胱癌患者尿液中的PDGFRB蛋白标志物，达到预存膀胱癌复发可能性的目的，检测方法独特，特异性高，因此具有极大的市场前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为通过蛋白质组系统分析健康人群尿液流程图。其中:HPLC，高效液相色谱；丽，分子量；RP，反相色谱；MS，质谱；LC，液相色谱；MARs，高丰度蛋白去除系统；CHIP，微流控芯片；SCX，强阳离子交换.[0025]图2为选取的鉴定出具有4个以上独特肽段或10个以上光谱数据的592个高丰度蛋白，通过Cytoscape软件进行BinGOplug-1n分析后,其中373个蛋白标记为细胞外蛋白或胞浆蛋白。
[0026]图3为上述373个蛋白通过STRING分析绘制出包含有312个节点，与1779个相互作用的蛋白-蛋白间相互作用网络。
[0027]图4 为通过 Cytoscape 及 ClueGO+Cluepediaplug-1n 软件对 KEGG 数据库中的 6个肿瘤相关关键词对上述蛋白-蛋白间相互作用网络进行分析检索。
[0028]图5为通过STRING软件构建的包含15个肿瘤相关尿蛋白的蛋白_蛋白间相互作用网络。
[0029]图6为酶联免疫吸附法检测膀胱癌患者电切术前及术后尿液TOGFRB水平。[0030]图7为术后3年内膀胱复发患者和未复发患者尿液TOGFRB蛋白水平。
[0031]图8为TOGFRB作为膀胱癌复发的检测指标的受试者工作曲线(R0C)。
[0032]图9为TOGFRB结合患者年龄、肿瘤直径、癌灶数量等临床指标后的受试者工作曲线(ROC)。
【具体实施方式】
[0033]发明人经过对大规模健康人群尿液样品进行蛋白质组学系统分析、肿瘤相关蛋白间相互作用(PPI)网络分析，筛选出 APC，APC2, CDHl，C0L4A1, C0L4A2, C0L4A3, C0L4A6,CSF1R, CTNNA3, EGF, FGFR2, FNl, KLK3, LAMCl 和 PDGFRB 这 15 个尿液中高丰度的肿瘤相关蛋白。进一步研究通过对185名非肌层侵袭性膀胱癌患者尿液中TOGFRB表达水平的ELISA检测，以及对患者进行为期3年的随访，证实了尿液中TOGFRB蛋白相对浓度与非肌层侵袭性膀胱癌的复发关系密切。
[0034]血小板衍生生长因子受体(platelet-derivedgrowthfactorreceptor,PDGFR)属受体酪氨酸激酶跨膜糖蛋白二聚体分子，在正常的内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞以及神经细胞等多种细胞中均有分布，且在多种人肿瘤细胞呈高表达。PDGFR主要包含两种结构相似的受体亚型I3DGFR-a (TOGFRA)和TOGFR-β (PDGFRB)0 二聚体的配体分子使得与之结合的受体分子也形成同源或异源二聚体。
[0035]PDGFR与相应配体发生特异性结合使其二聚化，并导致I3DGFR的自体磷酸化和胞内酪氨酸激酶激活，酪氨酸残基暴露SH2结构域/ PTB结构域结合位点和底物蛋白分子结合，从而激活细胞内信号转导通路。TOGFR的两个亚型与配体结合后可诱导细胞出现边缘波动现象和应力纤维的消失、调节钙磷代谢、促进细胞的趋化及细胞间信号交流等作用。PDGFR的过度激活可促进肿瘤细胞的增殖、转化、迁移，并增强肿瘤血管生成作用，对肿瘤的发生、发展及侵袭具有重要作用。
[0036]发明人不仅通过实验验证了尿液中的TOGFRB作为预测膀胱癌复发可能性及预后判断的可行性，且提出了其诊断标准并开发相应检测试剂盒。
[0037]为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及有益效果，下面并结合附图及较佳实施例进行说明。通过生物信息学分析寻找到尿蛋白中肿瘤相关蛋白标志物的过程，以及膀胱癌复发患者尿液中出现的特异性I3DGFRB表达水平改变，与应用免疫酶联吸附的方法识别其改变的实验结果，从而更好的解释本发明提出的TOGFR作为一种新的生物学标志用于膀胱癌预后判断的技术方案。
[0038]实施例1尿蛋白中肿瘤相关蛋白标志物的筛选
[0039]选取健康人群男性女性各100例，取其尿液标本，通过4不同蛋白质组学分离方法(图1)，在健康人群尿液中共鉴定出1641个高可信度蛋白(表I)。选取鉴定出的独特肽段多于4个或谱数目多于10个的高丰度蛋白，共592个。
[0040]通过Cytoscape软件对592个高丰度蛋白进行BinGOplug-1n分析后，其中373个蛋白标记为细胞外蛋白或胞浆蛋白(图2)。进一步通过STRING分析绘制出包含有312个节点，与1779个相互作用的蛋白-蛋白间相互作用网络(图3)。通过Cytoscape及ClueGO+Cluepediaplug-1n软件对KEGG数据库中的6个肿瘤相关关键词对上述蛋白-蛋白间相互作用网络进行分析检索，并最终通过STRING软件构建的包含15个肿瘤相关尿蛋白的蛋白-蛋白间相互作用网络(表2，图5)。
[0041]表1在健康人群尿液中共鉴定出1641个高可信度蛋白技术方法
[0042]
【权利要求】
1.血小板源性生长因子受体3检测试剂盒，其特征在于:包含能特异识别尿液中肿瘤蛋白标志物血小板源性生长因子受体3的检测剂和捕捉剂。
2.如权利要求1所述的血小板源性生长因子受体P检测试剂盒，其特征在于:所述的捕捉剂为人血小板源性生长因子受体P蛋白抗体。
3.如权利要求2所述的血小板源性生长因子受体P检测试剂盒，其特征在于:所述的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。
4.如权利要求1?3任一项所述的血小板源性生长因子受体P检测试剂盒，其特征在于:所述的检测剂为可检测的标记物。
5.如权利要求4所述的血小板源性生长因子受体P检测试剂盒，其特征在于:所述的可检测的标记物成份包括酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质或放射活性物质。
6.如权利要求5所述的血小板源性生长因子受体P检测试剂盒，其特征在于:所述的酶是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、3 -半乳糖酶或乙酰胆碱醋酶。
7.如权利要求5所述的血小板源性生长因子受体P检测试剂盒，其特征在于:所述的辅基为链霉菌抗生物素蛋白/生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素蛋白。
8.如权利要求5所述的血小板源性生长因子受体P检测试剂盒，其特征在于:所述的荧光物质为伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸醋、若丹明、丹磺酰氯或藻红蛋白。
9.如权利要求5所述的血小板源性生长因子受体P检测试剂盒，其特征在于:所述的发光物质为发光氨。
10.如权利要求5所述的血小板源性生长因子受体P检测试剂盒，其特征在于:所述的生物发光物质为荧光素酶、荧光素或水母发光蛋白。
11.如权利要求5所述的血小板源性生长因子受体P检测试剂盒，其特征在于:所述的放射活性物质为1251、35S、14C、3H或52Mg。
12.权利要求1?11任一项所述的试剂盒在非肌层侵袭性膀胱癌预后分析中的用途。
【文档编号】G01N33/68GK103575905SQ201310475408
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月12日 优先权日:2013年10月12日
【发明者】贺伟峰, 吴军, 周俊峄, 罗高兴 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院