纸基电喷雾质谱指纹图谱技术及其构建方法
【专利摘要】本发明提出了一种全新的纸基电喷雾质谱指纹图谱技术及其构建方法，包括：(1)纸基载体制作；(2)纸基电喷雾试验：纸基载体尖端对准质谱入口，滴加样品于中心位置，加载高压电场，滴加喷雾溶剂，喷雾溶剂解析样品中的活性成分，在高压电场的作用下向纸基载体的尖端移动，在尖端形成泰勒锥，生成带电荷的喷雾液滴，使活性成分离子化并进行质谱分析；(3)质谱记录；(4)获得指纹图谱；(5)标准指纹图谱：均值法计算生产标准指纹图谱；(6)主成分分析：采用主成分分析进行质量评价、真伪鉴别和来源区分。本发明提供了一种全新的无需进行样品前处理和色谱分离的高通量质谱指纹图谱分析方法，有利于液体中药制剂或提取液样品的质量监控。
【专利说明】纸基电喷雾质谱指纹图谱技术及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种全新的指纹图谱技术及其构建方法，具体涉及采用纸基电喷雾离子化技术直接构建液体中药制剂或提取液样品的基于活性成分的质谱指纹图谱，从整体面貌上把握液体中药制剂或提取液的内在质量。
【背景技术】
[0002]指纹图谱是一种表征中药或中药制剂所含成分与其质量关系的有效手段，是评价中药或中药制剂整体质量的有效手段。中国和美国国家食品药品监督局、德国药用植物学会、英国草药典、印度草药典和加拿大药用及芳香植物学会等机构均将指纹图谱作为质量控制标准的内容之一。常规的指纹图谱分析方法为色谱法，高效液相色谱是目前最为成熟的色谱指纹图谱技术，其研究报道也非常广泛。但对于体系复杂的中药或中药制剂，高效液相色谱法需要花费很长的时间进行色谱分离，并且在仪器分析前还需进行复杂繁琐的样品前处理，这就使得该技术无法满足快速、高通量分析的要求。常压敞开式质谱可在常压条件下直接进行指纹图谱分析，不需要经过样品前处理和色谱分离，因此，分析时间大大缩短，一个完整的指纹图谱分析仅仅需要不到一分钟的时间，这就满足了快速和高通量分析的要求。纸基电喷雾是一种常压敞开式质谱离子化技术，该技术非常适合于液体样品的直接质谱分析。采用纸基电喷雾离子化技术构建液体中药制剂或提取液样品的基于活性成分的快速、高效、高通量质谱指纹图谱，从整体上全面反映液体中药制剂或提取液样品的内在质量，为质量控制提供了一种提供直观、简便、有效、可靠的技术手段。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于为液体中药制剂或提取液样品的质量评价、来源区分和真伪鉴别提供一种全新的无需进行样品前处理和色谱分离的高通量指纹图谱分析方法，为液体中药制剂或提取液的快速质量监控和质量筛查提供一种新的技术依据。
[0004]为达到本发明的目的所采用的技术方案:用纸基电喷雾离子化技术构建液体中药制剂或提取液基于活性成分的直接质谱指纹图谱，具体包括如下步骤:
[0005](I)纸基载体的制作:采用滤纸、层析纸或色谱纸制作等腰三角形纸基载体，等腰三角形的底边与高比为1:2，典型的纸基载体大小为底边宽5mm、高IOmm ；
[0006](2)纸基电喷雾试验:将纸基载体通过不锈钢镊子固定在三维移动台上，使顶角尖端对准质谱入口并距离质谱入口 5-15mm，将1_5 μ L的液体中药制剂或提取液样品滴加到纸基载体的中心位置，样品自然晾干后，通过不锈钢镊子将±3.0-5.0kV的高压电场加在纸基载体上，然后将5-20 μ L的可导电喷雾溶剂滴加在纸基载体上，导电的喷雾溶剂解析出样品中的活性成分，在高压电场的作用下向纸基载体的顶角尖端移动，在顶角尖端形成泰勒锥，然后形成带电的喷雾液滴，使活性成分离子化，进入质谱的质量分析器进行分析；
[0007](3)质谱记录:采用全扫描模式记录质谱图；[0008](4)获得指纹图谱:将三次纸基电喷雾平行试验所获得的平均质谱图作为该样品的纸基电喷雾质谱指纹图谱，输出为.txt或.CSV文件；
[0009](5)标准指纹图谱:供试品指纹图谱采用均值法进行计算，生成标准指纹图谱；
[0010](6)主成分分析:供试品指纹图谱采用统计学软件进行主成分分析，从而进行样品的质量评价、真伪鉴别和来源区分。
[0011]本发明最佳的检测方法可以通过下述步骤实施:(I)纸基载体的制作:采用色谱纸 G4(Whatman International Ltd.Maidstone, England)制作为底边宽为 5mm、高为 IOmm等腰三角形纸基载体；(2)纸基电喷雾试验:将纸基载体通过不锈钢镊子固定在三维移动台上，使顶角尖端对准质谱入口并距离质谱入口 10mm，将2μ L的液体中药制剂或提取液样品滴加到纸基载体的中心位置，样品自然晾干后，通过不锈钢镊子将+3.5kV或-4.0kV的高压电场加在纸基载体上，然后将IOyL甲醇或乙腈溶液滴加在纸基载体上进行纸基电喷雾质谱分析；(3)质谱记录:全扫描模式记录质谱轮廓图；(4)获得指纹图谱:将三次纸基电喷雾平行试验所获得的平均质谱图作为样品的纸基电喷雾质谱指纹图谱，输出为.txt或.csv文件；(5)标准指纹图谱:供试品指纹图谱采用均值法进行计算，生成标准指纹图谱；(6)主成分分析:供试品指纹图谱采用统计学软件进行主成分分析，从而进行质量评价、真伪鉴别和来源区分。本发明的有益效果是提供了一种全新的无需进行样品前处理和色谱分离的快速、高效、高通量质谱指纹图谱分析方法，可快速准确地对液体中药制剂或提取液样品进行质量评价、真伪鉴别和来源区分，有利于液体中药制剂或液体中药提取液的质量监控。
[0012]本发明的有益效果如下:
[0013](I)按本发明提供的方法所建立的纸基电喷雾质谱指纹图谱，能有效的进行液体中药制剂或提取液样品的质量评价`、真伪鉴别和来源区分，有利于全面监控产品的质量。
[0014](2)质谱指纹图谱注重各个构成指纹特征质谱峰的整体面貌特征，既避免了因测定一、二个化学成分而判定样品质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。
[0015](3)本发明具有快速、简便、有效、可靠等优点，满足高通量分析的需求。
[0016](4)该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣，为液体中药制剂或提取液的质量评价、真伪鉴别和来源区分提供技术依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1、纸基电喷雾质谱指纹图谱分析的试验过程示意图.[0018]图2、癍痧凉茶的纸基电喷雾质谱指纹图谱.(a)黄振龙癍痧凉茶的标准指纹图谱；(b)平安堂癍痧凉茶的标准指纹图谱；(c)离子m / zl33的二级质谱指纹图谱；(d)离子m / zl69的二级质谱指纹图谱；(e)离子m / zl91的二级质谱指纹图谱；(f)离子m /z353的二级质谱指纹图谱；(g)离子m / z515的二级质谱指纹图谱；(h)离子m / z685的二级质谱指纹图谱；(i)离子m / z709的二级质谱指纹图谱；(j)离子m / z727的二级质谱指纹图谱；(k)离子m / z845的二级质谱指纹图谱；(I)离子m / z889的二级质谱指纹图谱；(m)离子m / z925的二级质谱指纹图谱；(η)离子m / z955的二级质谱指纹图谱.[0019]图3、两种不同来源癍痧凉茶的纸基电喷雾质谱指纹图谱主成分分析(PCA)图.(a)三维PCA得分图；(b)三维PCA载荷图.[0020]下面通过实施例及其附图详细阐述本发明的技术方案，所列举的实施例及附图对本发明并没有限制。
【具体实施方式】
[0021]实施例1.癍痧凉茶的纸基电喷雾质谱指纹图谱试验方法的建立
[0022]1.仪器与试剂
[0023]1.1仪器Agilent Trap XCT离子讲质谱仪，LCMSD Trap5.2质谱工作站。
[0024]1.2试剂色谱纸G4、甲醇(色谱纯)、二次重蒸水。
[0025]2.实验部分
[0026]2.1供试品溶液的制备
[0027]癍痧凉茶无需经过样品前处理，直接用于纸基电喷雾质谱分析。
[0028]2.2纸基电喷雾质谱试验
[0029]采用色谱纸裁剪G4制作等腰三角形纸基载体，纸基载体大小为底边宽约5mm、高约10mm。将纸基载体通过不锈钢镊子固定在三维移动台上，使顶角尖端对准质谱入口并距离质谱入口 10mm。将2μ L的癍痧凉茶样品滴加到纸基载体的中心位置，待样品自然晾干后，将一外置的-4.0kV高压电场通过不锈钢镊子加载于纸基载体上，然后将10μ L的甲醇溶剂滴加在纸基载体上，甲醇解析出样品中的活性成分，在高压电场的作用下向纸基载体的顶角尖端移动，在顶角尖端形成泰勒锥，然后生成带电的喷雾液滴，使活性成分离子化，进入质谱的质量分析器进行分析。试验过程示意图如图1所示。
[0030]2.3质谱条件
[0031]负离子检测模式，全扫描方式记录质谱图，扫描质量范围m / ZlOO~1000。
[0032]实施例2.黄振龙癍痧凉茶和平安堂癍痧凉茶的标准指纹图谱
[0033]取18批次合格的黄振龙癍痧凉茶样品和18批次合格的平安堂癍痧凉茶样品，按实施例1条件进行纸基电喷雾质谱指纹图谱分析试验。为了避免纸基载体和喷雾溶剂的背景信号干扰，这些背景信号将从指纹图谱中扣除。每批次样品平行试验三次，所获的平均质谱图扣除背景信号后作为该样品的指纹图谱输出为.txt文件。采用均值法进行计算，生成两种来源癍痧凉茶的标准指纹图谱，见附图2 (a-b)。黄振龙癍痧凉茶的标准指纹图谱与平安堂癍痧凉茶的标准指纹图谱的特征显著不同，两种癍痧凉茶的特征离子峰及其相对离子强度均不一样。
[0034]图2(c-n)为癍痧凉茶纸基电喷雾质谱标准指纹图谱中十二个主要特征离子的二级质谱指纹图谱。m / z133离子(苹果酸)失去一分子水得到碎片m / z115。m / z169离子(没食子酸)失去一分子CO2产生m / z125离子碎片。m / zl91 (奎尼酸和柠檬酸)离子依次失去一分子H20、C00H、0得到m / zl73、127、lll碎片。咖啡奎宁酸(m / z353)依次失去一分子 caffeoyl、quinic acid> caffeic acid、[quinic acid+C02]得到m / z191、179、173、135的主要碎片。双咖啡奎宁酸(m / z515)分别失去一分子caffeoyl和一分子[caffeoyl+caffeic acid],得到碎片m / z353和173。野蔷薇苷异构体(m / z685)失去一分子HCl和一分子[HCl+glucose]，产生m / z649、487离子碎片。岗梅皂苷:m / z709离子产生[M-H-CO2F(m / z665)、[M-H-SO3I^m / z629)、[C6H7O9SF (m / z255)的碎片信息；m / z727 离子产生两个主要的碎片，即为[M-H-SO3J-V / z647)和[C6H709S]-(m / z255)；m / z离子845失去一分子葡萄糖得到m / z683峰；m / z889离子在碰撞诱导解离条件下产生[M-H-SO3F(m / z809)、[M-H-glucose]-(m / z727)、[M-H-S03-glucose!T(m / z647)、[C6H7O9S]-(m / z255)的质谱信号；m / z925离子丢失一分子SO3得到m / z845质谱信号。五环三萜皂苷m / z955离子失去一份子葡萄糖得到m / z793质谱信号。这些多级质谱信息对活性成分的鉴定起着重要的作用，同时也可作为癍痧凉茶的多级质谱指纹图谱信息。
[0035]实施例3.纸基电喷雾质谱指纹图谱对癍痧凉茶的质量评价和来源区分
[0036]取18批次合格的黄振龙癍痧凉茶、18批次合格的平安堂癍痧凉茶、3批次过期的黄振龙癍痧凉茶和3批次过期的平安堂癍痧凉茶，按实施例1条件进行纸基电喷雾质谱指纹图谱分析试验，每个样品平行三次，将三次试验所得的平均质谱图扣除背景后作为该样品的指纹图谱，并输出为.csv文件。采用统计学软件对癍痧凉茶的纸基电喷雾质谱指纹图谱进行主成分分析(PCA)，PCA得分图和载荷图见附图3。12个对来源区分起重要作用的特征离子在PCA得分图中得到了很好的表现，即为离子m / zl69、191、353、462、515、685、709、727、845、887、889、955。两种不同厂家来源的癍痧凉茶样品在PCA载荷图中分为两大类，显示其明显不同的来源区分。合格的黄振龙和平安堂癍痧凉茶样品数据点排列紧密，显示这两类样品具备良好的质量稳定性。过期的黄振龙和平安堂癍痧凉茶样品的数据点与合格样品数据点比较相对离散，并且远离合格样品的数据点区域，表明过期癍痧凉茶样品的内在质量与合格癍痧凉茶样品的内在质`量显著不同。
【权利要求】
1.纸基电喷雾质谱指纹图谱技术及其构建方法，其特征在于采用纸基电喷雾质谱技术构建液体中药制剂或提取液样品的基于活性成分的质谱指纹图谱，构建的指纹图谱主要用于液体中药制剂或提取液样品的高通量快速筛查，可有效的进行质量评价、真伪鉴别和来源区分，具体包括如下步骤: (1)纸基载体的制作:裁剪制作等腰三角形纸基载体，用于加载液体中药制剂或提取液样品进行纸基电喷雾试验； (2)纸基电喷雾试验:将裁剪制作好的等腰三角形纸基载体用不锈钢镊子夹住，将镊子固定在三维移动台上，调整三维移动台，使纸基载体的顶角尖端对准质谱入口，将一定量的液体中药制剂或提取液样品滴加到纸基载体的中心位置，样品自然晾干后，通过不锈钢镊子将一高压电场加在纸基载体上，然后将一定量的喷雾溶剂滴加在纸基载体上，喷雾溶剂解析出样品中的活性成分，在高压电场的作用下向纸基载体的顶角尖端移动，在顶角尖端形成泰勒锥，生成带电荷的喷雾液滴，使活性成分直接离子化，进入质谱的质量分析器； (3)质谱记录:记录纸基电喷雾试验所获得的质谱图； (4)获得指纹图谱:将所获得的纸基电喷雾质谱图作为样品的质谱指纹图谱； (5)标准指纹图谱:供试品指纹图谱计算生成标准指纹图谱； (6)主成分分析:供试品指纹图谱采用主成分分析，进行质量评价、真伪鉴别和来源区分。
2.根据权利要求1所述的纸基电喷雾质谱指纹图谱技术及其构建方法，其特征在于所述步骤(I)纸基载体的制作中采用滤纸、层析纸或色谱纸裁剪制作等腰三角形纸基载体，等腰三角形的底边与高比为1:2，典型的纸基载体大小为底边宽5mm、高10mm。
3.根据权利要求1所述的纸基电喷雾质谱指纹图谱技术及其构建方法，其特征在于所述步骤(2)纸基电喷雾试验中纸基载体的顶角尖端距离质谱入口为5-15mm，滴加在纸基载体上的液体中药制剂或提取液样品量为1-5 μ L，加载在纸基载体上的高压电场为±3.0-5.0kV ;滴加在纸基载体上的喷雾溶剂必须具有导电性，喷雾溶剂的量为5-20 μ L0
4.根据权利要求1所述的纸基电喷雾质谱指纹图谱技术及其构建方法，其特征在于所述步骤(3)质谱记录中采用的记录模式为全扫描模式。
5.根据权利要求1所述的纸基电喷雾质谱指纹图谱技术及其构建方法，其特征是在于所述步骤(4)获得指纹图谱中所获得的供试品指纹图谱为三次纸基电喷雾平行试验的平均质谱图。
6.根据权利要求1所述的纸基电喷雾质谱指纹图谱技术及其构建方法，其特征在于所述步骤(5)标准指纹图谱中将供试品的质谱指纹图谱输出为.txt或.csv文件后，采用均值法进行计算，生成标准指纹图谱。
7.根据权利要求1所述的纸基电喷雾质谱指纹图谱技术及其构建方法，其特征在于所述步骤(6)主成分分析中将供试品的质谱指纹图谱输出为.txt或.csv文件后，采用具有主成分分析功能的统计学软件进行主成分分析，根据主成分分析结果进行质量评价、真伪鉴别和来源区分。
【文档编号】G01N27/62GK103499632SQ201310424873
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】杨运云, 邓洁薇, 宋化灿 申请人:中国广州分析测试中心