孔雀石绿残留一步式化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种孔雀石绿残留一步式化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒，该法结合了间接酶免疫反应和化学发光技术，在不需要另外制备酶标单克隆抗体的情况下，将传统两步式化学发光酶免疫分析法简化为一步，并利用15～35%乙腈对高浓度无色孔雀石绿溶解力有限的特性，将其作为样品溶解液。该法应用在动物源性食品中孔雀石绿残留检测，具有快速、简便、特异、灵敏、准确、检测范围宽等特点，更加符合快速检测的要求，具有较好的应用前景。本发明试剂盒的IC50为0.45μg/L，回收率为86.37～116.84%，与标准检测方法的吻合率为100%，适合用于孔雀石绿的痕量分析与批量检测。
【专利说明】孔雀石绿残留一步式化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及孔雀石绿残留检测分析领域，尤其涉及一种孔雀石绿残留一步式化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]孔雀石绿(Malachite Green，MG)分子式为C23H25N2Cl,属于三苯甲烷类染料，曾因其在预防和治疗水霉病、鳃霉病、小瓜虫病、鱼卵霉菌等方面的显著功效，而广泛应用于渔业养殖。近年来的研究发现，孔雀石绿特别是其代谢产物在水生动物体内具有明显的蓄积残留现象，且因为MG具有使动物肝细胞空泡化、影响动物的生长和繁殖能力、致癌性等危害，已严重威胁到水生动物和人类健康，所以美国、加拿大、欧盟等许多国家都禁止在水产品中使用孔雀石绿；欧盟、澳大利亚和新西兰确定孔雀石绿和无色孔雀石绿的最低执法限量为2μ g/kg ;我国也在2002年将其列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》(农业部公告193号)，并在《2000年度中国出口动物源性食品有毒有害物质残留监控计划》中首次将鳗鱼中MG项目的监控列入年度计划，并延续至今。然而，由于目前尚无孔雀石绿的较好替代品，因此一些不法商贩仍在非法使用，导致孔雀石绿残留超标事件时有发生。
[0003]鉴于孔雀石绿的危害，世界各国相继立法禁止其在食品动物中使用，并建立了许多残留检测方法，用于检测孔雀石绿的残留量。常用的有理化方法(如高效液相色谱法、气相色谱、液质联用、薄层层析)以及免疫学方法(如放射免疫法、荧光免疫分析法、酶联免疫吸附法、电化学分析法、化学发光分析法等)。其中理化方法具有精密度与准确度高的优点，往往被用作最终确证的检测方法，而免疫学方法因其简便、快速、廉价、高灵敏性、高通量等特点，较好地弥补了理化方法的不足，近年来越来越多地被应用于药物残留的检测。
[0004]试验证实,孔雀石绿进入动物体内会快速转化为无色孔雀石绿(LeucomalachiteGreen, LMG), 24h内转化率达80%，而且LMG不溶于水，难于排出体外，消除速度慢，残留时间达100天以上，残留毒性比MG更高，在很多国家被视为残留标示物，因此以LMG为检测对象更能说明MG在动物体内残留的情况。
[0005]中国专利申请“一种孔雀石绿的化学发光酶联免疫检测方法及试剂盒”(申请号201210106196.3
【公开日】2013年9月12日)采用两步式化学发光酶联免疫检测体系和检测方法对待测样品中孔雀石绿残留进行检测，操作步骤多、分析时间长、检测范围窄。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种快速、简便、特异、灵敏、准确、检测范围宽的孔雀石绿残留一步式化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒。
[0007]本发明要解决的另一技术问题提供一种特异性高、亲和力强的无色孔雀石绿单克隆抗体。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:
[0009]孔雀石绿残留一步式化学发光酶免疫分析检测法，包括以下步骤:[0010]〈1>处理待测样品；
[0011]<2>将半抗原无色孔雀石绿与载体蛋白卵清蛋白的偶联物(LMG-OVA)作为抗原包被于发光固相载体，封闭后，依次加入系列标准样品或经前处理的待测样品、酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG和无色孔雀石绿单克隆抗体进行反应，然后再加入化学发光液，测定系列标准样品和待测样品的发光值；
[0012]<3>以步骤〈2>测得的发光值计算抑制率，绘制标准曲线，并根据标准曲线的回归方程和待测样品的抑制率计算待测样品中孔雀石绿的含量。
[0013]步骤〈1>按以下操作进行:取5g组织样品加入IOmL乙腈超声波震荡15min,4000r/min离心IOmin,取上清液加入20g中性氧化招，震荡混匀5min,4000r/min离心5min，取上清液于氮气吹干，加入15~35%乙腈溶液溶解，用于检测；
[0014]步骤〈2>按以下操作进行:用包被液将抗原稀释成5 μ g/mL,每孔加入100 μ L,4°C孵育10~16h后，倾去包被液，用洗板机洗涤化学发光板3次，拍干；然后，每孔加入350 μ L封闭液，37°C孵育I~2h，倾去封闭液，用洗板机洗涤3次，拍干；37°C烘干后，用锡箔纸真空密封，4°C保存；将化学发光板从4°C中取出，待温度平衡至室温，按照每孔50 μ L将系列标准样品溶液和待测样品加入化学发光板，各设3孔重复，然后依次按照每孔50 μ L加入酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG、无色孔雀石绿单克隆抗体，混匀，37°C孵育60min ;倾去液体，用洗板机洗涤5次，拍干；每孔中加入ΙΟΟμ L化学发光液，混匀，尽快测定各孔发光值。
[0015]封闭液是5%的脱脂奶粉；无色孔雀石绿单克隆抗体稀释为1.15 μ g/mL ;系列标准样品溶液的浓度为 O μ g/L、0.001 μ g/L、0.01 μ g/L、0.1 μ g/L、I μ g/L、10 μ g/L、100 μ g/L ；包被液是pH9.6的碳酸盐缓冲液。
[0016]孔雀石绿残留一步式化学发光酶免疫分析检测试剂盒，包括包被有包被抗原(LMG-OVA)的化学发光板、无色孔雀石绿系列标准样品溶液、无色孔雀石绿单克隆抗体工作液、浓缩洗涤液、HRP-山羊抗小鼠IgG (酶标二抗)工作液、化学发光液；包被抗原为无色孔雀石绿与载体蛋白卵清蛋白的偶联物；无色孔雀石绿系列标准样品溶液为7个浓度梯度，分别是 O μ g/L、0.001 μ g/L、0.01 μ g/L、0.1 μ g/L、I μ g/L、10 μ g/L、100 μ g/L ;浓缩洗涤液由 NaC18.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4.12H202.90g、KC10.20g、吐温-200.50mL，加水定容至IOOmL制成；化学发光液来自超敏ECL化学发光试剂盒P0018--BeyOECL Plus。
[0017]上述试剂盒在动物源性食品中孔雀石绿残留检测中的应用。
[0018]无色孔雀石绿单克隆抗体，按以下操作制备:以半抗原无色孔雀石绿与载体蛋白牛血清白蛋白的偶联物(LMG-BSA)作为免疫原，免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，按照常规方法进行细胞融合和阳性株的筛选，对筛选出的阳性细胞株连续克隆3次，经过鉴定、冻存和建株后，进行腹水的制备，然后通过纯化腹水，获得能特异性识别无色孔雀石绿的单克隆抗体。
[0019]上述的无色孔雀石绿单克隆抗体，按以下操作制备:
[0020]〈1>动物免疫
[0021]将健康的6周龄雌性BALB/c小鼠通过基础免疫和5次加强免疫后，对效价最高、竞争性最强的小鼠进行冲击免疫；
[0022]<2>细胞融合和克隆筛选
[0023]冲击免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后处死，收集血液、无菌取脾脏，利用细胞融合技术将小鼠免疫脾细胞与Sp2/0细胞进行融合，融合后的细胞悬液加至已事先铺有饲养细胞的96孔板中，采用HAT选择培养基筛选融合细胞；
[0024]待细胞生长至培养孔面积1/10时，无菌准确吸取ΙΟΟμ L上清，加至已包被抗原(LMG-OVA)的酶标板内；以间接ELISA法测细胞培养上清效价，采用有限稀释法对阳性细胞连续克隆3次，直至阳性率为100%时，对细胞株进行扩大培养、鉴定、冻存和建株，对鉴定后细胞株进行连续培养传代2个月以上，每隔5代检测其稳定性和抗体分泌能力；
[0025]<3>细胞冻存与复苏
[0026]用冻存液将处于对数生长期的杂交瘤细胞制成细胞悬液，分装于冻存管，置于液氮中保存；复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液，移入细胞瓶中
培养；
[0027]〈4>腹水的制备与纯化
[0028]采用体内诱生法，将灭菌石蜡油注入8周龄Balb/c小鼠腹腔，7_14天后注入杂交瘤细胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水用饱和硫酸铵法进行初纯后，再用亲和层析法进一步纯化，即得无色孔雀石绿单克隆抗体。
[0029]本发明首次探讨了检测无色孔雀石绿残留的一步式化学发光酶免疫机理，发明人结合了间接酶免疫反应和化学发光技术，在不需要另外制备酶标单克隆抗体的情况下，将传统两步式化学发光酶免疫分析法简化为一步，并利用15?35%乙腈对高浓度无色孔雀石绿溶解力有限的特性，将其作为样品溶解液，成功建立了一步式孔雀石绿化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒。本发明“一步法”的线性检测范围(0.001?100 μ g/L)比“两步法”和ELISA宽，最低检测限(0.0016 μ g/L)降低了 10?100倍，更加符合痕量分析和批量检测；另外，本发明配制的15?35%乙腈对高浓度孔雀石绿溶解力有限，当待测样品中孔雀石绿含量超过本发明的最高检测限100 μ g/L时，会出现肉眼可见的浑浊，因此，当检测孔雀石绿严重超标的样品时(含量超过上述两种方法检测范围而低于ΙΟΟμ g/L)，无需对样品进一步稀释并重复检测；而当孔雀石绿残留量超过最高检测限时，则利用15?35%乙腈溶解样品直观地提示需对样品进一步稀释，然后再进行检测。通过以上改进，本法简化了操作步骤，减少了工作量，降低了试验误差，缩短了检测时间，节省了检测成本，具有快速、特异、灵敏、准确等特点，更加符合快速检测的要求，具有较好的应用前景。本发明试剂盒的IC5tl为
0.45 μ g/L,回收率为86.37?116.84%，与标准检测方法的吻合率为100%，适合用于孔雀石绿的痕量分析与批量检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为实施例2孔雀石绿残留一步式化学发光酶免疫分析检测法的标准曲线。
[0031]图中:X轴为孔雀石绿梯度浓度标准样品浓度的对数值；Y轴为各浓度孔雀石绿标准样品的发光值除以“O ”浓度孔发光值(RLU/RUU90。
【具体实施方式】
[0032]实施例1无色孔雀石绿单克隆抗体的制备
[0033]1.1动物免疫
[0034]以半抗原无色孔雀石绿与载体蛋白牛血清白蛋白的偶联物(LMG-BSA)作为免疫原，对健康的6周龄雌性BALB/c小鼠进行基础免疫和5次加强免疫后，测定血清效价和IC5tl，选取效价最高、竞争性最强的小鼠进行冲击免疫；
[0035]1.2细胞融合和克隆筛选
[0036]冲击免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后处死，收集血液、无菌取脾脏，利用细胞融合技术将小鼠免疫脾细胞与Sp2/0细胞进行融合，融合后的细胞悬液加至已事先铺有饲养细胞的96孔板中，采用HAT选择培养基筛选融合细胞；
[0037]待细胞生长至培养孔面积1/10时，无菌准确吸取100 μ L上清，加至已包被抗原LMG-OVA的酶标板内；以间接ELISA法测细胞培养上清效价，采用有限稀释法对阳性细胞连续克隆3次，直至阳性率为100%时，对细胞株进行扩大培养、鉴定、冻存和建株，对鉴定后细胞株进行连续培养传代2个月以上，每隔5代检测其稳定性和抗体分泌能力；1.3细胞冻存与复苏
[0038]用冻存液将处于对数生长期的杂交瘤细胞制成细胞悬液，分装于冻存管，置于液氮中保存；复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液，移入细胞瓶中
培养；
[0039]1.4腹水的制备与纯化
[0040]采用体内诱生法，将灭菌石蜡油注入8周龄Balb/c小鼠腹腔，7_14天后注入杂交瘤细胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水用饱和硫酸铵法进行初纯后，再用亲和层析法进一步纯化，经SDS-PAGE电泳鉴定，证实获得的无色孔雀石绿单克隆抗体IHlO达到电泳纯。
1.5单克隆抗体的鉴定
[0041]1.5.1杂交瘤细胞培 养上清及纯化后抗体效价的测定
[0042]采用间接ELISA方法，测定杂交瘤细胞培养上清中LMG-McAb的效价为1:640，亲和层析纯化后的腹水效价达到1:5X105。
[0043]1.5.2亲和力的测定
[0044]通过非竞争ELISA，分别以OD45tl值为纵坐标，以LMG-McAb的浓度为横坐标，绘制亲和曲线，以公式I计算不同抗原包被浓度下的亲和常数，取平均值得出无色孔雀石绿单克隆抗体的亲和常数(Ka)为6.2XlOVmolο
η-l
[0045]Ka=-(公式 I)
2(n[Ab']-[Ah]t)
[0046]1.5.3亚类的鉴定
[0047]采用美国Southern Biotech公司的免疫球蛋白亚类检测试剂盒测定无色孔雀石绿单克隆抗体IHlO为IgG1亚类，K轻链。
[0048]实施例2孔雀石绿残留一步式化学发光酶免疫分析检测法的建立
[0049]2.1相关试剂的配制
[0050]碳酸盐缓冲液(pH9.6，即包被液):准确称取Na2CO3L 59g、NaHC032.93g，超纯水溶解后，调节pH至9.6，定容至1000mL。
[0051]洗涤液(ρΗ7.4):准确称取 NaC18.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4.12Η202.90g、KC10.20g，超纯水溶解后，调节pH至7.4，加入吐温-200.50mL，定容至1000mL。
[0052]磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4):准确称取 NaC18.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4.12H202.90g、KC10.20g，超纯水溶解后，调节 pH 至 7.4，定容至 IOOOmL0
[0053]封闭液:准确称取脱脂奶粉1.0g，加入20mL磷酸盐缓冲液，搅拌均匀至完全溶解。
[0054]BeyoECL Plus (超敏ECL化学发光试剂盒，P0018，IOOmL):购自碧云天生物技术研究所。
[0055]2.2抗原、抗体稀释倍数的确定
[0056]采用方阵滴定确定抗原、抗体稀释倍数:将LMG-OVA (10mg/mL)按照1:2000、1:4000、1:6000 和 1:8000 稀释后包被化学发光板，并以 1:1000、1:2000、1:3000 和 1:4000稀释无色孔雀石绿单克隆抗体(4.6mg/mL)，进行反应，选择反应标准曲线IC5tl (50%抑制率时药物的浓度，即反应的灵敏度)最小的条件作为最佳抗原包被条件。由表1结果确定包被抗原和单克隆抗体的最佳稀释倍数分别为1:2000、1:4000，即5μ g/mL、1.15 μ g/mL。
[0057]表1抗原、抗体稀释倍数的确定
【权利要求】
1.一种孔雀石绿残留一步式化学发光酶免疫分析检测法，其特征在于包括以下步骤: <1>处理待测样品； 〈2>将半抗原无色孔雀石绿与载体蛋白卵清蛋白的偶联物作为抗原包被于发光固相载体，封闭后，依次加入系列标准样品或经前处理的待测样品、酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG和无色孔雀石绿单克隆抗体进行反应，然后再加入化学发光液，测定系列标准样品和待测样品的发光值； <3>以步骤〈2>测得的发光值计算抑制率，绘制标准曲线，并根据标准曲线的回归方程和待测样品的抑制率计算待测样品中孔雀石绿的含量。
2.根据权利要求1所述的孔雀石绿残留一步式化学发光酶免疫分析检测法，其特征在于: 步骤〈1>按以下操作进行:取5g组织样品加入IOmL乙腈超声波震荡15min,4000r/min离心IOmin,取上清液加入20g中性氧化招,震荡混匀5min, 4000r/min离心5min,取上清液于氮气吹干，加入15~35%乙腈溶液溶解，用于检测； 步骤〈2>按以下操作进行:用包被液将抗原稀释成5 μ g/mL，每孔加入100μ L，4°C孵育10~16h后，倾去包被液，用洗板机洗涤化学发光板3次，拍干；然后，每孔加入350 μ L封闭液，37°C孵育I~2h，倾去封闭液，用洗板机洗涤3次，拍干；37°C烘干后，用锡箔纸真空密封，4°C保存；将化学 发光板从4°C中取出，待温度平衡至室温，按照每孔50 μ L将系列标准样品溶液和待测样品加入化学发光板，各设3孔重复，然后依次按照每孔50 μ L加入酶标二抗、无色孔雀石绿单克隆抗体，混匀，37°C孵育60min ;倾去液体，用洗板机洗涤5次，拍干；每孔中加入IOOyL化学发光液，混匀，尽快测定各孔发光值。
3.根据权利要求2所述的孔雀石绿残留一步式化学发光酶免疫分析检测法，其特征在于:所述封闭液是5%的脱脂奶粉；所述无色孔雀石绿单克隆抗体的稀释为1.15 μ g/mL ;所述系列标准样品溶液的浓度为 O μ g/L、0.001 μ g/L、0.01 μ g/L、0.1 μ g/L、l μ g/L、10 μ g/L、100 μ g/L ;所述包被液是pH9.6的碳酸盐缓冲液。
4.一种孔雀石绿残留一步式化学发光酶免疫分析检测试剂盒，其特征在于包括包被有包被抗原的化学发光板、无色孔雀石绿系列标准样品溶液、无色孔雀石绿单克隆抗体工作液、浓缩洗涤液、HRP-山羊抗小鼠IgG工作液、化学发光液；所述包被抗原为无色孔雀石绿与载体蛋白卵清蛋白的偶联物；所述无色孔雀石绿系列标准样品溶液为7个浓度梯度，分别是 O μ g/L,0.001 μ g/L,0.01 μ g/L、0.1 μ g/L、I μ g/L、10 μ g/L、100 μ g/L ;所述浓缩洗涤液由 NaC18.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4.12H202.90g、KC10.20g、吐温-200.50mL，加水定容至IOOmL制成；化学发光液来自超敏ECL化学发光试剂盒P0018--BeyOECL Plus。
5.根据权利要求4所述试剂盒应用于动物源性食品中孔雀石绿残留的检测。
6.一种无色孔雀石绿单克隆抗体，其特征在于按以下操作制备:以半抗原无色孔雀石绿与载体蛋白牛血清白蛋白的偶联物作为免疫原，免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，按照常规方法进行细胞融合和阳性株的筛选，对筛选出的阳性细胞株连续克隆3次，经过鉴定、冻存和建株后，进行腹水的制备，然后通过纯化腹水，获得能特异性识别无色孔雀石绿的单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的无色孔雀石绿单克隆抗体，其特征在于按以下操作制备: 〈1>动物免疫将健康的6周龄雌性BALB/c小鼠通过基础免疫和5次加强免疫后，对效价最高、竞争性最强的小鼠进行冲击免疫； <2>细胞融合和克隆筛选 冲击免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后处死，收集血液、无菌取脾脏，利用细胞融合技术将小鼠免疫脾细胞与Sp2/0细胞进行融合，融合后的细胞悬液加至已事先铺有饲养细胞的96孔板中，采用HAT选择培养基筛选融合细胞； 待细胞生长至培养孔面积1/10时，无菌准确吸取100 μ L上清，加至已包被抗原的酶标板内；以间接ELISA法测细胞培养上清效价，采用有限稀释法对阳性细胞连续克隆3次，直至阳性率为100%时，对细胞株进行扩大培养、鉴定、冻存和建株，对鉴定后细胞株进行连续培养传代2个月以上，每隔5代检测其稳定性和抗体分泌能力； <3>细胞冻存与复苏 用冻存液将处于对数生长期的杂交瘤细胞制成细胞悬液，分装于冻存管，置于液氮中保存；复苏时取出冻存管，立即放入37 V水浴中速融，离心去除冻存液，移入细胞瓶中培养; <4>腹水的制备与纯化 采用体内诱生法，将灭菌石蜡油注入8周龄Balb/c小鼠腹腔，7-14天后注入杂交瘤细胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水用饱和硫酸铵法进行初纯后，再用亲和层析法进一步纯化，即得无色孔雀石.绿单克隆抗体。
【文档编号】G01N33/577GK103472228SQ201310408148
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】吴健敏, 马玲, 张启模, 陈凤莲, 覃绍敏, 白安斌, 韦建兴, 林俊, 刘金凤, 黄红梅, 关忠谊 申请人:广西壮族自治区兽医研究所