Eif5a2在制备食管鳞状细胞癌预后诊断试剂中的应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了EIF5A2在制备食管鳞状细胞癌预后诊断试剂中的应用。实时定量PCR检测数据表明，EIF5A2在食管鳞癌组织中的表达显著高于相应的非肿瘤组织。免疫组化数据分析结果显示：EIF5A2表达与淋巴结转移，肿瘤浸润深度和肿瘤分期正相关。Kaplan-Meier分析显示EIF5A2过表达的病人总体生存率较差(P<0.001)。多变量分析也证明EIF5A2是独立的预后因子。EIF5A2在食管鳞癌的侵袭和转移中可能发挥重要作用。进一步的实验数据证明，EIF5A2的过表达可由基因扩增和缺氧导致；EIF5A2可以结合到HIF1α的启动子区域，上调HIF1α的表达；EIF5A2可以诱导上皮间质化转换，促进食管鳞癌的血管形成，进而促进食管鳞癌的侵袭与转移。敲除EIF5A2能显著抑制肿瘤细胞迁移，沉默EIF5A2有望成为食管鳞癌治疗的潜在靶点。
【专利说明】EIF5A2在制备食管鳞状细胞癌预后诊断试剂中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及EIF5A2的新应用，特别涉及EIF5A2在制备食管鳞状细胞癌的预后诊断试剂中的应用。
【背景技术】
[0002]食管鳞状细胞癌是世界上肿瘤发病率排名第七，致死率排名第五的常见恶性肿瘤。食管切除术是早期食管癌患者有力的根治性治疗。然而，大多数患者症状显现时局部肿瘤已进展到晚期，并且20-30%已发生远处转移。转移是食管癌致死的主要原因，因此确定其具体机制显得重要而又迫切。像其他实体肿瘤一样，食管癌的发病机理是一个涉及多基因改变的长期过程。
[0003]真核细胞翻译起始因子5A2(EIF5A2)是EIF5A家族中高度进化保守的基因之一。EIF5A2作为可能的癌基因在多种人类上皮源性肿瘤内呈高表达，并与肿瘤的分期和/或预后不佳相关。EIF5A2通过多种机制诱导肿瘤发生上皮间质转化进而促进肿瘤侵袭转移。EIF5A-MTA1/C-MYC轴可能是上皮源性肿瘤发生侵袭转移的重要调控通路之一。相关分子机制尚需进一步研究(孟庆彬，于健春，马志强.EIF5A2在肿瘤中的作用研究进展[J].基础医学与临床，2013，33(001): 123-125.XEIF5A2的过度表达与结直肠癌和肝癌的转移有关，并且提示了卵巢癌、肺癌、膀胱癌的不良预后。在肝细胞癌中，过度表达的EIF5A2可通过介导上皮间质化转换而促进肿瘤的侵袭和转移，这些过度表达的EIF5A2主要在侵犯周围组织的肿瘤细胞中检测到。尽管EIF5A2可以促进肝癌与结直肠癌细胞的运动能力，但是目前关于EIF5A2促进肿瘤转移的确切机制尚进展甚微。
[0004]现有研究中，EIF5A2与食管鳞状细胞癌预后之后的关系尚未明确。Kim D H，Muto M， Kuwahara Y， et al.Array-based comparative genomic hybridizationof circulating esophageal tumor cells [J].0ncology reports， 2006， 16(5):1053-1059.中指出，EIF5A2在食管鳞状细胞癌细胞中的表达量的升高有限，不到0.6倍，不适用于作为该肿瘤预后的生物标记物。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供EIF5A2在制备食管鳞状细胞癌的预后诊断试剂中的应用。
[0006]本发明的另一个目的在于提供一种治疗食管鳞状细胞癌的制剂。
[0007]本发明所采取的技术方案是:
EIF5A2在制备食管鳞状细胞癌的预后诊断试剂中的应用，EIF5A2高表达表明预后差，EIF5A2高表达的定义为:荧光定量PCR法:癌组织中EIF5A2的表达量超过癌旁非肿瘤组织的2.5倍；免疫组化检测法:肿瘤组织中染色深度X染色面积高于癌旁非肿瘤组织。
[0008]一种治疗食管鳞状细胞癌的制剂，含有可以减少EIF5A2的表达量的起效因子。
[0009]优选的，起效因子选自可使EIF5A2表达量下降的shRNA、siRNA。
[0010]特别的，shRNA的序列为sh2:
top strand: 5’-CACCGAGGACGACCATGCAAAATACGAATATTTTGCATGGTCGTCC-3’ (SEQ IDNO:1)；
bottom strand:5’-AAAAGGACGACCATGCAAAATATTCGTATTTTGCATGGTCGTCCTC-3’ (SEQ IDNO:2)
或 sh4:
top strand:5’-CACCGCATTCAAGATGGTTACCTTCGAAAAGGTAACCATCTTGAATG-3’ (SEQ IDNO:3)
bottom strand:5’-AAAACATTCAAGATGGTTACCTTTTCGAAGGTAACCATCTTGAATGC-3’ (SEQID NO:4)0
[0011]本发明的有益效果是:
发明人通过实时定量PCR检测了 71例食管鳞状细胞癌病例中肿瘤和与相应的非肿瘤组织中EIF5A2的表达差异。EIF5A2在食管鳞癌组织中的表达显著高于相应的非肿瘤组织(P = 0.05)。与相应的非肿瘤组织相比，在31/71 (43.66%)食管鳞癌病例中检查到EIF5A2的过表达。232例资料完整的食管鳞癌病例的免疫组化数据分析结果显示:EIF5A2表达与淋巴结转移(P〈0.001)，肿瘤浸润深度(P=0.037)和肿瘤分期(P=O-OOl)正相关。Kaplan-Meier分析显示EIF5A2过表达的病人总体生存率较差(P〈0.001)。多变量分析也证明EIF5A2是独立的预后因子。这些结果表明:EIF5A2在食管鳞癌的侵袭和转移中可能发挥重要作用。
[0012]进一步的实验数据证明，EIF5A2的过表达可由基因扩增和缺氧导致；EIF5A2可以可以结合到HIFla的启动子区域，上调HIFl a的表达；EIF5A2可以诱导上皮间质化转换，促进食管鳞癌的血管形成，进而促进食管鳞癌的侵袭与转移。敲除EIF5A2能显著抑制肿瘤细胞迁移，沉默EIF5A2有望成为食管鳞癌治疗的潜在祀点。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1，EIF5A2在食管鳞癌中的过表达情况；
图2，EIF5A2的表达可被缺氧诱导并且EIF5A2可以上调HIFl a ； 图34正5么2可直接调控!1正10的表达；
图4，沉默EIF5A2能降低细胞运动能力；
图5，EIF5A2促进肿瘤转移和血管形成；
图6，敲除EIF5A2具有潜在治疗价值；
图7，细胞角蛋白免疫组化染色结果图。
【具体实施方式】
[0014]材料和方法
原发肿瘤组织，组织芯片与免疫组化
食管鳞癌病例是从林州肿瘤医院外科病理档案室中连续挑选的(河南，中国)。在这项研究中，所有病例都没有接受过术前放化疗。 组织芯片(TMA)是根据现有技术构建。研究用人体组织经过中山大学涉及人体受试者研究的伦理审查委员会审查和批准。免疫组化染色(IHC)使用标准的免疫化学细染色方法进行。
[0015]原位杂交免疫荧光
EIF5A2基因和3号染色体着丝粒分别用红色和绿色探针标记。原位杂交免疫荧光按照之前描述进行操作9。
[0016]亚细胞结构分离
根据厂家说明书，使用NucBuster蛋白提取试剂盒分离出胞浆蛋白与胞核蛋白。
[0017]EIF5A2与HIFl α的相互作用
EIF5A2与HIFla的相互作用机制是通过荧光素酶试验与染色体免疫共沉淀试验研究的。
[0018]体外迁移试验
将重悬于无血清培养基的细胞种植于内置8微米膜滤器小室中。细胞被含10%胎牛血清的培养基所吸引。30小时后，细胞被固定、染色、计数。侵袭实验中，膜滤器为一层基质胶覆盖。重复3次独立实验。
体内转移试验
所有的动物实验均根据对动物保健委员会的指导方针并且经中山大学批准进行。此次研究中使用的是四~六周龄的BALB/c裸鼠。动物根据血行转移组、淋巴结转移组、对照组随机分为三组。注射前2天，使用感染复数为150的腺病毒和对照载体(Ad LacZ)分别对细胞进行感染。经尾静脉向动物体内注射重悬于PBS中的6X IO5个细胞，或经皮下足垫注射重悬于PBS中的1.5X IO5个细胞。45天后处死所有动物。对肺和肝脏进行检查。对肝脏表面的肿瘤转移灶进行计数。将腹股沟淋巴结分离并用10%福尔马林固定。
[0019]微血管计数
微血管计数是使用CD34抗体对切片进行免疫组化染色后分析的。血管的最高值是在20倍物镜下计数的。
[0020]分子治疗实验
由于KYSE180细胞优良的成瘤性，用它来做裸鼠成瘤。在治疗实验中，应用了两步成瘤法。首先，把KYSE180细胞接种到小鼠皮下。当肿瘤直径长到约8毫米时，将肿瘤分离并切成约I X I毫米碎块，然后把它们再种植到裸鼠皮下。当肿瘤直径达到5~6毫米，动物分组如下:PBS组，多西紫杉醇组(TXT)，腺病毒EIF5A2-sh2组，多西紫杉醇+腺病毒EIF5A2_sh2 ;或PBS组，顺钼组，顺钼+腺病毒EIF5A2-sh2组，与顺钼+腺病毒EIF5A2_sh4组。瘤内注射腺病毒(IXlO9 IFU /每个肿瘤)，每周一次，连续四周。腺病毒剂量根据预实验结果制定。多西紫杉醇用法为:腹腔注射，0.311毫克/只/次(用量根据于40 mg/体表面积计算)，每周一次，连续3周。顺钼用法为:0.2毫克/只/次。每两周测量一次肿瘤体积来检测肿瘤生长情况。最后一次腺病毒注射后，处死动物，对肿瘤重量进行测量。实验中所用的shRNA序列如下:
【权利要求】
1.EIF5A2在制备食管鳞状细胞癌的预后诊断试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:EIF5A2高表达表明预后差，EIF5A2高表达的定义为: 荧光定量PCR法:癌组织中EIF5A2的表达量超过癌旁非肿瘤组织的2.5倍； 免疫组化检测法:肿瘤组织中染色深度X染色面积高于癌旁非肿瘤组织。
3.一种治疗食管鳞状细胞癌的制剂，所述制剂含有可以减少EIF5A2的表达量的起效因子。
4.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于:起效因子选自可使EIF5A2表达量下降的shRNA、SiRNA0
5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于:所述shRNA的序列为
【文档编号】G01N33/574GK103468799SQ201310367825
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月21日 优先权日:2013年8月21日
【发明者】关新元, 李焱 申请人:中山大学附属肿瘤医院