一种抗体效价的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗体效价的检测方法，包括如下步骤：1)将抗原偶联微球上，得到改性微球；2)将改性微球与抗体溶液混合反应；3)测定反应液的浊度，确定抗体效价。本发明的方法，利用生物素-链霉亲和素系统将CCP修饰在聚苯乙烯微球表面成功制备颗粒型CCP抗原；采用本方法制备的颗粒型CCP抗原检测血清中抗CCP抗体效价，检测结果线性良好，检测过程20min即可完成，相对于现有ELISA检测方法需耗时2～3h，可以更为快捷的获得检测结果。
【专利说明】一种抗体效价的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗体效价的检测方法，特别涉及利用改性固相载体检测抗体效价的方法。
【背景技术】
[0002]抗体效价是疾病诊断、特异性免疫球蛋白制备和疫苗评价等领域的重要指标，对其检测具有非常实际的意义。在众多的抗体效价测定技术中，ELISA法因为操作简单，速度快，应用最为广泛。
[0003]类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种累及周围关节为主的慢性多系统性炎症性的自身免疫病，特征性的临床表现为多个周围关节慢性炎症性病变，可造成永久性的关节畸形，致残率高，被称为“不死的癌症”。因此早期诊断、早期治疗，可延缓病情进展，降低致残率，改善预后。
[0004]环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide,CCP)是一条人工合成的含有21个氨基酸的多肽，其氨基酸序列为HQCHQESTXGRSRGRCGRSGS，其中X代表瓜氨酸，其通过第3和第16位的半胱氨酸巯基氧化而形成环肽。瓜氨酸残基是类风湿关节炎特异的抗中间丝相关蛋白(filaggrin)抗体识别表位的必需组成部分。抗环瓜氨酸肽抗体(ant1-cycliccitrullinated peptide antibody, ant1-CCP)是环状聚丝蛋白的多肽片段，是以IgG型为主的抗体，对类风湿性关节炎(RA)具有很好的敏感性和特异性，且抗CCP抗体阳性的RA病人骨破坏较抗CCP抗体阴性者严重。2010年由美国风湿病学会(ACR)和欧洲抗风湿联盟(EULAR)—起宣布新的RA分类诊断标准,抗CCP抗体被正式列入类风湿性关节炎的诊断标准之中。
[0005]目前，抗CCP抗体的检测ELISA法应用最广泛。其他检测方法多处于初步的摸索研究阶段，由于检测仪器设备、试剂价格等方面的限制，检测方法仍不成熟，影响检测及诊断性能的因素仍需进一步改进。然而，现有的ELISA法的检测时间还是过长，一般需要2个小时才可以获得结果。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种抗体效价的检测方法。
[0007]本发明所采取的技术方案是:
一种抗体效价的检测方法，包括如下步骤:
1)将抗原偶联微球上，得到改性微球；
2)将改性微球与抗体溶液混合反应；
3)测定反应液的浊度，确定抗体效价。
[0008]一种抗CCP抗体效价的检测方法，包括如下步骤:
I)在CCP多肽上偶联特异性亲和小分子，在微球上偶联特异性亲和小分子的特异性靶标分子； 2)将修饰后的CCP多肽和微球混合，得到颗粒型CCP多肽抗原；
3)将颗粒型CCP多肽抗原与抗体溶液混合，反应；
4)测定反应体系的浊度，确定抗体效价。
[0009]作为本发明的进一步改进，CCP多肽上偶联的特异性亲和小分子为生物素，微球上偶联的特异性靶标分子为链霉亲和素。
[0010]在CCP多肽偶联生物素包括如下步骤:
1)将CCP多肽溶解于缓冲液中，酯化生物素用二甲基亚砜溶解，混合；
2)室温搅拌反应完全，去除未反应的生物素；
3)收集、纯化得到偶联生物素的CCP多肽。
[0011]在微球上偶联链霉亲和素包括如下步骤:
1)将羧基化胶乳微球与乙磺酸缓冲液混合，加入EDC和NHS活化，洗涤得到活化微球；
2)将链霉亲和素溶解于PBS缓冲液中，加入活化微球，室温反应，反应完全后洗涤；
3)用赖氨酸封闭，得到SA修饰微球。
[0012]特别的，上述在微球上偶联链霉亲和素的反应中，链霉亲和素溶解于pH6.8?7.8的PBS缓冲液中。
[0013]更进一步的，EDC和NHS的摩尔比为1:(1?2)。
[0014]本发明的有益效果是:
本发明的方法，利用生物素-链霉亲和素系统将CCP修饰在聚苯乙烯微球表面成功制备颗粒型CCP抗原；采用本方法制备的颗粒型CCP抗原检测血清中抗CCP抗体效价，检测结果线性良好，检测过程20min即可完成，相对于现有ELISA检测方法需耗时2?3h，可以更为快捷的获得检测结果。
[0015]本发明CCP多肽的生物素标记方法，反应条件温和，不会破坏CCP多肽的活性，具有很好的反应活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为生物素修饰CCP结构示意图；
图2为验证生物素修饰CCP效果操作流程图；
图3和图5为实施例1、实施例2中生物素修饰CCP前后紫外吸收光谱变化曲线图；
图4和图6为ELISA验证实施例1、实施例2中生物素修饰CCP与抗体反应抗体浓度与吸光度值的变化关系图；
图7为CCP与聚苯乙烯微球连接过程示意图；
图8为通过颗粒增强免疫比浊法检测抗CCP抗体反应示意图；
图9和图10分别为实施例7、实施例8中通过免疫比浊法检测抗CCP抗体浓度与吸光度的变化值的变化关系图。
【具体实施方式】
[0017]CCP多肽的生物素修饰
合成的CCP多肽溶解于一定浓度一定pH范围的缓冲液中，酯化生物素用二甲基亚砜(DMSO)溶解，迅速与适量CCP多肽溶液混合，室温搅拌孵育4h，然后用脱盐柱去除多余的生物素示。放置收集管与脱盐柱下方，用一定浓度一定PH范围的PBS缓冲液洗脱样品，收集洗脱液，工艺路线如图1所示。取洗脱收集液，根据紫外吸收光谱评价标记效果。ELISA法鉴定生物素化CCP效果，验证路线如图2所示。
[0018]链霉亲和素标记聚苯乙烯微球的制备
1)取0.1mL羧基化胶乳微球，加入0.9mL乙磺酸缓冲液(MES)混合均匀后加入水溶性碳二亚胺类交联剂(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化，EDC浓度1.0-1.5g/L，EDC与NHS比例1:1-1:2之间，室温条件下温和搅拌，时间控制在15-30min ；
2)离心洗涤，转速12000-15000g离心10_30min,用0.lmol/L磷酸缓冲液(PBS)重复清洗沉淀三遍，去上清，沉淀经0.lmol/L PBS重悬、振荡、超声处理后即得到活化的胶乳微球；
3)取2mg链霉亲和素溶于pH6.5-7.8的PBS缓冲液中，加入到ImL经过活化的胶乳微球溶液中，室温条件下温和搅拌，反应时间2-4h ；
4)达到反应时间后，12000-15000g离心10_30min，沉淀用含有0.05-0.l%Tween20的PBS重复洗涤后的微球经超声分散重悬于PBS缓冲液中，加入30-40nmol赖氨酸，室温轻微震荡30-60min, 12000_15000g离心10_30min洗涤三次，超声重悬于0.1M pH7.4 PBS缓冲液中备用。
[0019]下面结合实施例，进一步说明本发明。
[0020]CCP多肽的修饰:
实施例1
1)溶解CCP多肽:制备好的CCP多肽溶解于0.15Μ ρΗ9.0磷酸盐缓冲液中，4°C保存；
2)溶解酯化生物素:用二甲基亚砜(DMSO)溶解酯化生物素；
3)修饰:将溶解后的CCP多肽溶液与溶解后的酯化生物素溶液迅速混合，生物素与CCP的比例为10:1，室温搅拌孵育4h;
4)用脱盐柱去除多余的生物素；
5)用0.05M pH7.6的PBS缓冲液洗脱样品。
[0021]收集洗脱液，根据紫外吸光谱评价标记结果:根据相同浓度(lmg/mL)生物素标记CCP产物与未经生物素标记CCP的紫外吸收光谱图比较，BiOtin-CCP在210nm_230nm之间的吸光度值升高，如图3。用ELISA法鉴定生物素标记CCP效果:将制备的生物素化CCP包被到链霉亲和素包被的酶标板中，检测TMB显色后的OD值。如图4，随着血清中抗CCP抗体浓度的升高，TMB显色的OD值逐渐升高，并存在一定的正相关关系。说明CCP多肽成功标记生物素。
[0022]实施例2
1)溶解CCP多肽:制备好的CCP多肽溶解于0.2M pH9.6磷酸盐缓冲液中，4°C保存；
2)溶解酯化生物素:用二甲基亚砜(DMSO)溶解酯化生物素；
3)修饰:将溶解后的CCP多肽溶液与溶解后的酯化生物素溶液迅速混合，生物素与CCP的比例为10:1。室温搅拌孵育4h ；
4)用脱盐柱去除多余的生物素；
5)用0.1M ρΗ7.2的PBS缓冲液洗脱样品。
[0023]收集洗脱液，根据紫外吸光谱评价标记结果:根据相同浓度(lmg/mL)生物素标记CCP产物与未经生物素标记CCP的紫外吸收光谱图比较，BiOtin-CCP在200nm_230nm之间的吸光度值升高，如图5。
[0024]用ELISA法鉴定生物素标记CCP效果:将制备的生物素化CCP包被到链霉亲和素包被的酶标板中，检测TMB显色后的OD值。如图6，随着血清中抗CCP抗体浓度的升高，TMB显色的OD值逐渐升高，并存在一定的正相关关系。说明CCP多肽成功标记生物素。
[0025]链霉亲和素标记聚苯乙烯微球的制备 实施例3
1)活化:取0.1mL羧基化胶乳微球，加入0.9mL乙磺酸缓冲液(MES)混合。加入EDC和NHS活化，EDC浓度0.6g/L，EDC与NHS比例1: 1，室温条件下温和搅拌15min ；
2)离心洗涤:PBS重复洗涤三遍，去上清，0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球；
3)偶联反应:取2mg链霉亲和素溶于pH6.8的PBS缓冲液中，加入到ImL经过活化的胶乳微球溶液中，室温条件下温和搅拌，反应时间2h ；
4)离心洗涤:PBS重复洗涤三遍，去上清，0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球；
5)封闭:加入20nmol赖氨酸，室温轻微震荡30min，离心洗涤，超声重悬于0.15M pH7.0PBS缓冲液中备用。
[0026]收集洗漆液，SA的浓度测定按照如下公式计算:C = A28tl / E (SA:E=3.4L/g),计算偶联的SA含量。SA偶联量为0.5mg,偶联效率为25%。
[0027]实施例4
1)活化:取0.1mL羧基化胶乳微球，加入0.9mL乙磺酸缓冲液(MES)混合。加入EDC和NHS活化，EDC浓度0.9g/L，EDC与NHS比例1:2，室温条件下温和搅拌15min ；
2)离心洗涤:PBS重复洗涤三遍，去上清，0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球；
3)偶联反应:取2mg链霉亲和素溶于pH7.2的PBS缓冲液中，加入到ImL经过活化的胶乳微球溶液中，室温条件下温和搅拌，反应时间3h ；
4)离心洗涤:PBS重复洗涤三遍，去上清，0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球；
5)封闭:加入20nmol赖氨酸，室温轻微震荡30min，离心洗涤，超声重悬于0.15M pH7.0PBS缓冲液中备用；
收集洗漆液，SA的浓度测定按照如下公式计算:C = A280 / E (SA:E=3.4L/g),计算偶联的SA含量。SA偶联量为0.8mg,偶联效率为40%。
[0028]实施例5
1)活化:取0.1mL羧基化胶乳微球，加入0.9mL乙磺酸缓冲液(MES)混合。加入EDC和NHS活化，EDC浓度1.2g/L，EDC与NHS比例2:3，室温条件下温和搅拌15min ；
2)离心洗涤:PBS重复洗涤三遍，去上清，0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球；
3)偶联反应:取2mg链霉亲和素溶于pH7.6的PBS缓冲液中，加入到ImL经过活化的胶乳微球溶液中，室温条件下温和搅拌，反应时间4h ；
4)离心洗涤:PBS重复洗涤三遍，去上清，0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球；
5)封闭:加入20nmol赖氨酸，室温轻微震荡30min，离心洗涤，超声重悬于0.15M pH7.0PBS缓冲液中备用。
[0029]收集洗漆液,SA的浓度测定按照如下公式计算:C = A280 / E (SA:E=3.4L/g),计算偶联的SA含量。SA偶联量为1.1mg,偶联效率为55% ；实施例6
1)活化:取0.1mL羧基化胶乳微球，加入0.9mL乙磺酸缓冲液(MES)混合。加入EDC和NHS活化，EDC浓度1.5g/L，EDC与NHS比例3:4，室温条件下温和搅拌15min ；
2)离心洗涤:PBS重复洗涤三遍，去上清，0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球；
3)偶联反应:取2mg链霉亲和素溶于pH7.8的PBS缓冲液中，加入到ImL经过活化的胶乳微球溶液中，室温条件下温和搅拌，反应时间4h ；
4)离心洗涤:PBS重复洗涤三遍，去上清，0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球；
5)封闭:加入20nmol赖氨酸，室温轻微震荡30min，离心洗涤，超声重悬于0.15M pH7.0PBS缓冲液中备用。
[0030]收集洗漆液,SA的浓度测定按照如下公式计算:C = A280 / E (SA:E=3.4L/g),计算偶联的SA含量。SA偶联量为1.0mg,偶联效率为50%。
[0031]颗粒型CCP抗原的制备 制备流程如图7所示，具体操作如下:
1)洗涤胶乳微球:链霉亲和素标记微球用0.15M pH7.6 PBS缓冲液洗涤；
2)微球与修饰的CCP结合:lmL10%自制的链霉亲和素化胶乳微球与Img生物素标记CCP多肽，通过室温轻微震荡孵育30min ；
3)离心洗涤:12000g离.心30min洗涤3次，超声重悬，制备颗粒型CCP抗原。
[0032]颗粒型CCP抗原的效果评价
通过检测不同效价的抗CCP抗体血清的吸光度值得变化关系，免疫比浊法检测过程如图8所示，具体操作为:
取不同效价的标准抗CCP抗体样品6 μ 1，与200 μ I试剂R1混合，25°C温育5min ； 加入50 μ I试剂R2,测定其在560nm下的浊度A1 ；
37°C温育15min,测定其在560nm下的池度A2 ；
根据ΔΑ (A2- A1)值,计算抗体的效价；
【权利要求】
1.一种抗体效价的检测方法，包括如下步骤: 1)将抗原偶联微球上，得到改性微球； 2)将改性微球与抗体溶液混合反应； 3)测定反应液的浊度，确定抗体效价。
2.一种抗CCP抗体效价的检测方法，包括如下步骤: 1)在CCP多肽上偶联特异性亲和小分子，在微球上偶联特异性亲和小分子的特异性靶标分子； 2)将修饰后的CCP多肽和微球混合，得到颗粒型CCP多肽抗原； 3)将颗粒型CCP多肽抗原与抗体溶液混合，反应； 4)测定反应体系的浊度，确定抗体效价。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于:CCP多肽上偶联的特异性亲和小分子为生物素，微球上偶联的特异性靶标分子为链霉亲和素。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于:在CCP多肽偶联生物素包括如下步骤: 1)将CCP多肽溶解于缓冲液中，酯化生物素用二甲基亚砜溶解，混合； 2)室温搅拌反应完全，去除未反应的生物素； 3)收集、纯化得到偶联生物素的CCP多肽。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于:在CCP多肽偶联生物素包括如下步骤: I)将CCP多肽溶解于PH9.0?9.6磷酸盐缓冲液中，4°C保存；将酯化生物素溶解2) 二甲基亚砜；按生物素=CCP=IO:1的摩尔比混合两种溶液； 3)室温搅拌4h，使用脱盐柱去除未反应的生物素； 4)用pH7.2?7.6的PBS缓冲液洗脱，得到偶联生物素的CCP多肽。
6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于:在微球上偶联链霉亲和素包括如下步骤: 1)将羧基化胶乳微球与乙磺酸缓冲液混合，加入EDC和NHS活化，洗涤得到活化微球； 2)将链霉亲和素溶解于PBS缓冲液中，加入活化微球，室温反应，反应完全后洗涤； 3)用赖氨酸封闭，得到SA修饰微球。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于:链霉亲和素溶解于pH6.8?7.8的PBS缓冲液中。
8.根据权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于:EDC和NHS的摩尔比为1: (I?
2)。
【文档编号】G01N33/68GK103439515SQ201310354934
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月14日 优先权日:2013年8月14日
【发明者】裘宇容, 付琳, 姜云飞 申请人:南方医科大学