一种利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，包括定向肽库的设计、定向肽库的合成构建、目标蛋白的体外表达纯化、定向肽库与目标蛋白的反应、定向肽库的肽段洗脱分离、定向肽库的肽段线性化、线性化肽段的鉴定测序步骤，所述定向肽库由线性肽或环状肽组成。运用该方法可筛选鉴定出各种激酶、抗体、蛋白酶以及任何可能与蛋白质结合的分子的结合肽段的一致序列。
【专利说明】一种利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于研究化合物与蛋白质相互作用的定向肽库以及定向肽库芯片技术，具体涉及到用简并线性或环状肽库来研究单个化合物与蛋白质相互作用的一致序列，以及用高通量的方法系统性地研究各种蛋白质信号基团之间的特异性作用。
【背景技术】
[0002]许多生物学过程通过蛋白质与其他化合物的相互作用来进行，包括酶和底物的结合(比如激酶，蛋白酶，磷酸酶与它们的底物的结合)，抗原抗体反应，受体与配体的相互作用，以及蛋白特定结构域的相互作用例如SH2结构域与含有磷酸酪氨酸的靶蛋白的相互作用。分析某种物质结合的特异性，比如酶结合的特异性，通常的方法是鉴定其作结合的一系列自然底物所含有的序列特征，通过比较不同的底物的序列，确定该酶所识别结合的一致序列。例如，蛋白激酶的特异性在于在体内和体外识别的底物磷酸化位点。多种研究表明，底物磷酸化位点附近的氨基酸残基决定了体内蛋白激酶是否能对其进行识别。一旦通过实验证明了某种序列特征，根据此一致序列所设计合成的一系列将每个氨基酸残基逐个突变的肽段进行实验，分析磷酸化反应的Km和Vmax的变化。
[0003]然而，用这种经典的方法来鉴定蛋白结合的特异性有严重的局限性。其过程花费的人力物力巨大，假定的结合序列上每一个氨基酸残基都要做突变。而且，如果突变不能覆盖所有其他氨基酸的可能性，理论上则没有达到最优化的实验组合。比如，要确定一个9?
12个氨基酸组成的肽段上的激酶活性位点，按传统的尝试将达到大约2010的组合方式，即1.024X 1013的可能性。另外，传统的方法往往由于底物的不确定性而无法实施。比如，细胞外的信号激活了多种激酶，造成了多种底物的磷酸化，哪种激酶磷酸化哪种底物很难确定。一个更难解决的难题是在鉴定某种蛋白尤其是酶的底物结合特异性时，它们的体内底物往往是低丰度的，体内的方法往往很难做检测。
[0004]寻找特殊蛋白的抑制剂也为临床的应用提供了便利。例如淋巴细胞的激活和人类疾病密切相关，包括移植反应，自身免疫疾病和感染。T细胞的激活需要一些酪氨酸激酶的激活。寻找这些激酶的抑制剂在临床上有极大意义。肽段作为小分子能够作为药物进入细胞并发挥作用，然而目前还没有很好的酪氨酸激酶抑制剂，天然存在的结合底物往往不是最佳的结合底物，如何设计出最佳的结合序列作为药物的应用是难点。
[0005]综上，鉴定某个蛋白的相互作用结合特异性序列很有意义，也迫切需要更简便的方法。本发明利用定向的简并线性或环状肽库，来筛选特定蛋白所结合的一致序列。环状肽库是对线性肽库的改进。线性肽库中的肽段由天然的a-氨基酸组成，缺点在于，这种暴露的线性肽段不能很好地模拟相对较大的蛋白的靶结合序列的空间构像。此外，由天然氨基酸构成的线性肽段在体内很容易被蛋白酶所降解。因此，用于鉴定化合物之间结合序列的新型的肽库和改进的方法的研制很有必要。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法。
[0007]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下:
[0008]一种利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，包括定向肽库的设计、定向肽库的合成构建、目标蛋白的体外细胞表达、定向肽库与目标蛋白的反应、定向肽库的肽段洗脱分离、定向肽库的肽段线性化、线性化肽段的鉴定测序步骤，其特征在于:所述定向肽库由线性肽或环状肽组成，所述线性肽是由(Xaa)n-Zaa-(Xaa)mK示的氨基酸组成的多肽，所述环状肽是由环-((Xaa)n-Zaa-(Xaa)m-R-R')所示的氨基酸组成的多肽；其中，Xaa代表任何天然或非天然的a-氨基酸，Zaa代表非简并的天然或非天然的a_氨基酸，t匕如，针对激酶的底物磷酸化位点特异性序列的肽库，其非简并的氨基酸可以是酪氨酸，丝氨酸或者苏氨酸。R-V是环状肽的连接处，当需要线性化肽段时可将该连接处切开。η和m代表O?10个氨基酸数目。环状肽由线性肽经过肽键环化而成，线性肽库也可以用来进行该技术的操作，但环状肽为优化的方法。
[0009]本发明的定向肽库是指由某些位置的氨基酸序列固定的肽段和其他位置具有各种组合的环状肽段形成的库或者是由线性肽段组成的库。肽库的简并性决定了其多样性，比如在只有两个位置简并的肽库中，包含了 400个唯一肽段(202)，然而，在8个位置简并的库中，大约包括2.5父101°个唯一肽(208)。
[0010]本发明的进一步的技术方案，采用BOP/HOBt化学反应偶联法合成可溶性的线性肽或可溶性的环状肽或在固定支持相上直接合成线性肽或环状肽，采用Na-FMOC封闭法保护线性肽或环状肽的氨基酸，环状肽在R-R,处连接成环，在环状肽库的简并位置，加入等量的不同种的已用Na-FMOC封闭的氨基酸于反应体系中。
[0011]优选的，所述固定支持相为纤维素膜，使用超精密针头在每张大小为8X 12cm的SPOT膜上点样1600个肽段，每个点样的肽段产量约为5nmol。也可将合成的带生物素的多妝库点在芯片上。
[0012]优选的，所述肽段合成的长度为5?25个氨基酸，优选7?15个氨基酸长度，9?11个氨基酸的长度为最佳。羧基端加上其他氨基酸修饰可以促进肽的溶解度，例如多聚赖氨酸的尾巴。为了测序的准确性，可在氨基酸末端加上其他氨基酸，例如在N端可加上Met-Ala双肽。根据需要可以进行修饰的改进，例如在筛选肽段作为抑制剂时，可以在肽段上连入穿膜肽，提高肽段的跨膜特性。
[0013]本发明的进一步的技术方案，目标蛋白的体外表达纯化的方法是用细菌或真核细胞来表达便于纯化的融合蛋白，以GST为优。用昆虫细胞表达GST-目标融合蛋白，昆虫细胞用裂解液裂解，所述裂解液包括20mM Tris pH8.0，150mMNaCl，10%甘油，2mM EDTA，lmM苯甲基磺酰氟化物PMSF，0.15U/mL抑肽酶，20mM亮肽酶素，ImM 二巯基苏糖醇DTT和1%乙基苯基聚乙二醇，随后用谷胱甘肽亲和柱纯化目标蛋白，如GST-SLK1，GST-cyclin B_Cdc2和GST-cyclin A-⑶K2，目标是降低激酶和肽的分离难度或者避免蛋白酶不纯的问题。
[0014]本发明的进一步的技术方案，就蛋白激酶的底物而言，所述定向肽库与目标蛋白的反应体系为:将纯化的目标蛋白加入300 μ L含有Img线性肽或环状肽混合物的溶液中，所需各种因子的浓度为 IOOmM ΑΤΡ，包含约 6 X IO5Cpm 的[y-32P]ATP, ImM DTT，IOmM MgCl2和 50mM ρΗ7.0 的 Tris，室温孵育 IOmin0[0015]本发明的进一步的技术方案，所述定向肽库的肽段洗脱分离的步骤是:肽段混合物以pH5.5-6.0的高盐溶液(如50mM MES，IM NaCl，pH5.5)上柱子，在这种条件下，磷酸化后的肽段结合金属离子柱，而非磷酸化的肽段直接流过柱子，然后柱子用PH6.0的低盐溶液(如pH6.0的50mM MES)洗去非磷酸化肽段的非特异结合以及多余的盐离子，最后，以pH8.0的洗脱溶液(如500mM NH4CO3, pH8.0)洗脱结合的磷酸化肽段。
[0016]如果目标蛋白不是激酶，可将纯化蛋白固定在经磷酸盐缓冲液(PBS溶液)平衡后的琼脂糖珠子上，形成柱子，再与300 μ L含有Img的多肽库以亲合作用的方法富集与纯化蛋白结合的多肽。
[0017]本发明的进一步的技术方案，所述定向肽库的肽段线性化是由溴化氢打断肽键或由蛋白酶切割。
[0018]本发明的进一步的技术方案，所述线性化肽段的鉴定采用Edman降解法或质谱法自动化测序。
[0019]测序之后，对于每个简并位置的氨基酸，用下列的公式计算得到相对丰度:
[0020]
【权利要求】
1.一种利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，包括定向肽库的设计、定向肽库的合成构建、目标蛋白的体外表达纯化、定向肽库与目标蛋白的反应、定向肽库的肽段洗脱分离、定向肽库的肽段线性化、线性化肽段的鉴定测序步骤，其特征在于:所述定向肽库由线性肽或环状肽组成，所述线性肽是由(Xaa)n-Zaa-(Xaa)m所示的氨基酸组成的多肽，所述环状肽是由环-((Xaa)n-Zaa-(Xaa)m-R-R')所示的氨基酸组成的多肽；其中，Xaa代表任何天然或非天然的a-氨基酸，Zaa代表非简并的天然或非天然的a_氨基酸，R-Ri是环状肽的连接处，η和m代表O?10个氨基酸数目。
2.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于:采用BOP/HOBt化学反应偶联法合成可溶性的线性肽或可溶性的环状肽或在固定支持相上直接合成线性肽或环状肽，采用Na-FMOC封闭法保护线性肽或环状肽的氨基酸，环状肽在R-R,处连接成环，在环状肽库的简并位置，加入等量的不同种的已用Na-FMOC封闭的氨基酸于反应体系中。
3.根据权利要求2所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于:所述固定支持相为纤维素膜。
4.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于:所述线性肽或环状肽的肽段长度为5?25个氨基酸。
5.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于:目标蛋白的体外表达纯化的步骤为:用昆虫细胞表达GST-目标融合蛋白，昆虫细胞用裂解液裂解，所述裂解液包括20mM Tris pH8.0,150mM NaCl，10%甘油，2mM EDTA, ImM苯甲基磺酰氟化物PMSF，0.15U/mL抑肽酶，20mM亮肽酶素，ImM 二巯基苏糖醇DTT和1%乙基苯基聚乙二醇，随后用谷胱甘肽亲和柱纯化目标蛋白。
6.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于:所述定向妝库与目标蛋白的反应体系为:将纯化的目标蛋白加入300 μ L含有Img线性肽或环状肽混合物的溶液中，所需各种因子的浓度为IOOmM ATP,包含约6 X IO5Cpm的[Y -32pJATP, ImM DTT，IOmM MgCl2 和 50mM ρΗ7.0 的 Tris,室温孵育 IOmin0
7.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于:所述定向肽库的肽段洗脱分离的步骤是:肽段混合物以ΡΗ5.5-6.0的高盐溶液上金属离子柱，然后柱子用ΡΗ6.0的低盐溶液洗去非磷酸化肽段的非特异结合以及多余的盐离子，最后，以ΡΗ8.0的洗脱溶液洗脱结合的磷酸化肽段。
8.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于:所述定向肽库的肽段线性化是由溴化氢打断肽键或由蛋白酶切割。
9.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于:所述线性化肽段的鉴定采用Edman降解法或质谱法自动化测序。
【文档编号】G01N33/68GK103513039SQ201310290034
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年7月10日 优先权日:2013年7月10日
【发明者】松阳洲 申请人:广州美格生物科技有限公司