一种快速检测中药注射剂综合毒性的生物测试方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测中药注射剂综合毒性的生物测试方法，包括如下步骤：（1)制备测试用菌液：取发光细菌冻干粉，用浓度为1?5%(w/v)的氯化钠溶液复苏，得测试用菌液；（2)检测：取待检样品，用测试用菌液检测，确定发光强度抑制率为50%的稀释度以及稀释度-效应动力曲线。本发明方法检测准确度和灵敏度均较高，操作简单。
【专利说明】一种快速检测中药注射剂综合毒性的生物测试方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速检测中药注射剂综合毒性的生物测试方法。
【背景技术】
[0002] 中药注射剂在我国已经有70多年的应用历史，对心脑血管、抗肿瘤、呼吸系统等 疾病的疗效显著，具有独特的优势，在临床上使用广泛。近年来，随着中药注射剂临床应用 的日趋广泛，不良反应报道亦日渐增多。从2006年"葛根素事件"、"鱼腥草事件"到2008 年的"刺五加事件"、"茵栀黄事件"，再到2009年的"双黄连事件"和"清开灵事件"，让整个 中药注射剂行业陷入信任危机。2006年之后，国家对中药注射剂安全问题的关注达到了前 所未有的高度。 2〇〇9年7月，国家食品药品监管局下发《关于做好中药注射剂安全再评价 工作的通知》，全面开展生产及质量控制环节的风险排查切实控制中药注射剂安全隐患。
[0003] 目前，中药注射剂质量控制检测的项目包括：性状、鉴别、pH值、重金属、灼炽残 渣、有关物质(蛋白质、鞣质、树酯、草酸盐、钾离子)、热原或细菌内毒素、无菌、装量、不溶性 微粒、可见异物、含量测定、降压物质、异常毒性、过敏反应检查、溶血与凝聚、渗透压、有害 元素、聚山梨酯80、5-HMF、指纹图谱、大分子蛋白检查等。但是，这些检测指标仍然无法有效 的保证其药效的一致性和降低其过敏反应的发生率。因此，有必要引入新的质量控制方法。
【发明内容】
[0004]为了解决上述问题，本发明提供了一种快速检测中药注射剂综合毒性的生物测试 方法。
[0005] 本发明快速检测中药注射剂综合毒性的生物测试方法，包括如下步骤：
[0006] (1)制备测试用菌液：取发光细菌冻干粉，用浓度为1?5% (w/v)的氯化钠溶液 复苏，得测试用菌液；
[0007] (2)检测：取待检样品，用测试用菌液检测，确定稀释度-效应动力曲线以及发光 强度抑制率为50%的稀释度。
[0008] 稀释度-效应动力曲线，是指待检溶液稀释度与发光强度抑制率的关系曲线。
[0009] 步骤（1)中，所述发光细菌是费氏弧菌、明亮发光杆菌T3小种、青海弧菌及其它非 致病发光细菌。
[0010]步骤（1)中，所述制备方法是：取型号为CS234的费氏弧菌冻千粉1支，加入 0· 2-1. 0ml的浓度为3% (w/v)的氯化钠溶液复苏，即得测试用菌液。
[0011] 步骤（1)中，所述氯化钠溶液的pH为5?9。
[0012] 步骤（2)所述检测的方法如下：
[0013] a、预测试：取待检样品，用水稀释成5个梯度的待检液，体积百分比分别是：100%、 25%、 6· 25%、1. 5625%、0_ 39%，以1?5% (w/v)的氯化钠溶液为标准液，在所述待测液和标准 液中加入测试用菌液，菌液加入量为待检液或标准液体积的1/25?1/15,放置5?30min, 检测发光强度，计算5个稀释度的发光度抑制率；
[0014] b、确定检测稀释度的上限及下限：根据步骤a的结果，以抑制率为90?1〇〇%的任 一稀释度为上限，若样品原液的抑制率未达到 9〇%,则以样品原液为上限；以抑制率为〇? 10%的任一稀释度为下限；
[0015] c、测试：在步骤b确定的稀释度上限和下限之间增配6?9个均匀稀释梯度的待 检液，以1?5% (w/v)的氯化钠溶液为标准液，在所述待测液和标准液中加入测试用菌液， 菌液加入量为待检液或标准液体积的I/25?1/1 5,放置5?30min，检测发光强度，制作稀 释度-效应动力曲线，计算抑制率为50%的稀释度。
[0016] 本发明稀释度，是指待检溶液被冲淡的程度。例如，1ml中药注射液液用3ml水稀 释，稀释度为25%。
[0017] 如果稀释度的值小，说明待检鱼腥草注射液的毒性大，如果稀释度的值大，说明待 检鱼腥草注射液的毒性小。
[0018] 抑制率为50%的稀释度，即本发明EC5。。
[0019] 步骤a和步骤c中，所述待检液中加有氯化钠，其浓度为3% (w/v);所述标准液中 氯化钠的浓度为3% (w/v)。
[0020] 步骤a和步骤C中，所述待检液和标准液的pH为5?9。
[0021] 步骤a和步骤C中，所述菌液加入量为待检液或标准液体积的1/20。
[0022] 步骤a和步骤c中，所述放置时间为15min。
[0023] 前述检测方法中，发光强度采用型号为LUMIStox300的生物毒性测试仪检测。
[0024]本发明方法可以有效检测中药注射液的毒性，为其临床应用提供可靠依据，同时， 本发明检测方法具有如下优点：（1)检测速度快：在1小时内可以得出结果，评估其综合毒 性；（2)操作简单：无需灌胃、静脉注射等专业技术，操作简单，方便易行；（3)反应灵敏；利 用现代灵敏的光电检测技术，能对极微弱的光强度变化进行检测，比一般生物细胞反应灵 敏几个数量级；（4)能对综合毒性的大小进行判断；（5)细菌样本量大，克服了动物试验中 样本数量少以及个体差异等影响。
[0025]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0026]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1浓度1费氏弧菌发光强度随时间的变化图
[0028] 图2浓度2费氏弧菌发光强度随时间的变化图 [0029] 图3浓度3费氏弧菌发光强度随时间的变化图 [0030] 图4浓度4费氏弧菌发光强度随时间的变化图 [0031] 图5浓度5费氏弧菌发光强度随时间的变化图
[0032]图6鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线 [0033]图7鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线 [0034]图8红花注射液样品A对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线
[0035] 图9红花注射液样品A对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线
[0036] 图10红花注射液样品B对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线
[0037] 图11红花注射液样品B对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线
【具体实施方式】
[0038] 实施例1本发明毒性检测方法
[0039] 1实验材料
[0040] 1· 1 菌种
[0041] 费氏弧菌冻千粉（CS234)，购自北京滨松光子技术股份有限公司，-2(TC避光保存。
[0042] 1. 2主要试剂
[0043] 复苏稀释液：3%氯化钠溶液；
[0044] 渗透压调节液：20%氯化钠溶液；
[0045] 中药注射液：鱼腥草注射液剂，市售。
[0046] 1. 3主要仪器及器材
[0047] LUMIStox3〇0生物毒性测试仪及配套的LUMIStherm预温槽和测试管（Dr. Bruno Lange GmbH)、BCD-539WF电冰箱(海尔）、PB_10酸度计(赛多利斯）
[0048] 2实验方法
[0049] 2. 1测试用菌液的制备
[0050] 从冰箱冷冻室（-20°C)取出费氏弧菌冻干粉1支，置于室温（2(TC左右)平衡15min 后，加入0· 2-1. 0ml复苏稀释液，于室温下放置lOmin,即可用于测试。
[0051] 2· 2预试验
[0052]将中药注射剂用蒸饱水按1 :4稀释成5个浓度梯度（g卩稀释度梯度）：ι〇〇%、25%、 6· 25%、1· 5625%、0_洲％，按2. 3所述制备成待测样品溶液，按2. 5所述方法粗测一遍，确定上 限及下限的浓度（即稀释度）范围。上限为抑制率达到90?1〇〇%时样品的浓度，若样品原 液的抑制率未达到 9〇%，则以样品原液为上限；下限为抑制率达到〇?10%时样品的浓度。 [0053] 2. 3待测样品溶液制备
[0054]在上限和下限之间根据需要再增配6?I2个浓度。将样品用蒸馈水稀释到各浓 度，再将各浓度样品与渗透压调节液以I7:3的比例混合，配制成待测样品溶液，使待测样 品溶液NaCl浓度为3%。
[0055] 2. 4空白对照液(标准液）制备
[0056] 采用复苏稀释液作为空白对照液。
[0057] 2. 5发光强度测定
[0058]待测样品每个浓度准备3支测试管，每支测试管加入lml待测样品，设 3个平行 样；空白对照液也取3支测试管，每支测试管加入imi复苏稀释液，同样设置3个平行样。 用移液器向各测试管中依次加入0. 05ml测试用菌液，轻轻振荡，使之充分混匀，每个测试 管加菌液的间隔时间为I5秒，于育温槽中放置l 5min后用生物毒性测试仪依次间隔15秒 测定各测试管的发光强度，按下式计算抑制率，以EC 5Q(抑制率等于50%时该样品的浓度值） 表示各样品的毒性大小，EC5。值越小，毒性越大。
[0059]
【权利要求】
1. 一种快速检测中药注射剂综合毒性的生物测试方法，其特征在于：包括如下步骤： (1) 制备测试用菌液：取发光细菌冻干粉，用浓度为?5% (w/v)的氯化钠溶液复苏 得测试用菌液； ' (2) 检测：取待检样品，用测试用菌液检测，确定稀释度-效应动力曲线以及发光强度 抑制率为50%的稀释度。 2_根据权利要求1所述的测试方法，其特征在于：步骤（D中，所述发光细菌是费氏弧 菌、明亮发光杆菌T3小种、青海弧菌及其它非致病发光细菌。 '
3.根据权利要求1所述的测试方法，其特征在于：步骤（1)中，所述制备方法是：取型 号为CS234的费氏弧菌冻千粉1支，加入〇· 2-1. (Μ的浓度为3%(w/v)的氯化钠溶液复苏 即得测试用菌液。
4·根据权利要求1所述的测试方法，其特征在于：步骤（丨）中，所述氯化钠溶液的pH为 5?9。
5. 根据权利要求1所述的测试方法，其特征在于：步骤（2)所述检测的方法如下： a、 预测试：取待检样品，用水稀释成5个梯度的待检液，体积百分比分别是：100%、25%、 6· 25%、1· 5625%、〇· 39%，以1?5% (w/v)的氯化钠溶液为标准液，在所述待测液和标准液中 加入测试用菌液，菌液加入量为待检液或标准液体积的1/25?1/15,放置5?30min,检测 发光强度，计算5个稀释度的发光度抑制率； ' b、 确定检测稀释度的上限及下限：根据步骤a的结果，以抑制率为90?100%的任一 稀释度为上限，若样品原液的抑制率未达到 9〇%，则以样品原液为上限；以抑制率为〇?1〇% 的任一稀释度为下限； c、 测试：在步骤b确定的稀释度上限和下限之间增配6?9个均匀稀释梯度的待检液， 以1?5% (w/v)的氯化钠溶液为标准液，在所述待测液和标准液中加入测试用菌液，菌液 加入量为待检液或标准液体积的I/25?1/1 5,放置5?3〇min，检测发光强度，制作稀释 度-效应动力曲线，计算抑制率为50%的稀释度。
6. 根据权利要求5所述的测试方法，其特征在于：步骤a和步骤c中，所述待检液中加 有氯化钠，其浓度为3% (w/v);所述标准液中氯化钠的浓度为3% (w/v)。
7·根据权利要求5所述的测试方法，其特征在于：步骤a和步骤c中，所述待检液和标 准液的pH为5?9。
8. 根据权利要求5所述的测试方法，其特征在于：步骤a和步骤c中，所述菌液加入量 为待检液或标准液体积的1/20。
9. 根据权利要求5所述的测试方法，其特征在于：步骤a和步骤c中，所述放置时间为 15min。
10. 根据权利要求1?9任意一项所述的测试方法，其特征在于：检测发光强度采用型 号为LUMIStox300的生物毒性测试仪检测。
【文档编号】G01N1/28GK104215479SQ201310210195
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年5月30日 优先权日:2013年5月30日
【发明者】赵军宁, 鄢良春, 郑晓秋 申请人:四川省中医药科学院