半胱氨酸蛋白酶抑制剂sn与糖类抗原19-9的联合应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN（Cystatin?SN）与糖类抗原19-9（CA199）的联合应用，具体为Cystatin?SN与CA199在制备诊断和预示大肠癌或胰腺癌标志物中的应用，本发明还公开了大肠癌或胰腺癌标志物的捕获剂，并公开了含有该捕获剂的试剂盒，本发明公开的试剂盒具有特异性好、灵敏度高等优点，能够用于大肠癌或胰腺癌的早期诊断，治疗过程中的疗效监控以及治疗后的转移复发监控。
【专利说明】半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN与糖类抗原19-9的联合应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医学检测领域，涉及半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN (Cystatin SN)与糖类抗原19-9 (CA199)的联合应用。
【背景技术】
[0002]近年来，由于生活水平提高，我国大肠癌发病率急剧上升，达到4.2%。我国大肠癌高发年龄普遍在50岁-60岁，比西方国家平均提早10岁。目前，大肠癌的诊断主要通过大便隐血实验、血液CA199指标、肠镜筛查等，其中大便隐血实验不易被民众接受，其检测筛选检查率低于5%;而肠镜筛查为侵入性，检测痛苦，有出血、穿孔等风险，发现问题进一步进行肠镜检查比例更低，低于3% ;血液CA199指标准确度不高。通过早期发现大肠癌，然后进行早期干预大肠癌预后五年生存率高于90%。因此，如何更早期发现、及时干预，如何实现疗效评估和监测，如何对术后患者进行复发监控，是诊断和监控大肠癌亟待解决的问题。
[0003]胰腺癌是高致死率肿瘤之一，死亡率与发病率之比为0.99:1。1991-2000年全国疾病监测点系统的资料显示胰腺癌死亡率不断上升，居恶性肿瘤的第7位。65-84岁年龄段者的死亡率是15-54岁年龄段的5倍，城市死亡率为农村的2.42-4.68倍，东北和东部地区死亡率明显高于其它地区。常规的确诊手段为内窥镜逆行胰胆管造影(ERCP)、经皮肝穿刺肝胆管造影(PTC)、超声内窥检查(EUS)、胰管内超声、血管造影等，目前胰腺癌尚无高特异性、灵敏的检测生物标志物,用于胰腺癌的血清蛋白标志物有CA19-9、CEA、CA50、CA242等，但这些标志物常用于晚期胰腺癌辅助诊断、疗效评估、转移复发监控等，用于早期预示胰腺癌普遍灵敏度不够。因此，急需寻找一种高灵敏度的标志物，为早期预示胰腺癌奠定基础。
[0004]糖抗原(CA199)是一种含黏液成分的大分子糖蛋白，可表达于多种细胞包括肿瘤细胞表面。在判断大肠癌患者临床分期方面，CA199是比CEA更为敏感的指标。CA199与肿瘤大小、淋巴结转移及浸润深度相关，并可与其它指标联合应用提示血源性复发。CA199是大肠癌患者独立判断预后的指标，血清中高水平的CA199提示大肠癌患者生存期缩短，但是单独使用CA199指标准确度不高。半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN (Cystatin SN)是人类Cystatin家族成员，由CSTl基因编码的含141个氨基酸的蛋白质，分子量为16.4Kda。Cystatin SN分子中含有两个二硫键，为典型的分泌蛋白，分布于体液和分泌物中，如眼泪、唾液、血清、血浆等。据报道，早期结肠癌患者血清或尿液中Cystatin SN含量高于正常人，通过检测Cystatin SN含量可用于结肠癌筛查。但是未见Cystatin SN与CA 199联合应用的报道。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN (Cystatin SN)和糖类抗原19-9 (CA199)在制备诊断和预示大肠癌或胰腺癌标志物中的应用；本发明的目的之二在于提供大肠癌或胰腺癌标志物的捕获剂；本发明的目的之三在于提供含有上述捕获剂的检测试剂盒；本发明的目的之四在于提供试剂盒建立计算诊断和预示大肠癌或胰腺癌阈值的方法。
[0006]为达到上述目的，本发明提供如下技术方案:
[0007]1.半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和糖类抗原19-9在制备诊断和预示大肠癌或胰腺癌标志物中的应用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述糖类抗原19-9的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]优选的，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
[0009]2.大肠癌或胰腺癌标志物的捕获剂，所述标志物为半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和糖类抗原19-9，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述糖类抗原19-9的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]优选的，所述捕获剂为识别半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和糖类抗原19-9的特异性抗体。
[0011]3.含有权利要求3或4所述捕获剂的试剂盒。
[0012]优选的，所述试剂盒为检测血清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和糖类抗原19-9浓度的试剂盒。
[0013]优选的，所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒。
[0014]更优选的，所述试剂盒含有包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
[0015]更优选的，所述单克隆抗体为鼠抗人Cystatin SN单克隆抗体，所述多克隆抗体为兔抗人Cystatin SN多克隆抗体，所述显色底物为四甲基联苯胺。
[0016]4.利用所述试剂盒建立计算诊断和预示大肠癌或胰腺癌阈值的方法，用所述试剂盒检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和糖类抗原19-9浓度，利用P=exp(-6.119-0.053*a+0.509*b)/[1+exp (-6.119-0.053*a+0.509*b)]计算大肠癌阈值 P 或利用 P= [exp (-9.238+0.661*a+0.689*b) ]/[1+exp (-9.238+0.661*a+0.689*b)]计算胰腺癌阈值P，当P大于或等于0.75时，为阳性；当P小于0.75时，为阴性；
[0017]其中a代表Cystatin SN浓度,单位为pg/mL, b代表CA199浓度,单位为ng/mL
[0018]本发明的有益效果:本发明公开了将Cystatin SN和CA199联合用于制备诊断和预示大肠癌或胰腺癌的新标志物，利用两个标志物共同检测大肠癌和胰腺癌的灵敏度高和特异性高于单独检测其中一种标志物；本发明还公开了检测大肠癌或胰腺癌标志物的捕获齐?，将捕获剂与常规试剂组合形成检测试剂盒，形成的试剂盒具有使用方便，重复性好，便于携带等特点，可用于大肠癌或胰腺癌的早期诊断、疗效评估或移转复发监控等，其检测大肠癌的灵敏度为86.9%，特异性为93.6% ;检测胰腺癌的灵敏度为80.2%，特异性为86.8%。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
[0020]图1为Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒检测Cystatin SN蛋白的标准曲线。
[0021]图2为Cystatin SN-CA199联合检测试剂盒检测大肠癌ROC曲线。
[0022]图3为Cystatin SN-CA199联合检测试剂盒检测胰腺癌ROC曲线。
【具体实施方式】[0023]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
[0024]本发明使用的试剂如下:鼠抗人Cystatin SN单克隆抗体购自美国R&D公司(货号为:MAB1285);兔抗人Cystatin SN多克隆抗体、Cystatin SN蛋白标准品购自北京义翘神州生物技术有限公司；CA199-ELISA试剂盒购自MyBioSource公司(货号为:MBS161209)。
[0025]实施例1建立Cystatin SN血清检测反应体系及其优化
[0026]用浓度为5 μ g/mL鼠抗人Cystatin SN单克隆抗体包被ELISA板,于4°C条件下包被过夜，洗板；然后在质量分数为2%的BSA中室温封闭2小时,洗板；将浓度分别为Opg/mL, 50pg/mL, 100pg/mL, 200pg/mL, 400pg/mL, 800pg/mL, 1600pg/mL 的 Cystatin SN 蛋白标准品(编码Cystatin SN蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示)和血清样品加入封闭板中，于37°C反应I小时，洗板；然后用浓度为0.5 μ g/mL HRP标记的兔抗人Cystatin SN多克隆抗体，在37°C条件下反应I小时，洗板；再与四甲基联苯胺(TMB)反应2-3分钟，最后用浓度为2M的硫酸终止反应，并于450nm条件下检测OD值(图1)。由图1可知，CystatinSN酶联免疫检测试剂盒线性范围为50pg/mL-1600pg/mL，在线性范围内标准品线性相关系数r≥0.990，回收率在90%~110%范围内。
[0027]检测体系优化，比对分别由美国R&D，英国Abcam和美国NOVUS B10L0GICALS3个不同公司生产的Cystatin SN单克隆抗体、美国R&D公司和北京义翘神州生物技术有限公司生产的Cystatin SN蛋白标准品和美国R&D,英国Abcam和北京义翅神州生物技术有限公司生产的Cystatin SN多克隆抗体。结果表明，Cystatin SN单克隆抗体优选R&D公司提供的产品，最佳工作浓度为5 μ g/mL ；Cystatin SN蛋白标准品和Cystatin SN多克隆抗体优选北京义翘神州生物技术有限公司产品，最佳工作浓度为0.5μ g/mL，在最佳条件下，可实现背景OD值< 0.1，能够有效区分阴性组与阳性组，且具有统计学意义。
[0028]固相载体的确定:对美国Corning、德国Greiner、美国Thermo和丹麦Nunc4个不同厂家生产的酶标板进行了比较。结果显示，美国corning公司(货号为:9018)和thermo(货号为:468667)公司的酶标板符合背景OD值< 0.1，且信噪比较高。
[0029]包被液的选择:根据抗体包被于固相载体所需要的缓冲体系，ELISA常用包被液为缓冲盐溶液，分别用磷酸盐缓冲液(PH7.5)和碳酸盐缓冲液(pH9.6)检测包被环境对反应体系的影响，结果显示碳酸盐缓冲液(PH9.6)可满足空白组OD值< 0.1，有效区分空白组、阴性组和阳性组，信噪比较高。
[0030]稀释剂的选择:通过实验对比了 2种商品化稀释剂(分别购自天津博美科生物技术有限公司(货号BMKF017-1)和上海西唐生物科技有限公司(货号C0901))和自制稀释剂的稀释效果，主要从保护蛋白能力，自身稳定性两方面评价稀释剂的稀释效果。结果显示自制稀释剂的效果最佳，自制稀释剂各组分的浓度如下:3mM EDTA、质量分数为0.5%的BSA、1XPBS、质量分数为0.05%的Tween-20和质量分数为0.02%的硫柳汞(pH6.0)。
[0031]稳定剂的选择:使用3种稳定剂(3种稳定剂具体如下:稳定剂1:质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油和质量分数为1.3%的NaCl ;稳定剂I1:质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油，质量分数为0.1%的EDTA和质量分数为1.3%的NaCl，稳定剂III:体积分数为68.8%的PBS，体积分数为30%的胎牛血清和质量分数为0.2%的硫柳汞)分别稀释单克隆抗体、蛋白标准品和多克隆抗体至浓度为0.5mg/mL、0.16ng/mL和50 μ g/mL,使用时按体积比为1:100稀释。并于第O天、第7天和第14天进行检测，结果显示稳定剂III效果最佳，其组分为:体积分数为68.8%的PBS、体积分数为30%的胎牛血清、质量分数为0.2%的硫柳萊。
[0032]通过以上研究确定了检测体系的主要组分，并建立Cystatin SN血清检测试剂盒。
[0033]实施例2Cystatin SN血清检测试剂盒
[0034]根据实施例1中建立Cystatin SN血清检测体系构建Cystatin SN酶联免疫检测检测试剂盒，具体组分如表1所示:
[0035]表1.Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒组分
[0036]
【权利要求】
1.半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和糖类抗原19-9在制备诊断和预示大肠癌或胰腺癌标志物中的应用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述糖类抗原19-9的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
3.大肠癌或胰腺癌标志物的捕获剂，其特征在于:所述标志物为半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和糖类抗原19-9，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述糖类抗原19-9的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
4.根据权利要求3所述的捕获剂，其特征在于:所述捕获剂为识别半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和糖类抗原19-9的特异性抗体。
5.含有权利要求3或4所述捕获剂的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒为检测血清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和糖类抗原19-9浓度的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒含有包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
9.根据权利要求8所 述的试剂盒,其特征在于:所述单克隆抗体为鼠抗人CystatinSN单克隆抗体，所述多克隆抗体为兔抗人Cystatin SN多克隆抗体，所述显色底物为四甲基联苯胺。
10.利用权利要求5-9任一项所述试剂盒建立计算诊断和预示大肠癌或胰腺癌阈值的方法，其特征在于:用所述试剂盒检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和糖类抗原19-9浓度，利用 P=exp (-6.119-0.053*a+0.509*b) /[1+exp (-6.119-0.053*a+0.509*b)]计算大肠癌阈值 P 或利用 P= [exp (-9.238+0.661*a+0.689*b)]/[1+exp (-9.238+0.661*a+0.689*b)]计算胰腺癌阈值P，当P大于或等于0.75时，为阳性；当P小于0.75时，为阴性； 其中a代表半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN浓度，单位为pg/mL，b代表糖类抗原19_9浓度，单位为ng/mL。
【文档编号】G01N33/68GK103901206SQ201310165176
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2013年5月7日 优先权日:2013年5月7日
【发明者】王弢, 秦勇, 吴婷婷 申请人:上海良润生物医药科技有限公司