专利名称：甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光传感器的制备及应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于纳米功能材料、临床分析、生物传感技术和电化学技术领域，提供了一种甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光传感器的制备及应用。
背景技术：
肿瘤的早期诊断、早期治疗是提高癌症患者生存率的关键。肿瘤标志物的检测可反映肿瘤的生物学特性，对指导治疗、辅助诊断、判断预后均有重要意义。单一的肿瘤标志物可能敏感性、准确性不够高，器官特异性不够强。联合检测可弥补单指标检测的不足，提高了肿瘤诊断的敏感性、准确性和特异性。肝癌是危及生命的常见病，早期发现、早期诊断是早期治疗的基础和前提，也是有效提高肝癌患者生存率、改善其预后的重要保证。由于癌瘤早期体积微小，肝脏又隐匿于上腹深部，有肋骨做屏障，采用B超、CT扫描等手段均难以早期发现，而且肝脏具有强大的代偿功能，早期常无临床症状，也给肝癌的早期诊断带来困难。联合检测血清甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)肿瘤标志物不仅可用于肝癌的早期诊断，而且也有助于原发性肝癌的鉴别诊断。随着近年来纳米技术的快速发展，各种无机纳米材料如碳纳米管、金属纳米粒子、金属氧化物、半导体和石墨烯等已用于电致化学发光免疫传感器的构建。石墨烯(GrapheneSheets, GS)是一种单层、片状的二维结构,近年来成为理论和实践关注的焦点。介孔材料由于大的比表面积及良好的生物相容性也被广泛的关注。另外，金属纳米材料由于其独特的性质和优点，如导电性好、催化活性高、比表面积大，而被广泛应用于电化学传感器的增敏方 面。本发明制作了单电极双通道电致化学发光免疫传感器，首先在工作电极上修饰纳米介孔金，用来固载甲胎蛋白和癌胚抗原的一抗。采用双抗体夹心免疫分析方法，对二抗的标记方法进行了探讨。采用钼纳米粒子@介孔硅O石墨烯纳米复合材料作为二抗标记物载体，三联吡啶钌和鲁米诺分别用来标记甲胎蛋白二抗和癌胚抗原二抗，在底液中加入三乙醇胺，在不同的电压下，三联吡啶钌与三乙醇胺反应产生电致化学发光信号1，鲁米诺与溶解氧产生电致化学发光信号2，制备出性能优良、灵敏度高的同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原双通道电致化学发光免疫传感器。本发明采用一支玻碳电极，结合电致化学发光技术，实现在一支玻碳电极上实现双通道测定；结合免疫技术，提高了传感器的选择性；该方法节省时间，是一种快速、特异、灵敏的检测方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器的制备方法。本发明的目的之二是将所制备的电致化学发光免疫传感器，用于同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原。本发明的技术方案，包括以下步骤。1.甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
(I)钼纳米粒子O介孔硅O石墨烯纳米复合材料(PtNPs@M-Si@GS)的制备将6 10 mL、2.66 mg/mL氧化石墨烯，0.4 0.6 g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，20 mg氢氧化钠和42 mL超纯水混合，超声3(T50 min ;35 45°C下磁力搅拌，逐滴加入正硅酸四乙酯(TEOS)乙醇溶液，反应10 12 h ;加入80 mL、质量分数为85%的水合肼，65 75°C加热3h，乙醇离心洗涤三次；将产品溶于丙酮中搅拌24 h，离心三次；将产品溶于50 mL乙醇中，加入150 250 UL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，搅拌10 12 h，离心分离；将产品溶于42.5 mL水，得到氨基化介孔硅O石墨烯纳米复合材料(M_Si@GS)。将3 5 mL M-SiiGS水溶液和40 60 mL钼纳米粒子溶液混合，搅拌2 4 h，离心分离两次，真空干燥，得到PtNPsOM-SiOGS。所述的TEOS乙醇溶液是由350 450 μ L TEOS溶于1.6 mL的乙醇中制得。(2)标记二 抗(Ru-PtNPs@M-Si@GS/ant1-AFP 和 luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA)溶液的制备
将0.5 1.5 mg的PtNPsiM-SiiGS分别加入到I 2 mL、I X I(T3 mol/L三联吡啶钌(Ru(bpy)3C12)溶液和I 2 mL、lX10_3 mol/L鲁米诺(Iuminol)溶液中，超声1 3 h,搅拌6 10 h，离心分离，得到二抗标记物 Ru-PtNPs@M-Si@GS 和 luminol-PtNPs@M-Si@GS。将所制得的二抗标记物Ru-PtNPs@M-Si@GS加入到I mL、5 10 μ g/mL甲胎蛋白抗体(ant1-AFP)溶液中，在4°C下震荡孵化20 24 h，离心去除上清液，加入I mL、pH=7.0 7.8的PBS缓冲溶液，得到标记二抗Ru-PtNPs@M-Si@GS/ant1-AFP溶液储存在4°C的冰箱中备用。将所制得的二抗标记物Iuminol-PtNPsOM-SiOGS加入I mL、5 10 μ g/mL癌胚抗原抗体(ant1-CEA)溶液中，在4°C下震荡孵化2(T24 h，离心去除上清液，加入I mL、pH=7.0 7.8的PBS缓冲溶液，得到标记二抗luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA溶液，储存在4 °C的冰箱中备用。(3)甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器的制备方法 I)在工作电极的表面，修饰一层纳米多孔金膜，室温下自然晾干。2)在I)中得到的工作电极的表面上滴加5 10 μ 抗体混合溶液，室温下孵化2 3h,然后用超纯水清洗,晾干。所述抗体混合溶液含甲胎蛋白抗体和癌胚抗原抗体的浓度均为5 10 μ g/mL。3)用超纯水洗去没有交联上的所述甲胎蛋白抗体和癌胚抗原抗体，滴加质量分数为0.5°/Γ %的牛血清白蛋白溶液，37°C下放置f 2 h，用ρΗ=7.(Γ7.8的PBS缓冲溶液洗涤晾干，在4°C下储存备用，制得甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器。2.上述所述甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器，用于甲胎蛋白和癌胚抗原的同时检测，步骤如下:
(I)把已知浓度的甲胎蛋白和癌胚抗原溶液加入到4(Γ60 μ 、ρΗ=7.(Γ7.8的PBS缓冲溶液中，制得抗原混 合溶液，取1(T15 PL抗原混合溶液滴涂到所制备的电致化学发光免疫传感器的工作电极上，放置广2 h。(2)将仙^^咿8麵^齓5/^社^ 溶液和 luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA 溶液等体积混合，制得标记二抗混合溶液，滴涂5 7PL标记二抗混合溶液到工作电极表面上，Γ2 h后用ρΗ=7.(Γ7.8的PBS缓冲溶液洗去未结合上的标记二抗，得到组装的工作电极。(3)将参比电极、对电极和组装的工作电极连接在电致化学发光设备上，在电解槽中加入5 15 mL、2(T30 mmol/L三乙醇胺空气饱和的ρΗ=7.(Γ7.8的PBS缓冲溶液，用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压；Ru-PtNPs@M-Si@GS/ant1-AFP和luminol-PtNPs@M-SiiGS/ant1-CEA分别在不同的电压下产生光信号,根据所得电致化学发光的光信号强度与甲胎蛋白和癌胚抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线。(4)将待测样品溶液代替甲胎蛋白和癌胚抗原的标准溶液，按照所述甲胎蛋白和癌胚抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。(5)用于甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的检测范围:AFP浓度在0.0f 25 ng/mL, CEA 抗原浓度在 0.005 20 ng/mL, AFP 检出限为 2.5 pg/mL, CEA 检出限为 1.0 pg/mL。所述的甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器，所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。本发明具备以下优势:
(I)本发明在一支玻碳电极上实现了甲胎蛋白和癌胚抗原的同时检测。(2)本发明采用PtNPs@M-Si@GS增强电致化学发光信号，从而提高传感器的灵敏度。(3)本发明与其它单通`了检测效率，该免疫传感器的制备对临床早期诊断肝癌具有重要的科学意义和应用价值。
具体实施例方式下面结合实施例进一步说明本发明。实施例1 PtNPsOM-SiOGS 的制备
(I)将6 mL、2.66 mg/mL氧化石墨烯，0.4 g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，20 mg氢氧化钠和42 mL超纯水混合，超声30 min ;35°C下磁力搅拌，逐滴加入正硅酸四乙酯(TEOS)乙醇溶液，反应10 h;加入80 mL、质量分数为85%的水合肼，65°C加热3 h，乙醇离心洗涤三次；将产品溶于丙酮中搅拌24 h，离心三次；将产品溶于50 mL乙醇中，加入150 μ 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，搅拌10h，离心分离；将产品溶于42.5 mL水，得到氨基化介孔硅O石墨烯纳米复合材料(M-Si@GS)。(2)将3 mL M-SiiGS水溶液和40 mL钼纳米粒子溶液混合，搅拌2 h，离心分离两次，真空干燥，得到PtNPsOM-SiOGS。所述的TEOS乙醇溶液是由350 μ L TEOS溶于1.6 mL的乙醇中制得。实施例2 PtNPsiM-SiiGS 的制备
(I)将8 mL、2.66 mg/mL氧化石墨烯，0.5 g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，20 mg氢氧化钠和42 mL超纯水混合，超声40 min ;40°C下磁力搅拌，逐滴加入正硅酸四乙酯(TEOS)乙醇溶液，反应11 h;加入80 mL、质量分数为85%的水合肼，70°C加热3 h，乙醇离心洗涤三次；将产品溶于丙酮中搅拌24 h，离心三次；将产品溶于50 mL乙醇中，加入200 μ 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，搅拌11 h，离心分离；将产品溶于42.5 mL水，得到氨基化介孔硅O石墨烯纳米复合材料(M-Si@GS)。(2)将4 mL M-SiiGS水溶液和50 mL钼纳米粒子溶液混合，搅拌3 h，离心分离两次，真空干燥，得到PtNPsOM-SiOGS。所述的TEOS乙醇溶液是由400 μ L TEOS溶于1.6 mL的乙醇中制得。实施例3 PtNPsiM-SiiGS 的制备
(I)将10 mL、2.66 mg/mL氧化石墨烯，0.6 g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，20 mg氢氧化钠和42 mL超纯水混合，超声50 min ;45°C下磁力搅拌，逐滴加入正硅酸四乙酯(TEOS)乙醇溶液，反应12 h;加入80 mL、质量分数为85%的水合肼，75°C加热3 h，乙醇离心洗涤三次；将产品溶于丙酮中搅拌24 h，离心三次；将产品溶于50 mL乙醇中，加入250 μ 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，搅拌12 h，离心分离；将产品溶于42.5 mL水，得到氨基化介孔硅O石墨烯纳米复合材料(M-Si@GS)。(2)将5 mL M-SiiGS水溶液和60 mL钼纳米粒子溶液混合，搅拌4 h，离心分离两次，真空干燥，得到PtNPsOM-SiOGS。所述的TEOS乙醇溶液是由450 μ L TEOS溶于1.6 mL的乙醇中制得。实施例4 标记二抗(Ru-PtNPs@M-Si@GS/ant1-AFP 和 luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA)溶液的制备
(I)将0.5 mg的PtNPsiM-SiiGS分别加入到I mL、I X I (T3 mol/L三联吡啶钌(Ru (bpy) 3C12)溶液和 I mL、lXl(T3 mol/L 鲁米诺(Iuminol)溶液中，超声 Ih,搅拌 6 h,离心分离，得到二抗标记物 Ru-PtNPs@M-Si@GS 和 luminol-PtNPs@M-Si@GS。(2)将所制得的二抗标记物Ru-PtNPs@M-Si@GS加入到I mL、5 Pg/mL甲胎蛋白抗体(ant1-AFP)溶液中，在4°C下震荡孵化20 h，离心去除上清液，加入I mL、pH=7.0的PBS缓冲溶液，得到标记二抗Ru-PtNPs@M-Si@GS/ant1-AFP溶液储存在4°C的冰箱中备用。(3)将所制得的二抗标记物Iuminol-PtNPsOM-SiOGS加入I mL、5 Pg/mL癌胚抗原抗体(ant1-CEA)溶液中，在4°C下震荡孵化20 h，离心去除上清液，加入I mL、pH=7.0的PBS缓冲溶液，得到标记二抗luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA溶液，储存在4°C的冰箱中备用。实施例5 标记二抗(Ru-PtNPs@M-Si@GS/ant1-AFP 和 luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA)溶液的制备
(I)将 1.0 mg 的 PtNPsiM-SiiGS 分别加入到 1.5 mL、I X I(T3 mol/L 三联吡啶钌(Ru(bpy)3Cl2)溶液和 1.5 mL、lXl(T3 mol/L 鲁米诺(luminol)溶液中，超声 2 h，搅拌 8 h，离心分离，得到二抗标记物 Ru-PtNPsOM-SiOGS 和 luminol-PtNPs@M-Si@GS。(2)将所制得的二抗标记物Ru-PtNPs@M-Si@GS加入到I mL、8 Pg/mL甲胎蛋白抗体(ant1-AFP)溶液中，在4°C下震荡孵化22 h，离心去除上清液，加入I mL、pH=7.5的PBS缓冲溶液，得到标记二抗Ru-PtNPs@M-Si@GS/ant1-AFP溶液储存在4°C的冰箱中备用。(3)将所制得的二抗标记物Iuminol-PtNPsOM-SiOGS加入I mL、8 Pg/mL癌胚抗原抗体(ant1-CEA)溶液中，在4°C下震荡孵化22 h，离心去除上清液，加入I mL、pH=7.5的PBS缓冲溶液，得到标记二抗luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA溶液，储存在4°C的冰箱中备用。实施例6 标记二抗(Ru-PtNPs@M-Si@GS/ant1-AFP 和 luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA)溶液的制备
(I)将1.5 mg的PtNPsiM-SiiGS分别加入到2 mL、lX 1(T3 mol/L三联吡啶钌(Ru (bpy) 3C12)溶液和 2 mL、lXl(T3 mol/L 鲁米诺(luminol)溶液中，超声 3 h,搅拌 10 h,离心分离，得到二抗标记物 Ru-PtNPsOM-SiOGS 和 luminol-PtNPsOM-SiOGS。(2)将所制得的二抗标记物仙^^咿8麵^齓5加入到1 mL、10 Pg/mL甲胎蛋白抗体(ant1-AFP)溶液中，在4°C下震荡孵化24 h，离心去除上清液，加入I mL、pH=7.8的PBS缓冲溶液，得到标记二抗Ru-PtNPs@M-Si@GS/ant1-AFP溶液储存在4°C的冰箱中备用。(3)将所制得的二抗标记物Iuminol-PtNPsOM-SiOGS加入I mL、10 Pg/mL癌胚抗原抗体(ant1-CEA)溶液中，在4°C下震荡孵化24 h，离心去除上清液，加入I mL、pH=7.8的PBS缓冲溶液，得到标记二抗luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA溶液，储存在4°C的冰箱中备用。实施例7甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器的制备方法 (I)在工作电极的表面，修饰一层纳米多孔金膜，室温下自然晾干。(2)在(I)中得到的工作电极的表面上滴加5 PL抗体混合溶液，室温下孵化2 h,然后用超纯水清洗，晾干。
所述抗体混合溶液含甲胎蛋白抗体和癌胚抗原抗体的浓度均为5Pg/mL。(3)用超纯水洗去没有交联上的所述甲胎蛋白抗体和癌胚抗原抗体，滴加质量分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液，37°C下放置I h，用pH=7.0的PBS缓冲溶液洗涤晾干，在4°C下储存备用，制得甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器。实施例8甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器的制备方法 (I)在工作电极的表面，修饰一层纳米多孔金膜，室温下自然晾干。(2)在(I)中得到的工作电极的表面上滴加7 μ 抗体混合溶液，室温下孵化2.5h,然后用超纯水清洗,晾干。所述抗体混合溶液含甲胎蛋白抗体和癌胚抗原抗体的浓度均为8 Pg/mL。(3)用超纯水洗去没有交联上的所述甲胎蛋白抗体和癌胚抗原抗体，滴加质量分数为0.7%的牛血清白蛋白溶液，37°C下放置1.5 h，用pH=7.5的PBS缓冲溶液洗涤晾干，在4°C下储存备用，制得甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器。实施例9甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器的制备方法 (I)在工作电极的表面，修饰一层纳米多孔金膜，室温下自然晾干。(2)在(I)中得到的工作电极的表面上滴加10 μ 抗体混合溶液，室温下孵化3 h,然后用超纯水清洗，晾干。所述抗体混合溶液含甲胎蛋白抗体和癌胚抗原抗体的浓度均为10 Pg/mL。(3)用超纯水洗去没有交联上的所述甲胎蛋白抗体和癌胚抗原抗体，滴加质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，37°C下放置2 h，用pH=7.8的PBS缓冲溶液洗涤晾干，在4°C下储存备用，制得甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器。实施例10甲胎蛋白和癌胚抗原的同时检测
(I)把已知浓度的甲胎蛋白和癌胚抗原溶液加入到40 μ 、ρΗ=7.0的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取10 μ 抗原混合溶液滴涂到所制备的电致化学发光免疫传感器的工作电极上，放置I h。(2)将 Ru-PtNPs@M-Si@GS/ant1-AFP 溶液和 luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA 溶液等体积混合，制得标记二抗混合溶液，滴涂5 μ 标记二抗混合溶液到工作电极表面上，Ih后用pH=7.0的PBS缓冲溶液洗去未结合上的标记二抗，得到组装的工作电极。(3)将参比电极、对电极和组装的工作电极连接在电致化学发光设备上，在电解槽中加入5 mL、20 mmol/L三乙醇胺空气饱和的pH=7.0的PBS缓冲溶液，用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压；Ru-PtNPs@M-Si@GS/ant1-AFP 和 luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA分别在不同的电压下产生光信号，根据所得电致化学发光的光信号强度与甲胎蛋白和癌胚抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线。(4)将待测样品溶液代替甲胎蛋白和癌胚抗原的标准溶液，按照所述甲胎蛋白和癌胚抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。(5)用于甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的检测范围:AFP浓度在0.0f 25 ng/mL, CEA 抗原浓度 在 0.005 20 ng/mL, AFP 检出限为 2.5 pg/mL, CEA 检出限为 1.0 pg/mL。(6)用于1#血清样品中甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的同时检测，采用加标回收法，每种样品平行检测5次，其相对标准偏差低于2.8%，回收率为91.19Γ108%，本发明的检测方法的精密度和准确度均令人满意。实施例11甲胎蛋白和癌胚抗原的同时检测
(I)把已知浓度的甲胎蛋白和癌胚抗原溶液加入到50 μ 、ρΗ=7.5的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取13 PL抗原混合溶液滴涂到所制备的电致化学发光免疫传感器的工作电极上，放置1.5 h0(2)将仙^^咿8麵^齓5/^社^ 溶液和 luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA 溶液等体积混合，制得标记二抗混合溶液，滴涂6 μ 标记二抗混合溶液到工作电极表面上，
1.5 h后用pH=7.5的PBS缓冲溶液洗去未结合上的标记二抗，得到组装的工作电极。(3)将参比电极、对电极和组装的工作电极连接在电致化学发光设备上，在电解槽中加入10 mL、25 mmol/L三乙醇胺空气饱和的pH=7.5的PBS缓冲溶液，用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压；Ru-PtNPs@M-Si@GS/ant1-AFP 和 luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA分别在不同的电压下产生光信号，根据所得电致化学发光的光信号强度与甲胎蛋白和癌胚抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线。(4)将待测样品溶液代替甲胎蛋白和癌胚抗原的标准溶液，按照所述甲胎蛋白和癌胚抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。(5)用于2#血清样品中甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的同时检测，采用加标回收法，每种样品平行检测5次，其相对标准偏差均低于1.5%，回收率为95.219Γ106 %，本发明的检测方法的精密度和准确度均令人满意。实施例12甲胎蛋白和癌胚抗原的同时检测
(I)把已知浓度的甲胎蛋白和癌胚抗原溶液加入到60 μ 、ρΗ=7.8的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取15 μ 抗原混合溶液滴涂到所制备的电致化学发光免疫传感器的工作电极上，放置2 h0(2)将仙^^咿8麵^齓5/^社^ 溶液和 luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA 溶液等体积混合，制得标记二抗混合溶液，滴涂7PL标记二抗混合溶液到工作电极表面上，2h后用pH=7.8的PBS缓冲溶液洗去未结合上的标记二抗，得到组装的工作电极。( 3 )将参比电极、对电极和组装的工作电极连接在电致化学发光设备上，在电解槽中加入15 mL、30 mmol/L三乙醇胺空气饱和的pH=7.8的PBS缓冲溶液，用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压；Ru-PtNPs@M-Si@GS/ant1-AFP 和 luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA分别在不同的电压下产生光信号，根据所得电致化学发光的光信号强度与甲胎蛋白和癌胚抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线。(4)将待测样品溶液代替甲胎蛋白和癌胚抗原的标准溶液，按照所述甲胎蛋白和癌胚抗原的工 作曲线的绘制方法进行检测。(5)用于3#血清样品中甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的同时检测，采用加标回收法，每种样品平行检测5次，其相对标准偏差均低于4.5%，回收率为94.89Γ104 %，本发明的检测方法的精密度和准确度均令人满意。
权利要求
1.甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)钼纳米粒子O介孔硅O石墨烯纳米复合材料(PtNPs@M-Si@GS)的制备 将6 10 mL、2.66 mg/mL氧化石墨烯，0.4 0.6 g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，20 mg氢氧化钠和42 mL超纯水混合，超声3(T50 min;35 45°C下磁力搅拌，逐滴加入正硅酸四乙酯(TEOS)乙醇溶液，反应10 12 h ;加入80 mL、质量分数为85%的水合肼，65 75°C加热3h，乙醇离心洗涤三次；将产品溶于丙酮中搅拌24 h，离心三次；将产品溶于50 mL乙醇中，加入150 250 μ 3_氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，搅拌l(Tl2 h，离心分离；将产品溶于42.5 mL水，得到氨基化介孔硅O石墨烯纳米复合材料(M-SiOGS)； 将:Γ5 mL M-SiOGS水溶液和4(T60 mL钼纳米粒子溶液混合，搅拌2 4 h，离心分离两次，真空干燥，得到PtNPsOM-SiOGS ； 所述的TEOS乙醇溶液是由350 450 μ L TEOS溶于1.6 mL的乙醇中制得； (2)标记二抗(仙^^咿8麵^齓5/^11衍-4 和luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA)溶液的制备 将0.5 1.5 mg的PtNPsiM-SiiGS分别加入到I 2 mL、I X I(T3 mol/L三联吡啶钌(Ru(bpy)3C12)溶液和I 2 mL、lX10_3 mol/L鲁米诺(Iuminol)溶液中，超声1 3 h,搅拌6 10 h，离心分离，得到二抗 标记物 Ru-PtNPs@M-Si@GS 和 luminol-PtNPs@M-Si@GS ； 将所制得的二抗标记物Ru-PtNPs@M-Si@GS加入到I mL、5 10 Pg/mL甲胎蛋白抗体(ant1-AFP)溶液中，在4°C下震荡孵化20 24 h，离心去除上清液，加入I mL、pH=7.0 7.8的PBS缓冲溶液，得到标记二抗Ru-PtNPs@M-Si@GS/ant1-AFP溶液储存在4°C的冰箱中备用； 将所制得的二抗标记物Iuminol-PtNPsOM-SiOGS加入I mL、5 10 Pg/mL癌胚抗原抗体(ant1-CEA)溶液中，在4°C下震荡孵化20 24 h，离心去除上清液，加入I mL、pH=7.0 7.8的PBS缓冲溶液，得到标记二抗luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA溶液，储存在4°C的冰箱中备用; (3)甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器的制备方法 1)在工作电极的表面，修饰一层纳米多孔金膜，室温下自然晾干； 2)在I)中得到的工作电极的表面上滴加5 10μ 抗体混合溶液，室温下孵化2 3 h,然后用超纯水清洗，晾干； 所述抗体混合溶液含甲胎蛋白抗体和癌胚抗原抗体的浓度均为5 10 Pg/mL ； 3)用超纯水洗去没有交联上的所述甲胎蛋白抗体和癌胚抗原抗体，滴加质量分数为0.5°/Γ %的牛血清白蛋白溶液，37°C下放置f 2 h，用ρΗ=7.(Γ7.8的PBS缓冲溶液洗涤晾干，在4°C下储存备用，制得甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器。
2.如权利要求1所述甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器，用于甲胎蛋白和癌胚抗原的同时检测，步骤如下: (1)把已知浓度的甲胎蛋白和癌胚抗原溶液加入到4(Γ60μ 、ρΗ=7.(Γ7.8的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取1(T15 PL抗原混合溶液滴涂到所制备的电致化学发光免疫传感器的工作电极上，放置广2 h ； (2)将仙^^咿8麵^齓5/^社^ 溶液和luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA 溶液等体积混合，制得标记二抗混合溶液，滴涂5 7μ 标记二抗混合溶液到工作电极表面上，f 2h后用ρΗ=7.(Γ7.8的PBS缓冲溶液洗去未结合上的标记二抗，得到组装的工作电极； (3 )将参比电极、对电极和组装的工作电极连接在电致化学发光设备上，在电解槽中加入5 15 mL、2(T30 mmol/L三乙醇胺空气饱和的ρΗ=7.(Γ7.8的PBS缓冲溶液，用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压；Ru-PtNPs@M-Si@GS/ant1-AFP和luminol-PtNPs@M-Si@GS/ant1-CEA分别在不同的电压下产生光信号，根据所得电致化学发光的光信号强度与甲胎蛋白和癌胚抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线； (4)将待测样品溶液代替甲胎蛋白和癌胚抗原的标准溶液，按照所述甲胎蛋白和癌胚抗原的工作曲线的绘制方法进行检测`。
全文摘要
本发明提供了一种甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光传感器的制备及应用，属于纳米功能材料、临床分析、生物传感技术和电化学技术领域。本发明利用铂纳米粒子@介孔硅@石墨烯纳米复合材料(PtNPs@M-Si@GS)导电能力强、稳定性好、比表面积大、生物相容性好、催化活性强等特点，标记甲胎蛋白二抗(anti-AFP)和癌胚抗原的二抗(anti-CEA)，从而制得标记二抗Ru-PtNPs@M-Si@GS/anti-AFP和luminol-PtNPs@M-Si@GS/anti-CEA，显著提高了传感器的灵敏度。与其它单通道电极传感器相比，可以在同一支电极上一次性同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原，显著提高了检测效率，对临床早期诊断肝癌具有重要的科学意义和应用价值。
文档编号G01N21/76GK103245656SQ201310147439
公开日2013年8月14日 申请日期2013年4月25日 优先权日2013年4月25日
发明者李玉阳, 魏琴, 杜斌, 吴丹, 李燕, 李贺, 马洪敏, 张勇 申请人:济南大学