专利名称：一种稳定的α-淀粉酶检测试剂及应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及用于临床测定血清和尿液中a -淀粉酶(AMY)活性的检测方法及试剂。
背景技术：
a -淀粉酶(EC3.2.1.1)是最早应用于临床检验的一个酶，早在20世纪初，就用来诊断急性胰腺炎，但是血清和尿液中的a -淀粉酶测定，长期以来一直是最难标准化的分析法。a -淀粉酶能水解淀粉、糖原和其它葡萄糖聚合物的a _1，4_糖苷键。淀粉分子是由许多葡萄糖分子组成的带分支的大分子多糖，直链部分的葡萄糖单体通过a-l，4-糖苷键相连，分支处则以a-1，6-糖苷键相连，因此，淀粉经a-淀粉酶可水解生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽寡糖及糊精的混合物。大多数淀粉含2(T28%的直链淀粉和72 80%的支链淀粉。血、尿a-淀粉酶(AMY)测定在临床上的应用已有很长的历史，到目前为止，测定方法已不下200种。应用于淀粉酶测定的底物种类繁多，早期的测定方法所采用的底物是淀粉，六十年代出现了以染色淀粉为底物的测定方法，由于淀粉结构组成的不确定性及酶解产物的不均一性，使酶促反应不能按化学式量进行计算。应用不同来源、厂家、批号的淀粉作底物时，测得结果差别较大，方法不易标准化。染色淀粉中色素的加入量不易控制，操作繁杂，不适合自动分析。七十年代后期，国外出现了以具有明确结构组成的人工合成底物进行a-淀粉酶测定的方法，这些方法成为现在检测a-淀粉酶的主流，但是各个方法也存在着一些弊端，IFCC批准了用亚乙基封闭的G7-PNP作底物的酶偶联法(EPS法)作为临时推荐方法，但该法需工具酶，并需多步水解完成，延迟时间长，这不是最理想的参考方法。使用2-氯-4-硝基苯-麦芽三糖(G3-CNP)作底物直接测定淀粉酶也有多篇文献报道，该法延滞时间较短，CNP的摩尔消光系数不易受pH的影响，G3-CNP法更符合IFCC提出的理想AMS测定方法的条件，但因受内源性葡萄糖苷酶的干扰，被IFCC拒绝成为参考方法。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种检测a-淀粉酶的试剂及方法，本发明以2-氯-4-硝基苯-麦芽糖苷(Gal-G2-CNP)为底物，在非还原性末端用半乳糖代替葡萄糖，从而避免了内源性葡萄糖苷酶的影响，使用2-氯-4-硝基苯-麦芽糖苷(Gal-G2-CNP)作为底物，不需要再加工具酶，延滞时间较短，反应产物CNP的摩尔消光系数不易受pH的影响，用半乳糖修饰麦芽寡糖苷的非还原端残基，阻止底物的非特异性水解，底物的稳定性显著提高。同时加入一些防腐剂、离子类以及一些易溶的表面活性剂，增强了溶液的稳定性，使试剂达到临床应用要求。本发明的技术方案如下:
一种稳定的a -淀粉酶检测试剂，包括体积比为4:1的缓冲液和底物液，
所述缓冲液的组成为:pH7.0MES 缓冲液50-200mmol/L
NaCl60-100 mmol/L
CaCl210-20 mmol/L
防腐剂 NaN3l-10g/L ；
所述底物液的组成为:
pH7.0MES 缓冲液50-200mmol/L
2-氯-4-硝基苯-麦芽糖苷 30-50 mmol/L 防腐剂 NaN3l-10g/L ；
所述MES缓冲液的pH值范围为6.5-7.5 ；
进一步的，所述缓冲液和底物液中还包括十二烷基苯磺酸钠l_20g/L。本发明采用如下步骤检测a -淀粉酶的活性:按配比配制缓冲液和底物液；采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，将缓冲液和底物液按照4:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、朗道标准品和样本，先通过检测蒸馏水和朗道标准品获得标准品检测的吸光度变化，根据朗道标准品AMY试剂的靶值(105U/L)，得到试剂的K因子，之后根据全自动生化分析仪测定的样本的吸光度，获得样本的a -淀粉酶浓度。本发明具有如下有益效果:所用的检测底物为2-氯-4-硝基苯-麦芽糖苷(Gal-G2-CNP)，不需要再加工具酶，减少了试剂的成本，用半乳糖修饰麦芽寡糖苷的非还原端残基，阻止底物的非特 异性水解，底物的稳定性显著提高，而且反应延滞时间较短，反应产物CNP的摩尔消光系数不易受pH的影响，通过验证，本试剂与同类检测试剂对比相关性好，临床检测样本结果一致，能够达到市场对产品的应用要求，试剂添加表面活性剂十二烷基苯磺酸钠，稳定性更好，是一种更加稳定、良好的a -淀粉酶检测试剂。
图1为实施例1试剂与GmbH公司试剂盒对比检测结果。
图2为表面活性剂对试剂稳定性的影响图。
具体实施例方式 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
本实施例描述的a -淀粉酶检测试剂，包括体积比为4:1的缓冲液和底物液:
缓冲液配比如下:
pH7.0MES 缓冲液100 mmol/L
NaCl80 mmol/L
CaCl215 mmol/L
防腐剂 NaN32g/L ；
底物液配比如下:
pH7.0MES 缓冲液100 mmol/L
2-氯-4-硝基苯-麦芽糖苷(Gal-G2-CNP)50 mmol/L
防腐剂 NaN32g/L。
本实施例描述的a-淀粉酶检测试剂，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如东芝40全自动分析仪，将组分A和组分B按照4:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、朗道标准品和样本，先通过检测蒸馏水和朗道标准品获得标准品检测的吸光度变化，根据朗道标准品AMY试剂的靶值(105U/L)，得到试剂的K因子，之后根据全自动生化分析仪测定的样本的吸光度，就可以获得样本的a-淀粉酶浓度。操作如表1:
表I a-淀粉酶检测试剂检测方法
权利要求
1.一种稳定的a-淀粉酶检测试剂，包括体积比为4:1的缓冲液和底物液， 所述缓冲液的组成为: pH7.0MES 缓冲液50-200mmol/LNaCl60-100 mmol/LCaCl210-20 mmol/L防腐剂 NaN3l-10g/L ； 所述底物液的组成为: pH7.0MES 缓冲液50-200mmol/L 2-氯-4-硝基苯-麦芽糖苷 30-50 mmol/L 防腐剂 NaN3l-10g/L ； 所述MES缓冲液的pH值范围为6.5-7.5。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述缓冲液和底物液中还包括十二烷基苯磺酸钠l-20g/L。
3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，包括体积比为4:1的缓冲液和底物液: 缓冲液配比如下: pH7.0MES 缓冲液100 mmol/LNaCl80 mmol/L CaCl215 mmol/L 十二烧基苯磺酸钠lg/L防腐剂 NaN32g/L ； 底物液配比如下: pH7.0MES 缓冲液100 mmol/L2-氯-4-硝基苯-麦芽糖苷(Gal-G2-CNP)50 mmol/L 十二烧基苯磺酸钠lg/L防腐剂 NaN32g/L。
4.一种应用权利要求1、2或3所述的检测试剂检测a-淀粉酶的方法，其特征在于，按配比配制缓冲液和底物液；采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，将缓冲液和底物液按照4:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、朗道标准品和样本，先通过检测蒸馏水和朗道标准品获得标准品检测的吸光度变化，根据朗道标准品AMY试剂的靶值(105U/L)，得到试剂的K因子，之后根据全自动生化分析仪测定的样本的吸光度，获得样本的a -淀粉酶浓度。
全文摘要
本发明涉及一种稳定的α-淀粉酶检测试剂及应用，所述检测试剂包括体积比为4:1的缓冲液和底物液，所述缓冲液由MES缓冲液、NaCl 、CaCl2 、十二烷基苯磺酸钠 和防腐剂 NaN3 按一定配比配制而成；所述底物液由MES缓冲液 、2-氯-4-硝基苯-麦芽糖苷(Gal-G2-CNP) 、十二烷基苯磺酸钠 、防腐剂 NaN3 按一定配比配制而成；本发明 在应用中不需要再加工具酶，减少了试剂的成本，用半乳糖修饰麦芽寡糖苷的非还原端残基，阻止底物的非特异性水解，底物的稳定性显著提高，而且反应延滞时间较短，反应产物CNP的摩尔消光系数不易受pH的影响。
文档编号G01N21/31GK103207156SQ201310103140
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月28日 优先权日2013年3月28日
发明者谭柏清, 王进, 甘宜梧 申请人:山东博科生物产业有限公司