专利名称：一种测定苏云金芽孢杆菌毒蛋白Cry1Ac的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定苏云金芽孢杆菌毒蛋白CrylAc的方法，特别是基于Fe3O4OAu纳米粒子的电化学发光免疫传感器的研制及苏云金芽孢杆菌毒蛋白CrylAc测定的方法。
背景技术：
纳米粒子具有大的比表面积、高表面活性、表面活性中心多、催化效率高，因此可以增加生物活性物质的稳定性和吸附量。Fe3O4纳米粒子具有超顺磁性、低毒性、制备工艺简单的特性。但是，单独的Fe3O4纳米粒子在储存过程中易氧化和团聚。在纳米粒子表面包覆一层无机膜可以克服上述缺点。Fe3O4纳米粒子表面包覆纳米Au形成核壳型结构，既可以防止Fe3O4被氧化，又可以增强其稳定性和生物相容性。核壳型Fe3O4OAu纳米粒子具有高灵敏性、电极表面易更新等优点。CrylAc蛋白是由苏云金芽孢杆菌HD-73菌株产生的。从食品安全的角度来说，需要建立一种转基因植物中的CrylAc毒蛋白的高灵敏检测的分析方法。目前，已经建立了很多检测转基因Bt毒蛋白CrylAc的方法，如免疫PCR技术、电化学方法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、毛细管电动色谱法等。然而，已经建立的转基因产物的检测方法耗时、耗力、操作复杂、准确性低。电化学发光免疫分析结合了高灵敏的电化学发光检测技术和特异性免疫反应，因此具有灵敏度高、选择性好、特异性强的优点。然而，电致化学发光免疫传感器检测转基因植物蛋白，尤其是基于核壳型Fe3O4OAu纳米粒子检测转基因Bt毒蛋白CrylAc的传感器未见报道。
发明内容
本发明的目的在于制作一种基于Fe3O4OAu纳米粒子的电化学发光免疫传感器,并且对苏云金芽孢杆菌毒蛋白CrylAc进行测定的方法。构思如下:研究发现一抗接到Fe3O4OAu纳米粒子表面,与抗原、葡萄糖氧化酶标记二抗特异性免疫反应形成三明治结构复合物。葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖生成H2O2 ;在工作电极上加电压激发鲁米诺氧化；鲁米诺氧化物和H2O2反应产生电化学发光信号；随着葡萄糖氧化酶浓度的增大，电化学发光信号显著增强，在一定范围内可以用来检测苏云金芽孢杆菌毒蛋白CrylAc的浓度。本发明涉及基于Fe3O4OAu纳米粒子的电化学发光免疫分析技术；当转基因CrylAc蛋白抗原浓度改变时，葡萄糖氧化酶标记二抗的浓度随之改变，检测到的电化学发光强度发生改变，电化学发光信号与CrylAc蛋白抗原的浓度在O到6 ng/mL范围内成线性关系。具体步骤为:
(I)磁控玻碳电极(GCE)的制作:
截取内径2.5 6.0 mm的玻璃管，把铁棒两端磨平并清洗干净；将玻碳放入玻璃管一端，然后将铁棒插入玻璃管并紧贴玻碳；铁棒周围用熔融的固体石蜡固定；电极表面在麂皮上分别用粒径1.0,0.3和0.05 Mm的氧化铝粉抛光，清洗后待用。(2 )化学共沉淀法合成Fe3O4核:在N2保护下，在50 ° C、剧烈搅拌条件下，将5 50 mL摩尔浓度为2 mol/L的NaOH溶液加入I 10 g FeSO4WH2O与0.29 2.9 g FeCl3的混合物中，反应过程中保持pH为10不变，继续加热至80 ° C熟化I小时，用外加磁铁分离得到黑色沉淀物，用二次蒸馏水反复清洗干净至上清液成中性，得Fe3O4核。(3)核壳型Fe3O4OAu纳米粒子的合成:
将0.29 2.9 g柠檬酸钠溶解在100 mL二次蒸馏水中，在搅拌下加热到90 ° C，立即加入50 100 mg Fe3O4和2 10 mL摩尔浓度为0.01 mol/L HAuCl4的混合溶液，继续加热10 20分钟，移去热源继续搅拌15 20分钟，冷却至室温，通过外加磁力分离核壳型磁性纳米粒子，用二次蒸馏水清洗，重新分散在10 30 mL 二次蒸馏水中，得核壳型Fe3O4OAu纳米粒子。(4) Ant1-CrylAc/Fe304iAu 的制备:
将2.0 mL步骤(3)制得的核壳型Fe3O4OAu纳米粒子，搅拌下加入I mL摩尔浓度为10mmol/L的硫脲溶液反应2小时，用磁铁分离后，加入2 mL质量百分比浓度为99%的戊二醛反应I小时，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液彻底清洗干净，加入50 μ 浓度为0.1 mg/mL的ant1-CryIAc溶液,定容至2 mL,4 ° C缓慢搅拌下反应10小时,得到的ant1-CrylAc/Fe3O4OAu纳米粒子溶液置于冰箱中密闭保存。(5)双抗夹心法制作免疫传感器:
将步骤(I)制得的电极倒置并用磁铁吸住中心铁棒，首先吸取10 30 μ 步骤(4)制得的anti_CrylAc/Fe304@Au纳米粒子悬浮液滴到电极表面,使其分散,为封闭非特异性吸附，将电极浸入质量百分比为1%的牛血清白蛋白溶液中，接着将修饰电极浸入6 ng/mL CrylAc蛋白中孵化20 40分钟,最后浸入21 ng/mL葡萄糖氧化酶标记ant1-CryIAc溶液中免疫反应20 40分钟 ，形成三明治结构免疫复合物，未键合的多余的抗体用0.1mol/L磷酸盐吐温缓冲溶液清洗干净，免疫传感器不用时，置于4 ° C储存。(6)检测方法:
使用MP1-E型电化学发光分析系统，在10 mL包含0.6 mmol/L鲁米诺和I mmol/L葡萄糖的0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲溶液中，Tris-HCl缓冲溶液pH为8.5，进行ECL信号检测，扫描范围:-0.3 ^ 0.6 V (vs.SCE);扫速:100 mV/s ;光电倍增管高压:800 V，采样速率:10 T/S，放大倍数:4，测量时间:90秒，免疫传感器不用时置于冰箱(4 ° C)中保存；
(7)标准工作曲线的绘制:
将步骤(I)制得的电极倒置并用磁铁吸住中心铁棒，首先吸取10 30 μ 步骤(4)制得的anti_CrylAc/Fe304@Au纳米粒子悬浮液滴到电极表面,使其分散,为封闭非特异性吸附，将电极浸入质量百分比为1%的牛血清白蛋白溶液中，接着将修饰电极浸入不同浓度的CrylAc蛋白中孵化20 40分钟,最后浸入21 ng/mL葡萄糖氧化酶标记ant1-CryIAc溶液中免疫反应20 40分钟，形成三明治结构免疫复合物，未键合的多余的抗体用0.1mol/L磷酸盐吐温缓冲溶液清洗干净；电化学发光强度J在CrylAc浓度C为O 6 ng/mL范围内成线性关系；线性回归方程为/ = 520.81 + 1862.27 C (ng/mL)，线性相关系数r=0.9991ο本发明灵敏度高，检测限低，应用广泛，为可靠地、超灵敏检测转基因植物的检测提供了广阔的应用前景。
图1为本发明实施例免疫传感器的CV和ECL响应图。图2为本发明实施例免疫传感器对CrylAc的电化学发光响应图。
具体实施例方式实施例:
(I)磁控玻碳电极(GCE)的制作:
截取3 cm的铁棒(直径2.55 mm)和2 cm玻璃管(直径3 mm),两端磨平并清洗干净；将玻碳放入玻璃管一端，然后将铁棒插入玻璃管并紧贴玻碳，铁棒周围用熔融的固体石蜡固定，电极表面在麂皮上分别用粒径1.0,0.3和0.05 μ 的氧化铝粉抛光，清洗后待用。(2)化学共沉淀法合成Fe3O4核:
在N2保护下，在50 ° C、剧烈搅拌条件下，将15 mL摩尔浓度为2 mol/L的NaOH溶液加入2 g FeSO4.7Η20与0.58 g FeCl3的混合物中；实验过程中保持pH为10不变；继续加热至80 ° C熟化I小时；用外加磁铁分离得到黑色沉淀物，用二次蒸馏水反复清洗干净至上清液成中性，得Fe3O4核。(3)核壳型Fe3O4OAu纳米粒子的合成:
将2.29 g柠檬酸钠溶解在100 mL 二次蒸馏水中，在搅拌下加热到90 ° C ;立即加入80 mg步骤(2)制得的Fe3O4和5 mL摩尔浓度为0.01 mol/L的HAuCl4溶液，继续加热15分钟，移去热源继续搅拌20分钟，冷却至室温；通过外加磁力分离核壳型磁性纳米粒子，用二次水蒸馏清洗，重新分散在20 mL 二次蒸馏水中，得核壳型Fe3O4OAu纳米粒子。(4) Ant1-CrylAc/Fe304iAu 的制备:
将2 mL步骤(3)制得的核壳型Fe3O4OAu粒子,搅拌下加入I mL摩尔浓度为10 mmol/L硫脲溶液反应2小时，用磁铁分离后，加入2 mL质量百分比浓度为99%的戊二醛反应I小时；用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液彻底清洗干净，加入50 PL浓度为0.1 mg/mL的ant1-CrylAc溶液，定容至2 mL,4 ° C缓慢搅拌下反应10小时，得到的ant1-CrylAc/Fe3O4OAu纳米粒子溶液置于冰箱中密闭保存。(5)双抗夹心法制作免疫传感器:
将步骤(I)所得电极倒置并用磁铁吸住中心铁棒，首先吸取20 μ ant1-CrylAc/Fe304iAu纳米粒子悬浮液滴到电极表面，使其分散；为封闭非特异性吸附，将电极浸入质量百分比为1%的牛血清白蛋白溶液中；接着将修饰电极浸入6 ng/mL的Cry I Ac抗原中孵化30分钟；最后浸入21 ng/mL葡萄糖氧化酶标记ant1-CryIAc溶液中免疫反应30分钟,形成三明治结构免疫复合物；未键合的多余的抗体用0.1 mol/L磷酸盐吐温缓冲溶液清洗干净，得免疫传感器；免疫传感器不用时，置于4 ° C储存。(6)检测方法:
实验中使用MP1-E型电化学发光分析系统,在10 mL包含0.6 mmol/L鲁米诺和I mmol/L葡萄糖的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液中，Tris-HCl缓冲溶液pH为8.5，进行ECL信号检测；扫描范围:-0.3 - 0.6 V (vs.SCE);扫速:100 mV/s ;光电倍增管高压:800 V，采样速率:10 T/S，放大倍数:4，测量时间:90秒；免疫传感器不用时置于冰箱(4 ° C)中保存。(7)标准工作曲线的绘制:
将步骤(I)所得电极倒置并用磁铁吸住中心铁棒，首先吸取20 μ ant1-CrylAc/Fe304iAu纳米粒子悬浮液滴到电极表面，使其分散；为封闭非特异性吸附，将电极浸入质量百分比含量为1%的牛血清白蛋白溶液中；接着将修饰电极浸入不同浓度的CrylAc抗原中孵化30分钟,最后浸入21 ng/mL葡萄糖氧化酶标记ant1-CryIAc溶液中免疫反应30分钟,形成三明治结构免疫复合物；未键合的多余的抗体用0.1 mol/L磷酸盐吐温缓冲溶液清洗干净；电化学发光强度/在CrylAc浓度C为O 6 ng/mL范围内成线性关系；线性回归方程为J = 520.81 + 1862.27 CXng/mL)，线性相关系数r=0.9991 ;转基因CrylAc蛋白抗原浓度与ECL信号关系如图2所示。(8)实际检测应用:
用步骤(5)免疫传感器分析检测了大豆转基因Bt提取物CrylAc蛋白，将实验结果与紫外可见分光光度法测量得到的数据进行了比较，并用标准加入法验证了结果的准确度。取100 g新鲜转基因大豆叶(HD-73)，加入50 mL缓冲溶液a( 10 mmol/L Tris-HClpH 7.5,2 mmol/L巯基乙醇和I mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA) pH 8.0)，磨碎；通过乙醚脱月旨，再加入400 mL缓冲液a中，4。C搅拌2小时，10000 rpm冷冻离心15分钟，取上清；力口入质量百分比含量为50%的(NH4)2SO4使蛋白沉淀，静置30分钟，10000 rpm离心10分钟，弃上清，加入20 mL缓冲液a使沉淀溶解,在10倍体积的缓冲液a中4 ° C透析过夜。透析后的液体，10000 rpm离心10分钟，取上清，经过缓冲溶液a平衡过的Sephadex G-25柱分离，用400 mL缓冲溶液a洗脱并部分收集。将收集液在10倍体积的缓冲溶液a中4 ° C透析，过夜；10000 rpm离心10分钟，取上清；将上清液经过缓冲溶液a平衡过的DEAE-Toyopearl柱子进行分离，分别用200mL缓冲溶液a、100 mL缓冲溶液a和100 mL 0.5 mol/L NaCl溶液洗脱，收集高浓度转基因Bt毒蛋白CrylAc部分。电极倒置并用磁铁吸住中心铁棒，首先吸取20 ant1-CrylAc/Fe304@Au纳米粒子悬浮液滴到电极表面，使其分散；为封闭非特异性吸附，将电极浸入质量百分比含量为1%牛血清白蛋白溶液中；接着将修饰电极浸入含有CrylAc蛋白抗原的大豆转基因Bt提取物中孵化30分钟，最后浸入21 ng/mL葡萄糖氧化酶标记ant1-CryIAc溶液中免疫反应30分钟，形成三明治结构免疫复合物；未键合的多余的抗体用0.1 mol/L磷酸盐吐温缓冲溶液清洗干净:然后选用M P1-E型电致化学发光分析系统，采用三电极系统进行测试，并测定ECL的强度，根据/ = 520.81 + 1862.27 C (ng/mL)，计算出大豆转基因Bt提取物CrylAc蛋白抗原的浓度，结果如表I所示:
权利要求
1.一种测定苏云金芽孢杆菌毒蛋白CrylAc的方法，其特征在于具体步骤为: (1)磁控玻碳电极即GCE的制作: 截取内径2.5 6.0 mm的玻璃管，把铁棒两端磨平并清洗干净；将玻碳放入玻璃管一端，然后将铁棒插入玻璃管并紧贴玻碳；铁棒周围用熔融的固体石蜡固定；电极表面在麂皮上分别用粒径1.0,0.3和0.05 Mm的氧化铝粉抛光，清洗后待用； (2)化学共沉淀法合成Fe3O4核: 在N2保护下，在50 ° C、剧烈搅拌条件下，将5 50 mL摩尔浓度为2 mo I/L的NaOH溶液加入I 10 g FeSO4WH2O与0.29 2.9 g FeCl3的混合物中，反应过程中保持pH为10不变，继续加热至80 ° C熟化I小时，用外加磁铁分离得到黑色沉淀物，用二次蒸馏水反复清洗干净至上清液成中性，得Fe3O4 ； (3)核壳型Fe3O4OAu纳米粒子的合成: 将0.29 2.9 g柠檬酸钠溶解在100 mL 二次蒸馏水中，在搅拌下加热到90 ° C，立即加入50 100 mg Fe3O4和2 10 mL摩尔浓度为0.01 mo I/L HAuCl4的混合溶液，继续加热10 20分钟，移去热源继续搅拌15 20分钟，冷却至室温，通过外加磁力分离核壳型磁性纳米粒子，用二次蒸馏水清洗，重新分散在10 30 mL 二次蒸馏水中，得核壳型Fe3O4OAu纳米粒子；(4)Ant1-CrylAc/Fe304iAu 的制备: 将2.0 mL步骤(3)制得的核壳型Fe3O4OAu纳米粒子，搅拌下加入I mL摩尔浓度为10mmol/L的硫脲溶液反应2小时，用磁铁分离后，加入2 mL质量百分比浓度为99%的戊二醛反应I小时，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液彻底清洗干净，加入50 μ 浓度为0.1 mg/mL的ant1-CryIAc溶液,定容至2 mL,4 ° C缓慢搅拌下反应10小时,得到的ant1-CrylAc/Fe3O4OAu纳米粒子溶液置于冰箱中密闭保存； (5)双抗夹心法制作免疫传感器: 将步骤(I)制得的电极倒置并用磁铁吸住中心铁棒，首先吸取10 30 μ 步骤(4)制得的anti_CrylAc/Fe304@Au纳米粒子悬浮液滴到电极表面,使其分散,为封闭非特异性吸附，将电极浸入质量百分比为1%的牛血清白蛋白溶液中，接着将修饰电极浸入6 ng/mL CrylAc蛋白中孵化20 40分钟,最后浸入21 ng/mL葡萄糖氧化酶标记ant1-CryIAc溶液中免疫反应20 40分钟，形成三明治结构免疫复合物，未键合的多余的抗体用0.1mol/L磷酸盐吐温缓冲溶液清洗干净，免疫传感器不用时，置于4 ° C储存； (6)检测方法: 使用MP1-E型电化学发光分析系统，在10 mL包含0.6 mmol/L鲁米诺和I mmol/L葡萄糖的0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲溶液中，Tris-HCl缓冲溶液pH为8.5，进行ECL信号检测，扫描范围:-0.3 ^ 0.6 V (vs.SCE);扫速:100 mV/s ;光电倍增管高压:800 V，采样速率:10 T/S，放大倍数:4，测量时间:90秒，免疫传感器不用时置于4 ° C保存； (7)标准工作曲线的绘制: 将步骤(I)制得的电极倒置并用磁铁吸住中心铁棒，首先吸取10 30 μ 步骤(4)制得的anti_CrylAc/Fe304@Au纳米粒子悬浮液滴到电极表面,使其分散,为封闭非特异性吸附，将电极浸入质量百分比为1%的牛血清白蛋白溶液中，接着将修饰电极浸入不同浓度的CrylAc蛋白中孵化20 40分钟,最后浸入21 ng/mL葡萄糖氧化酶标记ant1-CryIAc溶液中免疫反应20 40分钟，形成三明治结构免疫复合物，未键合的多余的抗体用0.1mol/L磷酸盐吐温缓冲溶液清洗干净；电化学发光强度J在CrylAc浓度C为O 6 ng/mL范围内成线性关系；线性回归方程为/ = 520.81 + 1862.27 C (ng/mL)，线性相关系数r=0. 9991ο
全文摘要
本发明公开了一种测定苏云金芽孢杆菌毒蛋白Cry1Ac的方法。结合转基因Bt毒蛋白Cry1Ac一抗的Fe3O4@Au纳米粒子修饰于磁控玻碳电极表面，然后与抗原、GOD标记二抗特异性免疫反应形成三明治结构复合物。研制出电致化学发光免疫传感器用于检测转基因Bt毒蛋白Cry1Ac的浓度。GOD催化氧化葡萄糖生成H2O2。在工作电极上加电压激发luminol氧化。Luminol氧化物和H2O2反应产生电化学发光信号。电化学发光响应随着GOD浓度的增大而增强。电化学发光信号与转基因Bt毒蛋白Cry1Ac的浓度在0~6ng/mL范围内成线性关系。本发明灵敏度高，检测限低，应用广泛，为可靠、超灵敏地检测转基因植物的毒蛋白提供了广阔的应用前景。
文档编号G01N33/569GK103175962SQ20131008588
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者李建平, 徐倩, 魏小平 申请人:桂林理工大学