专利名称：一种酶法快速定量检测heparosan的方法
技术领域：
本发明涉及一种酶法快速定量检测heparosan的方法。
背景技术：
Heparosan,又称 N-acetylheparosan, (-GlcUA-l, 4-GlcNAc-l, 4-) n,是 E.coli010:Κ5:Η4 (简称Ε.coli Κ5)等菌株荚膜中多糖骨架的二糖重复单位，可作为肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成前体。目前heparoan的检测方法主要有硫酸-咔唑法、干重法，干重法需要将细菌发酵液进行分离、醇沉、烘干、称量等步骤，最后获得的粗多糖中含有较多杂质(蛋白质、其他多糖等)，测量精度差。而硫酸咔唑法是适用范围比较广的一种糖醛酸含量的测定方法，多糖含量的测定也是通过先测定多糖中糖醛酸的含量，再换算成多糖的含量，该方法目前广泛应用于软骨素、透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、黄瓜多糖、果胶多糖等酸性多糖中糖醛酸含量的测定，该测定方法易受试剂或样品中杂质(葡萄糖、盐、铁离子等)的干扰，存在操作繁琐、重现性差、干扰因素多、专一性差等缺点。而选定合适的酶，进行酶法检测具有快速、简便、专一性强和高精密度等优点，目前在实际应用中越来越广。Heparinase III酶(EC4.2.2.8)为黄杆菌(fIavobacteriumheparinum)中提取的细菌肝素酶，能特异性裂解N-硫酸化或N-乙酰化葡萄糖胺(GIcNSO3或GlcNAc)与葡萄糖醛酸之间的糖苷键。目前研究者已证明heparinase III酶能降解硫酸乙酰肝素，但还未有报道将heparinase III酶应用于heparosan或硫酸乙酰肝素含量检测。
发明内容
本发明的目的是为 了提供一种的酶法快速定量检测heparosan的方法，该方法与硫酸咔唑法、干重法相比具有专一性强，精度高、重现性好等优点。本发明采用的技术方案是:一种酶法快速定量检测heparosan的方法，所述方法包括:(I)取待测样品，溶于ρΗ7.(Γ7.5的缓冲液中配制成样品溶液，混匀，25 35°C下平衡0.1 IOmin,加入足量Heparinase III酶，混勻，25 35°C水浴0.1 3h,加入HCl溶液，离心混匀，取上清液进行紫外分光光光度计检测，以未进行酶反应的样品为空白对照，读出样品的吸光度值A235nm ;所述待测样品可以是提取后的heparosan样品，也可以是含有heparosan的粗品或E.coli K5发酵上清液等；(2)配制梯度浓度的h印arosan标准品溶液，按照步骤(I)方法进行反应和检测，绘制吸光度值与底物浓度的标准曲线；(3)对照标准曲线,根据样品吸光度值A235nm,获得样品溶液中heparosan浓度值，换算得到样品中heparosan含量。所述步骤(I)缓冲液组成如下:Tris!1(:110 501111，恥(:140 801111，03(:121 41111，牛血清蛋白0.005 0.02% (w/w)，溶剂为水，ρΗ7.0 7.5。对酶反应体系进行优化，所述方法如下:
(I)取待测样品，溶于缓冲液A中配制成样品浓度f500g/L的样品溶液(样品为提取后的heparosan样品时,样品浓度为l 10g/L为宜,样品为含有heparosan的粗品时，样品浓度可为10(T500g/L，优选为30(T500g/L)，取0.6mL样品溶液，混匀，25 35°C下平衡
0.riOmin,加入 Heparinase III 酶液 0.05mL,混匀，25 35 °C水浴 0.1 3h，加入 50mMHCl溶液2.35mL,离心混匀，取上清液进行紫外分光光光度计检测，以未进行酶反应的样品为空白对照，读出样品的吸光度值A235nm;所述缓冲液A组成如下:Tris HC120mM, NaC150mM,CaCl24mM,牛血清蛋白 0.01%,溶剂为水，pH7.5 ;所述 Heparinase III 酶液由 HeparinaseIII酶溶于缓冲液A制得，酶液单位酶活大于165U/mL;(2)配制梯度浓度的h印arosan标准品溶液，按照步骤(I)方法进行反应和检测，绘制吸光度值与底物浓度的标·准曲线；(3)对照标准曲线，根据样品吸光度值A235nm,获得样品溶液中h印arosan浓度值，换算得到样品中heparosan含量。本发明的有益效果主要体现在:本发明提供了一种酶法快速定量检测heparosan的方法，该方法可适用于提取后的heparosan样品的测定,也可以是含有heparosan的粗品或E.coli K5发酵上清液中heparosan含量的测定,与硫酸咔唑法、干重法相比具有专一'I"生强、精度高、重现性好等优点，而且操作简单方便。
图1为不同酶反应时间下heparosan的解聚效果；泳道1飞分别为酶反应O、15、30、60、90、120min 样品；图2为不同Heparinase III酶量对酶法测定heparosan的影响；图3为反应体系A中Heparinase III酶法检测heparosan的标准曲线。图4为反应体系B中Heparinase III酶法检测heparosan的标准曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:实施例1:Heparinase III酶活的测定肝素裂解酶III特异性裂解葡萄糖醛酸与葡萄糖胺之间的价键，具体如下:
权利要求
1.一种酶法快速定量检测heparosan的方法,所述方法包括: (1)取待测样品，溶于PH7.(Γ7.5的缓冲液中配制成样品溶液，混匀，25 35°C下平衡0.1 IOmin,加入足量Heparinase III酶，混勻，20 35°C水浴0.1 3h,加入HCl溶液，离心混匀，取上清液进行紫外分光光光度计检测，以未进行酶反应的样品为空白对照，读出样品的吸光度值A235nm; (2)配制梯度浓度的heparosan标准品溶液，按照步骤(I)方法进行反应和检测，绘制吸光度值与底物浓度的标准曲线； (3)对照标准曲线,根据样品吸光度值A235nm,获得样品溶液中heparosan浓度值,换算得到样品中heparosan含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)缓冲液组成如下=TrisHCll(T50mM，NaC14(T80mM，CaCl21 4mM，牛血清蛋白 0.005 0.02%，溶剂为水，ρΗ7.0 7.5。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下: (1)取待测样品，溶于缓冲液A中配制成样品浓度f500g/L的样品溶液，取0.6mL样品溶液，混匀，25 35°C下平衡 0.Γ Οπι η, ρΛ Heparinase III 酶液 0.05mL，混匀，25 35°C水浴0.5 3h，加入50mM HCl溶液2.35mL,离心混匀，取上清液进行紫外分光光光度计检测，以未进行酶反应的样品为空白对照，读出样品的吸光度值A235nm ;所述缓冲液A组成如下:TrisHC120mM, NaC150mM, CaCl24mM，牛血清蛋白 0.01%，溶剂为水，ρΗ7.5 ;所述 Heparinase III酶液由!feparinaseIII酶溶于缓冲液A制得，酶液单位酶活大于165U/mL ； (2)配制梯度浓度在0.l"10g/L之间的heparosan标准品溶液,按照步骤(I)方法进行反应和检测，绘制吸光度值与底物浓度的标准曲线； (3)对照标准曲线,根据样品吸光度值A235nm,获得样品溶液中heparosan浓度值,换算得到样品中heparosan含量。
全文摘要
本发明提供了一种酶法快速定量检测heparosan的方法，所述方法包括(1)取待测样品，溶于pH7.0~7.5的缓冲液中配制成样品溶液，混匀，25~35℃下平衡0.1~10min，加入足量Heparinase III酶，混匀，25~35℃水浴0.1~3h，加入HCl溶液，离心混匀，取上清液进行紫外分光光光度计检测，以未进行酶反应的样品为空白对照，读出样品的吸光度值A235nm；(2)配制梯度浓度的heparosan标准品溶液，按照步骤(1)方法进行反应和检测，绘制吸光度值与底物浓度的标准曲线；(3)对照标准曲线，根据样品吸光度值A235nm，获得样品溶液中heparosan浓度值，换算得到样品中heparosan含量。该方法与硫酸咔唑法、干重法相比具有专一性强，精度高、重现性好等优点。
文档编号G01N21/31GK103149198SQ20131005018
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月8日 优先权日2013年2月8日
发明者钟卫鸿, 黄海婵, 赵颖颖, 吕沈聪 申请人:浙江工业大学