一种新型高效的蛋白酶活性检测方法

专利名称：一种新型高效的蛋白酶活性检测方法
技术领域：
本发明涉及功能纳米材料和生物化学领域，具体涉及一种新型高效的蛋白酶活性检测方法，本发明通过蛋白酶对多肽底物的酶切反应，用所得的酶切产物作为表面配体来合成具有荧光效应的纳米材料量子点，然后再根据所合成的量子点的荧光效应的变化，来反映酶切反应后产物的变化，从而来反映蛋白酶活性的变化。
背景技术：
蛋白酶对蛋白质和多肽底物的特异性催化水解反应，对于生物体的正常生命活动发挥着极其重要的作用。检测酶含量及存在，很难直接用酶的量(例如质量、体积、浓度)来表示，而常用酶催化某一特定化学反应的能力来表示酶量，即用酶活性来表示。研究表明，蛋白酶活性的失调能够引起疾病，如癌症，炎症、退化性疾病等，这已经引起了科学家的广泛关注，因此在研究中需要检测蛋白酶的活性，检测蛋白酶的活性在蛋白酶活性相关疾病的医学诊断和工业生产方面都具有十分重要的意义。传统的酶活性检测方法，如免疫荧光吸附方法(简称ELISA)，Tothill的研究表明免疫荧光吸附方法虽然方便，但其灵敏度有限；Lamore S.D.提出虽然质谱和凝胶电泳方法的检测灵敏度高，但是需要昂贵的仪器设备，且不能定量；Lee J.S.等的研究表明荧光共振能量转移方法的灵敏度虽高，但由于底物的局限性，使其不具备普适性。因此，如何设计一种高效的、方便快捷、成本低的新型蛋白酶活性检测方法成为本发明研究的课题。

发明内容
本发明目的是提供一种新型高效的蛋白酶活性检测方法，其目的在于解决目前蛋白酶检测方法灵敏度有限、成本较高以及不具备普遍适用性的问题。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是:一种新型高效的蛋白酶活性检测方法，有两个部分组成，
第一部分:
事先建立所需检测的蛋白酶活性与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系，所述相关关系的建立由下列步骤组成:
第一步，针对所需检测的蛋白酶的种类，设计一段含有该蛋白酶特异性切割位点的多肽底物；
所述蛋白酶的种类是指具有特异性切割位点的胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、胶原酶、基质金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶中的任意一种；
所述多肽底物中包含一段由2 10个氨基酸构成的肽链，所述肽链中含有能够被所述蛋白酶特异性切割的肽键以及两个带有巯基基团的半胱氨酸，其中，肽链的两端分别是一个带有巯基基团的半胱氨酸；
第二步，在第一步的基础上，在所需检测的蛋白酶的最适温度以及最适PH值条件下，向多组相同量的多肽底物中各投入已知浓度的蛋白酶，各组已知浓度的蛋白酶之间具有浓度梯度，然后进行酶切反应，得到各组酶切产物，其中，多组已知浓度的蛋白酶中的最高浓度为所述多肽底物摩尔浓度的0.59Γ10 %，设定的每一组酶切反应的时间相同并且小于或等于最高浓度的蛋白酶100%酶切多肽底物的时间；投入的所述多肽底物中含有的巯基基团的摩尔浓度在0.5 10mmol/L之间； 第三步，向所述各组酶切产物中投入相同量的用于合成量子点的具有金属离子和非金属离子的前驱体，并在25 100°C下反应0.5^1小时，各组反应结束后生成量子点，其中，投入的所述前驱体中金属离子的摩尔浓度为所述多肽底物中含有的巯基基团的摩尔浓度的85 120%，非金属离子的摩尔浓度为金属离子摩尔浓度的20 9Γ100 % ；
所述金属离子的前驱体选自镉化合物、铅化合物、银化合物、锌化合物、铟化合物、汞化合物、铜化合物、锰化合物中的任意一种或任意两种，所述非金属离子的前驱体选自含硫化合物、含硒化合物、含碲化合物、含磷化合物、含砷化合物中的任意一种或任意两种；但任意两种金属离子的前驱体与任意两种非金属离子的前驱体不同时应用于一个合成量子点的反应;
所述量子点是二元量子点，具体为締化镉、硒化镉、硫化镉、硫化铅、硒化铅、硫化银、硒化银、硫化锌、硒化锌、碲化锌、磷化镉、砷化镉、磷化铟、砷化铟中的任意一种，或者所述量子点是三元量子点，具体为镉汞碲、镉汞硒、镉汞硫、锌汞碲、锌汞硒、锌汞硫、锌镉碲、锌镉硒、锌镉硫，锌締硒，锌締硫、锌硒硫、镉締硒、镉締硫、镉硒硫、锌铜硒、锌猛硒、铜铟硫、铜铟硒中的任意一种；
第四步，对第三步中各组生成的量子点进行荧光光谱测定，得到所述量子点的荧光光谱波峰强度，再根据所需检测的多组蛋白酶的已知浓度，最终得到蛋白浓度与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系，即蛋白酶活性与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系；
第二部分:
针对胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、胶原酶、基质金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶中的任意一种，蛋白酶活性检测方法由以下步骤组成:
第一步，设计多肽底物
针对被检测的蛋白酶种类，设计一段与所述第一部分的第一步中相同的多肽底物； 第二步，进行酶切反应
设计好多肽底物后，在被检测的蛋白酶的最适温度以及最适PH值条件下，向多肽底物中投入未知浓度的被检测蛋白酶，然后进行酶切反应，得到酶切产物；其中，酶切反应的时间与所述第一部分的第二步中酶切反应时间相同，所述多肽底物的量与所述第一部分的第二步中多肽底物的量相同；
第三步，合成量子点
向第二步中的酶切产物中投入用于合成量子点的所述第一部分的第三步中的前驱体，并在与所述第一部分的第三步中相同的温度以及时间条件下反应，结束后生成量子点，其中，投入的所述前驱体中金属离子和非金属离子的量与所述第一部分的第三步中前驱体中金属离子和非金属离子的量相同；第四步，获得被检测的未知浓度的蛋白酶的活性
对第三步中生成的量子点进行荧光光谱测定，得到该量子点的荧光光谱波峰强度，再将该荧光光谱波峰强度与所述第一部分中得到的相关关系进行比对，最终获得被检测的未知浓度的蛋白酶活性。上述技术方案中的有关内容解释如下:
1、上述方案中，多组已知浓度的蛋白酶中的最高浓度为所述多肽底物摩尔浓度的
0.59Γ10 %，酶切反应的时间小于或等于所述第一部分的第二步中最高浓度的蛋白酶100%酶切多肽底物的时间，也就是说当已知不同浓度的蛋白酶与相同量的多肽底物进行酶切反应时，若最高浓度的蛋白酶还没有与多肽底物反应完，那么其他低浓度的蛋白酶就一定没有与多肽底物完全反应，则由已知不同浓度的蛋白酶与相同量的多肽底物进行酶切反应生成的酶切产物的量不同，进而用酶切产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度也不同。2、上述方案中，所述最适温度是指酶促催化反应速度随温度升高而达到一最大值时的温度，最适PH是指酶催化活性最高时溶液的pH值，pH过高或过低均可导致酶催化活性的下降。每一种蛋白酶都有各自的最适温度以及最适pH，本领域普通技术人员能够容易得到每一种蛋白酶的最适温度以及最适pH。3、上述方案中，在所述第一部分的第二步与所述第二部分的第二步中，所述pH值采用PH缓冲溶液来调节，pH缓冲溶液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(又称Tris-HCl缓冲溶液)、碳酸氢氨缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液(又称PBS缓冲溶液)中的任意一种；上述pH缓冲溶液中还可以含有体积分数为0.Γ %的血清，即指上述pH缓冲溶液中血清的体积占溶液总体积的0.f 1% 。本发明设计原理是:量子点(英文名称quantum dots, QDs)是一种尺度小于或者近似激子波尔粒径的半导体纳米晶体，具有独特的光学性质，比如激发谱宽而连续分布，发射波长可通过粒径大小和组成成分进行调节，荧光量子产率高，寿命长，因而在荧光标记成像，发光器件，光电材料等领域有着广泛的应用前景。采用含巯基的氨基酸或多肽制备量子点的方法也已十分成熟，如Wing-Cheung Law采用半胱氨酸(英文名称L-cysteine)合成CdTe量子点，Ying-Fan Liu采用谷胱甘肽(英文名称GSH)合成CdTe量子点。Kimihiro Susum研究发现量子点的稳定性与其表面的巯基化合物配体的性质紧密相关。使用含双巯基的化合物配体相比于含单巯基的化合物配体，对量子点进行表面配体交换后，量子点表现出更强的稳定性，即双巯基配体与单巯基配体对量子点有着不同的影响。所以，可以推测，使用双巯基和单巯基的配体来合成的量子点，会具有不同的荧光效应。反之，通过合成的量子点的荧光效应的变化，便可推测其合成配体化合物中含有的巯基的数目的变化。假设配体化合物为含有特定酶切位点的多肽，且该酶切位点两边各含一个巯基，那么随着酶浓度的升高，进行酶切反应后，获得的产物中含双巯基的多肽数量逐渐减少，含单巯基的多肽数量逐渐增多，合成的量子点的荧光也随之发生变化，从而可以通过量子点的荧光变化反推酶浓度的变化，即对酶活性进行有效检测。本发明在已有的技术基础上，提出了一种新型高效的蛋白酶活性检测方法，通过设计含有所需检测的酶的特异性酶切位点的底物，在与不同浓度的蛋白酶作用后，所得到的不同产物作为表面配体来合成具有不同荧光效应的纳米材料量子点，即通过所合成的量子点的荧光效应的变化，来反映作为配体的酶切产物的变化，从而最终来反映蛋白酶活性的变化。在本发明的新型高效的蛋白酶活性检测方法中，虽然也利用量子点的荧光效应的变化来反映蛋白酶活性的变化，但完全不同于采用量子点进行的荧光共振能量转移方法。本发明中的蛋白酶活性检测方法的核心在于用相同含量的多肽底物与不同含量的蛋白酶进行酶切反应后的不同酶切产物来合成具有不同荧光效应的量子点，从而来反推蛋白酶的活性；而荧光共振能量转移的方法在于连接有特定多肽底物的特定量子点在与不同含量的酶作用后，量子点的荧光效应发生变化，从而来推断酶的活性。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点和效果是:由于酶切底物的特异性、量子点荧光与表面配体化合物的紧密相关性以及合成量子点的经济和便捷性，使本发明的蛋白酶活性检测方法相较于传统的蛋白酶活性检测方法，如免疫荧光吸附方法、质谱、凝胶电泳以及荧光共振能量转移等方法具有更高的经济实用性、更高的灵敏度以及更高的便捷性等特点。并且本发明的蛋白酶活性检测方法具有普遍应用性，即只需根据所需检测的蛋白酶的种类，相应改变多肽底物中的酶切位点，无需改变多肽底物中含巯基的氨基酸及其他部分，也无需改变量子点的合成过程，便可实现对不同种类的蛋白酶的活性的检测。也就是说，本发明提供的蛋白酶活性检测方法方便快捷、灵敏度高、成本低，并且具有普遍适用性。



附图1为本发明一种新型高效的蛋白酶活性检测方法流程 附图2为本发明实施例一的荧光比较 附图3为本发明实施例一的第一质谱 附图4为本发明实施例一的第二质谱 附图5为本发明实施例一的量子点的荧光光谱图
附图6为本发明实施例一的量子点的荧光光谱波峰强度与蛋白酶活性的相关标准曲
线.-^4 ，
附图7为本发明实施例一的量子点的紫外吸收图谱；
附图8为本发明实施例一的量子点的第一电镜图谱；
附图9为本发明实施例一的量子点的第二电镜图谱；
附图10为本发明实施例二的量子点的荧光光谱波峰强度与蛋白酶活性的相关标准曲
线.附图11为本发明实施例三的量子点的荧光光谱波峰强度与蛋白酶活性的相关标准曲
线.附图12为本发明实施例四的量子点的荧光光谱波峰强度与蛋白酶活性的相关标准曲线。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
实施例一:一种新型高效的蛋白酶活性检测方法
蛋白酶活性检测方法流程可参见图1所示。本实施例为胰蛋白酶(英文名称:trypSin)活性检测方法。第一部分:
事先建立胰蛋白酶活性与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系，所述相关关系的建立由下列步骤组成:
第一步，针对胰蛋白酶，设计一段含有该蛋白酶特异性切割位点的多肽底物，所述多肽底物中包含一段由4个氨基酸构成的肽链，所述肽链中含有能够被胰蛋白酶特异性切割的肽键以及两个带有巯基基团的半胱氨酸(符号:C)，其特异性酶切位点是氨基端(化学式:NH2-)为赖氨酸(符号:K)，羧基端(化学式:C00H_)为甘氨酸(符号:G)的之间的肽键，肽链的两端分别是一个带有巯基基团的半胱氨酸，肽链的两端还各连接有一个甘氨酸，即该多肽底物为NH2-GCKGCG-C00H，其被胰蛋白酶酶切后的产物为NH2-GCk-COOH和nh2-gcg-cooh。第二步，在第一步的基础上，在胰蛋白酶的最适温度以及最适pH条件下，向多组相同量的多肽底物中各投入已知浓度的蛋白酶，然后进行酶切反应，得到各组酶切产物，其中，胰蛋白酶的最适温度为人体的生理温度37°C，最适pH值为疒9。所投入的多肽底物中的巯基含量为1.15 mmol/L，胰蛋白酶的梯度浓度设定为O μ mol/L、0.2 μ mol/L、I μ mol/L>2 μ mol/L L、5 μ mol/L、10 μ mol/L、20 μ mol/L、40 μ mol/L，在 pH = 8.2 并且含体积分数
0.1 %血清的碳酸氢铵缓冲液中，37 °C水浴条件下，反应2小时。设定的每一组酶切反应的时间相同并且小于最高浓度的胰蛋白酶100%酶切多肽底物的时间。第三步，向所述各组酶切产物中投入1.15 mmol/L的氯化镉(化学式=CdCl2)前体和0.30 mmol/L的碲氢化钠(化学式:NaHTe)前体，100 °C下反应I小时以合成CdTe量子点。第四步，对第三步中各组生成的CdTe量子点进行荧光光谱测定，得到所述量子点的荧光光谱波峰强度，再由多组胰蛋白酶的已知浓度，绘制标准曲线。梯度浓度的胰蛋白酶水解多肽底物的产物合成的CdTe量子点的荧光光谱波峰强度与胰蛋白酶梯度浓度的相关标准曲线,参见图6所示。第二部分:
针对胰蛋白酶，所述胰蛋白酶活性检测方法由以下步骤组成:
第一步，设计多肽底物
设计一段与所述第一部分的第一步中相同的多肽底物。第二步，进行酶切反应
设计好多肽底物后，在所述第一部分的第二步中的反应条件下，向多肽底物中投入未知浓度的胰蛋白酶，然后进行酶切反应，得到酶切产物。其中，酶切反应的温度、PH条件、酶切反应的时间以及多肽底物的量均与所述第一部分的第二步中相同。第三步，合成量子点
向第二步中的酶切产物中投入用于合成量子点的所述第一部分的第三步中的前驱体，并在与所述第一部分的第三步中相同的温度以及时间条件下反应，结束后生成CdTe量子点，其中，投入的所述前驱体中金属离子和非金属离子的量与所述第一部分的第三步中前驱体中金属离子和非金属离子的量相同。第四步，获得被检测的未知浓度的胰蛋白酶的活性
对第三步中的CdTe量子点进行荧光光谱测定，得到量子点的荧光光谱波峰强度，再将该荧光光谱波峰强度与所述第一部分中得到的相关标准曲线进行比对，最终获得被检测的未知浓度的胰蛋白酶的活性。
图2表示多肽底物与梯度浓度中的最高浓度胰蛋白酶酶切反应后的产物合成的CdTe量子点以及只有多肽底物合成的CdTe量子点在紫外灯下的荧光比较照片。做法是在365 nm的普通紫外灯的照射下，用普通相机直接拍照。其中，图2中右边的EP管代表的是梯度浓度中最高浓度的胰蛋白酶切割多肽底物后生成的量子点，其荧光最强；左边的EP管代表的是多肽底物完全没有被胰蛋白酶切割(或胰蛋白酶浓度为O)时候，直接合成量子点是没有荧光的。这个图片直观地表示了需要做的标准曲线的最高点和最低点。图3和图4表示梯度浓度的胰蛋白酶对多肽底物酶切后产物的质谱图，做法是将200 μ L的胰蛋白酶对多肽底物剪切前后的产物在1200LC-6410B/QQQ/MS液相质谱仪(生产厂家:美国Agilent公司)上测试的，每个样品的分析时间是15分钟。其中，荷质比524为NH2-GCKGCG_C00H，荷质比307为NH2-GCK_C00H。图3中分子量524为酶切之前的多肽底物NH2-GCKGCG-C00H，图4中分子量307为多肽底物NH2-GCKGCG-C00H被酶切割后的产物，这说明胰蛋白酶与多肽底物作用后，确实是可以对多肽底物进行切割的，因此通过这样的切割，得到的不同酶切产物，才能合成荧光强弱不同的量子点。图5表示不同梯度浓度的胰蛋白酶水解多肽底物的产物合成的CdTe量子点的荧光光谱图，做法是以365 nm的紫外光作为激发光源，采用AvaSpeC-ULS2048-USB2光纤光谱仪(生产厂家:荷兰Avantes公司)进行测试的一个结果。其中，横轴表示波长，单位为纳米(nm)，纵轴表示相对荧光光谱的波峰强度。从图5可以看出，不同浓度的胰蛋白酶切割多肽底物后，合成的量子点的荧光光谱的变化，从下到上，随着胰蛋白酶浓度的升高，得到的量子点的荧光光谱的波峰强度也是逐渐增强，为建立酶浓度-量子点荧光强度标准曲线提供依据。在以上验证实验的基础上，得到了不同梯度浓度的胰蛋白酶水解多肽底物的产物合成的CdTe量子点的荧光光谱波峰强度与胰蛋白酶梯度浓度的相关标准曲线，参见图6所示，对图5中的荧光光谱进行的一个转化，横轴是胰蛋白酶浓度，单位为ymol/L，纵轴是对应的CdTe量子点的荧光光谱的波峰强度数值与背景的比值(背景即为酶浓度为O时的荧光光谱的波峰强度)。图7表示多肽底物与梯度浓度中的最高浓度胰蛋白酶酶切反应后的产物合成的CdTe量子点、只有多肽底物合成的CdTe量子点以及只有梯度浓度中的最高浓度胰蛋白酶合成的量子点的紫外吸收图谱，横轴表示波长，单位为纳米(nm)，纵轴表示吸光度。做法是在CARY50紫外可见分光光度计(生产厂家:美国Varian公司)上测量的；图7的紫外吸收光谱能反应其中量子点的粒径大小和浓度，图中越往右边(即横轴越大)，则量子点的粒径越大；越往上边(即纵轴越大)，则量子点的浓度越大。从这个图片可以看出，只有多肽底物时(即酶浓度为O时)合成的量子点，标记为Peptide+CdTe，在横轴右边(SP350^600 nm)处，纵轴数值(即吸光度值)很低，即表明其中的量子点的粒径偏小，或者说其中的大粒径的量子点偏少；相反在加入最高浓度的胰蛋白酶之后，合成的量子点，标记为P印etide+Trypsin+CdTe，其在350 600 nm处，吸光度明显变高，即表明其中的量子点粒径偏大，或者说其中的大粒径的量子点偏多。而最重要的是大粒径的量子点才会发出荧光，小粒径的量子点不会发出荧光，因此图7从一个侧面为本发明的检测方法提供了理论依据。当不加胰蛋白酶，也不加合成量子点的前体，其在相同区域，吸光度基本为O，即基本没有吸收；当仅有最高浓度的胰蛋白酶，不加多肽底物，也不加合成量子点的前体，其在相同区域，吸光度基本也为O，即基本没有吸收。这两个作为对照，证明上面的在35(T600 nm区域吸光度的变化不是因为多肽底物而改变的，也不是因为胰蛋白酶而改变，因此也就可以推断只有合成的不同的量子点才是变化的原因。图8表示多肽底物与梯度浓度中最高浓度的胰蛋白酶酶切反应后的产物合成的CdTe量子点的电镜图谱，图9表示只有多肽底物合成的CdTe量子点的电镜图谱。做法是在200KV的JEM-2100透射电子显微镜(生产厂家:日本JEOL公司)下拍摄，得到电镜图谱。图8和图9更加直观的说明了图片7的内容。图8是多肽底物加了梯度浓度中最高浓度的胰蛋白酶之后合成的量子点，颗粒粒径明显比图9中的大(两幅图片中左上角的是高分辨的图，更加直观反映这个粒径变化)，从而跟图7相互印证，说明加入最高浓度的胰蛋白酶与浓度为O的胰蛋白酶，合成的量子点粒径有明显变化，从而为荧光变化提供依据，也为建立标准曲线提供依据。图7、图8以及图9从一个侧面还反应了:随着酶浓度的提升，切割多肽底物后，量子点的荧光逐渐增强，其根本原因在于所合成的量子点的平均粒径在逐步增大，或者说大粒径的量子点所占比例在逐渐升高。实施例二:一种新型高效的蛋白酶活性检测方法
蛋白酶活性检测方法流程可参见图1所示。本实施例为胶原酶(英文名称:collagenase)活性检测方法。第一部分:
事先建立胶原酶活性与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系，所述相关关系的建立由下列步骤组成:
第一步，针对胶原酶，设计一段含有该蛋白酶特异性切割位点的多肽底物，所述多肽底物中包含一段由4个氨基酸构成的肽链，所述肽链中含有能够被胶原酶特异性切割的肽键以及两个带有巯基基团的半胱氨酸(符号:C)，其特异性酶切位点是脯氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸(符号=P-C-G-P)中半胱氨酸(符号:C)之后的肽键，肽链的两端分别是一个带有巯基基团的半胱氨酸，肽链的一端还连接有一个脯氨酸，该多肽底物为nh2-pcgpc-cooh，其被胶原酶酶切后的产物为NH2-PC-COOH和NH2-GPC-C00H。第二步，在第一步的基础上，在胶原酶的最适温度以及最适pH条件下，向多组相同量的多肽底物中各投入已知浓度的胶原酶，然后进行酶切反应，得到各组酶切产物，其中，胶原酶的最适温度为人体的生理温度37°C，最适pH为7.4。所投入的多肽底物中的巯基含量为0.5mmol/L,胶原酶的梯度浓度设定为O μ mol/L、0.01 μ mol/L、0.2 μ mol/L、I μ mol/L、2 μ mol/L、5 μ mol/L、10 μ mol/L、25 μ mol/L,在 pH =7.4 的憐酸盐缓冲溶液中，37°C水浴条件下，反应2小时。设定的每一组酶切反应的时间相同并且小于最高浓度的胶原酶100%酶切多肽底物的时间。第三步，向所述各组酶切产物中投入0.6 mmol/L的硝酸银(化学式=AgNO3)前体和0.3 mmol/L的硫化钠(化学式=Na2S)前体，100 °C下反应0.5小时以合成Ag2S量子点。第四步，对第三步中各组生成的Ag2S量子点进行荧光光谱测定，得到所述量子点的荧光光谱波峰强度，再由多组胶原酶的已知浓度梯度，绘制标准曲线。梯度浓度的胶原酶水解多肽底物的产物合成的Ag2S量子点的荧光光谱波峰强度与胶原酶梯度浓度的相关标准曲线，参见图10所示，是对荧光光谱进行的转化，其中，横轴是胶原酶浓度，单位为μ mol/L,纵轴是对应的Ag2S量子点的荧光光谱的波峰强度数值与背景的比值(背景即为酶浓度为O时的荧光光谱)。第二部分:
针对胶原酶，所述胶原酶活性检测方法由以下步骤组成:
第一步，设计多肽底物
设计一段与所述第一部分的第一步中相同的多肽底物。第二步，进行酶切反应
设计好多肽底物后，在所述第一部分的第二步中的反应条件下，向多肽底物中投入未知浓度的胶原酶，然后进行酶切反应，得到酶切产物。其中，酶切反应的温度、PH条件、酶切反应的时间以及多肽底物的量均与所述第一部分的第二步中相同。第三步，合成量子点
向第二步中的酶切产物中投入用于合成量子点的所述第一部分的第三步中的前驱体，并在与所述第一部分的第三步中相同的温度以及时间条件下反应，结束后生成Ag2S量子点，其中，投入的所述前驱体中金属离子和非金属离子的量与所述第一部分的第三步中前驱体中金属离子和非金属离子的量相同。第四步，获得被检测的未知浓度的胶原酶的活性
对第三步中的Ag2S量子点进行荧光光谱测定，得到量子点的荧光光谱波峰强度，再将该荧光光谱波峰强度与所述第一部分中得到的相关标准曲线进行比对，最终获得被检测的未知浓度的胶原酶的活性。实施例三:一种新型高效的蛋白酶活性检测方法 本实施例为凝血酶(英文名称:thrombin)活性检测方法。第一部分:
事先建立凝血酶活性与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系，所述相关关系的建立由下列步骤组成:
第一步，针对凝血酶，设计一段含有该蛋白酶特异性切割位点的多肽底物，所述多肽底物中包含一段由4个氨基酸构成的肽链，所述肽链中含有能够被凝血酶特异性切割的肽键以及两个带有巯基基团的半胱氨酸(符号:C)，其特异性酶切位点是氨基端(NH2-)为精氨酸(R)，羧基端(C00H-)为甘氨酸(G)的之间的肽键，肽链的两端分别是一个带有巯基基团的半胱氨酸，该多肽底物为NH2-CRGC-C00H，其被凝血酶酶切后的产物为NH2-CR-COOH和NH2-GC-COOH。第二步，在第一步的基础上，在凝血酶的最适温度以及最适pH条件下，向多组相同量的多肽底物中各投入已知浓度的凝血酶，然后进行酶切反应，得到各组酶切产物，其中，凝血酶的最适温度为人体的生理温度37°C，最适pH为疒9。所投入的多肽底物中的巯基含量为10 mmol/L,凝血酶的梯度浓度设定为O μ mol/L、0.01 μ mol/L、0.02 μ mol/L、0.05 μ mol/L、I μ mol/L、5 μ mol/L、20 μ mol/L、50 μ mol/L,在 pH =8.3 的含体积分数 0.5 %血清的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(又称Tris-HCl缓冲溶液)中，37 °C水浴条件下，反应2小时。设定的每一组酶切反应的时间相同并且小于最高浓度的凝血酶100%酶切多肽底物的时间。
第三步，向所述各组酶切产物中投入等体积的10 mmol/L的醋酸锌(化学式:Zn (CH3COO)2)前体、I mmol/L氯化镉(CdCl2)前体以及6 mmol/L的硒氢化钠(NaHSe)前体，100 °C下反应I小时以合成ZnCdSe量子点。第四步，对第三步中各组生成的ZnCdSe量子点进行荧光光谱测定，得到所述量子点的荧光光谱波峰强度，再由多组凝血酶的已知浓度梯度，绘制标准曲线。梯度浓度的凝血酶水解多肽底物的产物合成的ZnCdSe量子点的荧光光谱波峰强度与凝血酶梯度浓度的相关标准曲线，参见图11所示，是对荧光光谱进行的转化，其中，横轴是凝血酶浓度，单位为ymol/L，纵轴是对应的ZnCdSe量子点的荧光光谱的波峰强度数值与背景的比值(背景即为酶浓度为O时的荧光光谱)。第二部分:
针对凝血酶，所述凝血酶活性检测方法由以下步骤组成:
第一步，设计多肽底物
设计一段与所述第一部分的第一步中相同的多肽底物。第二步，进行酶切反应
设计好多肽底物后，在所述第一部分的第二步中的反应条件下，向多肽底物中投入未知浓度的凝血酶，然后进行酶切反应，得到酶切产物。其中，酶切反应的温度、pH条件、酶切反应的时间以及多肽底物的量均与所述第一部分的第二步中相同。第三步，合成量子点
向第二步中的酶切产物中投入用于合成量子点的所述第一部分的第三步中的前驱体，并在与所述第一部分的第三步中相同的温度以及时间条件下反应，结束后生成ZnCdSe量子点，其中，投入的所述前驱体中金属离子和非金属离子的量与所述第一部分的第三步中前驱体中金属离子和非金属离子的量相同。第四步，获得被检测的未知浓度的凝血酶的活性
对第三步中的ZnCdSe量子点进行荧光光谱测定，得到量子点的荧光光谱波峰强度，再将该荧光光谱波峰强度与所述第一部分中得到的相关标准曲线进行比对，最终获得被检测的未知浓度的凝血酶的活性。实施例四:一种新型高效的蛋白酶活性检测方法
本实施例为Caspase-3 (半胱氨酸蛋白酶中的一种)活性检测方法。第一部分:
事先首先建立Caspase-3活性与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系，所述相关关系的建立由下列步骤组成:
第一步，针对Caspase-3，设计一段含有该蛋白酶特异性切割位点的多肽底物，所述多肽底物中包含一段由4个氨基酸构成的肽链，所述肽链中含有能够被Caspase-3酶特异性切割的肽键以及两个带有巯基基团的半胱氨酸(符号:C)，其特异性酶切位点是天冬氨酸之后的肽键，肽链的两端分别是一个带有巯基基团的半胱氨酸，肽链的两端还各连接有一个甘氨酸，该多肽底物为NH2-GCAGCG-C00H，其被Caspase-3酶切后的产物为NH2-GCA-C00H和
nh2-gcg-cooh。第二步,在第一步的基础上,在Caspase-3的最适温度以及最适pH条件下，向多组相同量的多肽底物中各投入已知浓度的Caspase-3，然后进行酶切反应，得到各组酶切产物，其中，Caspase-3的最适温度为25°C,最适pH为7.4。所投入的多肽底物中的巯基含量为 5 mmol/T,, Caspase-3 的梯度浓度设定为 O μ mol/L、0.01 μ mol/L、0.05 μ mol/L、0.2 μ mol/L、l μ mol/L、5 μ mol/L、20 μ mol/L、100 μ mol/L,在 pH =7.4 的含体积分数 I % 血清的碳酸氢铵缓冲溶液中，25°C水浴条件下，反应2小时。设定的每一组酶切反应的时间相同并且小于最高浓度的Caspase-3完全酶切多肽底物的时间。第三步，向所述各组酶切产物中投入0.6 mmol/L的氯化镉(化学式=CdCl2)前体、等体积的0.20 mmol/L的碲氢化钠(化学式:NaHTe)以及0.20 mmol/L的硒氢化钠(化学式:NaHSe)前体，100 °C下反应I小时以合成CdTeSe量子点。第四步，对第三步中各组生成的CdTeSe量子点进行荧光光谱测定，得到所述量子点的荧光光谱波峰强度，再由多组Caspase-3的已知浓度梯度，绘制标准曲线。梯度浓度的Caspase-3水解多肽底物的产物合成的CdTeSe量子点的荧光光谱波峰强度与Caspase-3梯度浓度的相关标准曲线，参见图12所示，是对荧光光谱进行的转化，其中，横轴是Caspase-3浓度，单位为μ mol/L,纵轴是对应的CdTeSe量子点的荧光光谱的波峰强度数值与背景的比值(背景即为酶浓度为O时的荧光光谱)。第二部分:
针对Caspase-3,所述Caspase-3活性检测方法由以下步骤组成:
第一步，设计多肽底物
设计一段与所述第一部分的第一步中相同的多肽底物。第二步，进行酶切反应
设计好多肽底物后，在所述第一部分的第二步中的反应条件下，向多肽底物中投入未知浓度的Caspase-3，然后进行酶切反应，得到酶切产物。其中，酶切反应的温度、pH条件、酶切反应的时间以及多肽底物的量均与所述第一部分的第二步中相同。第三步，合成量子点
向第二步中的酶切产物中投入用于合成量子点的所述第一部分的第三步中的前驱体，并在与所述第一部分的第三步中相同的温度以及时间条件下反应，结束后生成CdTeSe量子点，其中，投入的所述前驱体中金属离子和非金属离子的量与所述第一部分的第三步中前驱体中金属离子和非金属离子的量相同。第四步，获得被检测的未知浓度的Caspase-3的活性
对第三步中的CdTeSe量子点进行荧光光谱测定，得到量子点的荧光光谱波峰强度，再将该荧光光谱波峰强度与所述第一部分中得到的相关标准曲线进行比对，最终获得被检测的未知浓度的Caspase-3的活性。上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，能够适用于本发明所述检测方法的蛋白酶均在本发明要求的保护范围内，也就是说本领域技术人员在上述实施例的启发下，容易理解其他具有特异性切割位点的蛋白酶，例如蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、基质金属蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶的活性也能够用本发明的检测方法进行检测。上述实施例的目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种新型高效的蛋白酶活性检测方法，其特征在于: 第一部分: 事先建立所需检测的蛋白酶活性与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系，所述相关关系的建立由下列步骤组成: 第一步，针对所需检测的蛋白酶的种类，设计一段含有该蛋白酶特异性切割位点的多肽底物； 所述蛋白酶的种类是指具有特异性切割位点的胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、胶原酶、基质金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶中的任意一种； 所述多肽底物中包含一段由2 10个氨基酸构成的肽链，所述肽链中含有能够被所述蛋白酶特异性切割的肽键以及两个带有巯基基团的半胱氨酸，其中，肽链的两端分别是一个带有巯基基团的半胱氨酸； 第二步，在第一步的基础上，在所需检测的蛋白酶的最适温度以及最适PH值条件下，向多组相同量的多肽底物中各投入已知浓度的蛋白酶，各组已知浓度的蛋白酶之间具有浓度梯度，然后进行酶切反应，得到各组酶切产物，其中，多组已知浓度的蛋白酶中的最高浓度为所述多肽底物摩尔浓度的0.59Γ10 %，设定的每一组酶切反应的时间相同并且小于或等于最高浓度的蛋白酶100%酶切多肽底物的时间；投入的所述多肽底物中含有的巯基基团的摩尔浓度在0.5 10mmol/L之间； 第三步，向所述各组酶切产物中投入相同量的用于合成量子点的具有金属离子和非金属离子的前驱体，并在25 100°C下反应0.5^1小时，各组反应结束后生成量子点，其中，投入的所述前驱体中金属离子的摩尔浓度为所述多肽底物中含有的巯基基团的摩尔浓度的85 120%，非金属离子的摩尔浓度为金属离子摩尔浓度的20 9Γ100 % ； 所述金属离子的前驱体选自镉化合物、铅化合物、银化合物、锌化合物、铟化合物、汞化合物、铜化合物、锰化合物中的任意一种或任意两种，所述非金属离子的前驱体选自含硫化合物、含硒化合物、含碲化合物、含磷化合物、含砷化合物中的任意一种或任意两种；但任意两种金属离子的前驱体与任意两种非金属离子的前驱体不同时应用于一个合成量子点的反应; 所述量子点是二元量子点，具体为締化镉、硒化镉、硫化镉、硫化铅、硒化铅、硫化银、硒化银、硫化锌、硒化锌、碲化锌、磷化镉、砷化镉、磷化铟、砷化铟中的任意一种，或者所述量子点是三元量子点，具体为镉汞碲、镉汞硒、镉汞硫、锌汞碲、锌汞硒、锌汞硫、锌镉碲、锌镉硒、锌镉硫，锌締硒，锌締硫、锌硒硫、镉締硒、镉締硫、镉硒硫、锌铜硒、锌猛硒、铜铟硫、铜铟硒中的任意一种； 第四步，对第三步中各组生成的量子点进行荧光光谱测定，得到所述量子点的荧光光谱波峰强度，再根据所需检测的多组蛋白酶的已知浓度，最终得到蛋白浓度与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系，即蛋白酶活性与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系； 第二部分: 针对胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、胶原酶、基质金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶中的任意一种，蛋白酶活性检测方法由以下步骤组成: 第一步，设计多肽底物 针对被检测的蛋白酶种类，设计一段与所述第一部分的第一步中相同的多肽底物； 第二步，进行酶切反应 设计好多肽底物后，在被检测的蛋白酶的最适温度以及最适PH值条件下，向多肽底物中投入未知浓度的被检测蛋白酶，然后进行酶切反应，得到酶切产物；其中，酶切反应的时间与所述第一部分的第二步中酶切反应时间相同，所述多肽底物的量与所述第一部分的第二步中多肽底物的量相同； 第三步，合成量子点 向第二步中的酶切产物中投入用于合成量子点的所述第一部分的第三步中的前驱体，并在与所述第一部分的第三步中相同的温度以及时间条件下反应，结束后生成量子点，其中，投入的所述前驱体中金属离子和非金属离子的量与所述第一部分的第三步中前驱体中金属离子和非金属离子的量相同； 第四步，获得被检测的未知浓度的蛋白酶的活性 对第三步中生成的量子点进行荧光光谱测定，得到该量子点的荧光光谱波峰强度，再将该荧光光谱波峰强度与所述第一部分中得到的相关关系进行比对，最终获得被检测的未知浓度的蛋白酶活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:在所述第一部分的第二步与所述第二部分的第二步中，所述PH值采用pH缓冲溶液来调节。
3.根据权利要求2 所述的方法，其特征在于:所述pH缓冲溶液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、碳酸氢氨缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述pH缓冲溶液中含有体积分数为ο.Γι%的血清。
全文摘要
一种新型高效的蛋白酶活性检测方法，其特征在于事先建立所需检测的蛋白酶活性与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系；再根据所需检测的蛋白酶的种类，设计一段含有该蛋白酶特异性切割位点的多肽底物；根据蛋白酶的最适温度和最适pH，投入未知浓度的蛋白酶含量，对相同量的多肽底物进行酶切反应；向多肽底物的酶切产物中投入相同量的合成量子点的前驱体，并在适宜温度下反应以生成量子点；反应结束后，测定合成的量子点的荧光光谱，然后将未知浓度的蛋白酶的酶切产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度与所述相关关系进行比对，即可获得该未知浓度的蛋白酶活性。本发明的方法方便快捷、灵敏度高、成本低，具有普遍适用性。
文档编号G01N21/64GK103149185SQ20131004556
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者马楠, 何学文 申请人:苏州大学