检测类戴奥辛化合物的方法及系统的利记博彩app

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【专利摘要】本发明公开了一种方法或一种无细胞系统，其可检测试验样本中的类戴奥辛化合物，其使用一衍生自经转染的细胞的全细胞溶解物，该转染细胞可表达一融合蛋白，包含一融合至一报导子胜肽的芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AHR)。提供此方法结合生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer，BRET)技术藉此增进灵敏度。
【专利说明】检测类戴奥辛化合物的方法及系统

【技术领域】
[0001]本发明关于一种检测类戴奥辛化合物的方法及系统。

【背景技术】
[0002]戴奥辛常由于不完全的燃烧过程所形成，且被归类于一群顽强且多具备毒性的化学物质，亦被称为持久性有机污染物。在它们之中，2，3，7，8-四氯双苯-P-戴奥辛(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-d1xin, T(DD)被认为是最具有毒性的一种,且被世界卫生组织(World Health Organizat1n,WHO)归类为致癌物质。其他种戴奥辛或戴奥辛混合物的毒性亦常被描述与TCDD有关联。
[0003]传统上，分析化学方法像是色层分析及质谱技术，常被用于判定样品中的戴奥辛含量。然而，这些方法不具成本效益且耗时，更重要地，所得的结果不是直接与戴奥辛毒性相关。所有这些既有的缺点使得分析化学方法不适用于高速筛选。
[0004]1995年，戴奥辛的生物效应被报导是通过芳香烃受体(aryl hydrocarbonreceptor,AHR)路径所介导的(Fernandezsalguero, et al., Science 268:722-726，1995)。AHR为细胞质中的常驻蛋白，其与两个热休克蛋白质90(heat shock protein 90，HSP90)分子形成异聚体。戴奥辛分子可轻易地穿过细胞膜与该异聚体结合，使得该异聚体进行转形而导致AHR与HSP90分离。自由型式的AHR被活化以转位至细胞核中，于该处其可与一芳香经受体核转位子(AHR nuclear translocator, ARNT)蛋白结合。该AHR-ARNT复合物被证实为一转录活化子，其可与DNA中的特定调节序列结合，即包含所谓的戴奥辛应答元件(d1xin responsive element, DRE)序列，以及诱发下游效应基因的表达。由于与戴奥辛结合时，AHR会与HSP90分离并进而与ARNT结合的事实，许多种不同的生物分析方法因此在1990年代建立。例如，Wheelock等人提供一种检测试验样本中类戴奥辛化合物的方法(US5，529，899，1993年7月27日申请，1996年6月25日公告)。于该方法中，将试验样本与一异聚体(由不活化的AHR所形成)接触。当试验样本中存在类戴奥辛化合物时，它们将会与AHR结合，并使其从异聚体中被解离出来，并成为一种含有活性AHR，且与类戴奥辛化合物配体结合的复合物。接着，Wheelock等人进一步提供一种使用ARNT以最适化AHR的转形，以检测类戴奥辛化合物的方法(US6，127，136，1996年2月14日申请，2000年10月3日公告)。Okuyama等人提供使用单株化的抗戴奥辛抗体的酵素连结免疫吸附分析法(enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA)的研究，其灵敏度可达纳米等级(Okuyama, et al., Anal.Chem.76:1948-1956，2004)。然而，上述方法的灵敏度低而无法满足需求。
[0005]再者，基于突光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)技术的活体外生物分析亦被发展，该方法是去评估AHR与其结合对象间的交互作用，以判定试验样本中的戴奥辛含量(请参阅，例如:Lin, et al.，J.B1med.Sc1.15:833-840，2008 ;及 Lin, et al.，Chin.B1sc1.50 (I): 12-25，2007)。于此研究中，一种荧光共振能量转移(FRET)为基础的戴奥辛检测生物分析法被建立，其中AHR及与青荧光蛋白(cyan fluorescent protein,CFP)和黄突光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)融合的ARNT被暂时地共转染入大鼠肝癌细胞株H4IIEC3中。结果显示在转染细胞中，戴奥辛处理以剂量依存的模式向上调控FRET信号。尽管，该方法可达到高灵敏度及专一性，然而考虑到操作活细胞及全细胞固有的变异性所带来的繁琐，使用以细胞为基底作为检测类戴奥辛化合物的系统较为不理想。
[0006]近来，一种无细胞的分析系统于WO 2005/100991中被提及，其中重组的AHR及ANRT以其部分纯化的形式预计被用于FRET分析中。然而，没有任何实际的数据在这方面被提出。
[0007]因此，仍亟需开发一具成本效益且高速筛检的方法，以及无细胞的系统，以具高灵敏度方式进行快速且量化的类戴奥辛化合物的检测。


【发明内容】

[0008]于本发明中，本发明人不可预期地发现，一转染细胞的全细胞溶解物中可表达一含有AHR及报导子胜肽的融合蛋白，该融合蛋白易被蛋白酶降解，且该降解与所加入的类戴奥辛化合物的浓度有关系，即呈现一种剂量依存的关系。因此，一种于不含细胞的系统中检测试验样本中类戴奥辛化合物的方法遂被建立，该方法是通过使用全细胞溶解物以及监控AHR蛋白在类戴奥辛化合物存在的情况下的降解情形。
[0009]在一方面，本发明提供一种检测试验样本中类戴奥辛化合物的方法，其包含:
[0010]提供一衍生自一细胞的全细胞溶解物，该细胞经转染而可表达一或多个与一报导子胜肽融合的融合蛋白，其中之一包含一 AHR，以及其中该全细胞溶解物包含存在于一游离复合物中的融合蛋白；
[0011]将试验样本与该全细胞溶解物接触一段足够的时间，以使得游离复合物中的融合蛋白在类戴奥辛化合物存在情况下进行降解；以及
[0012]检测由该报导子胜肽所生成的可测得信号，以作为融合蛋白的量化指标，以及与一参考信号进行比较，该参考信号是由已知浓度的类戴奥辛化合物所产生，接着判定于试验样本中类戴奥辛化合物的存在或含量。
[0013]另一方面，本发明提供一种检测试验样本中类戴奥辛化合物的方法，其涉及生物发光共振能量转移(b1luminescence resonance energy transfer, BRET)技术,藉此增进其灵敏度。
[0014]再另一方面，本发明提供一无细胞系统，可用于进行本发明所提及的检测试验样本中类戴奥辛化合物的方法。

【专利附图】

【附图说明】
[0015]前述
【发明内容】
以及后述实施方法，当结合所附的图式时，可更易于理解。出于阐述本发明的目的，在图式中显示当前较佳的具体实施例。然而，应理解的是，本发明不受限于该具体实施例。
[0016]于图示中:
[0017]图1A-图1D为本发明中用于转染细胞的质粒的限制性酶切图谱，其中图1A显示AHR的限制性酶切位点，图1B显示AIP及P23的限制性酶切位点，图1C显示ARNT的限制性酶切位点，以及图1D显示HSP90的限制性酶切位点(T为四环霉素抑制子(tetracyclinerepressor)的结合位置，以及Z为博莱霉素(Ze1cin)抗药性基因)。
[0018]图2A显示AAPH及AAPA细胞的Western blot分析，图2B所示的直方图显示BRET信号的相对量是由加入不同浓度的3MC至AAPA细胞所生成，以及图2C所示的直方图则是加入AAPH细胞所生成。
[0019]图3的直方图显示RL信号(RLUs)的相对量，是由加入不同浓度的T⑶D至培养于室温的AAPA细胞溶解物中所生成。
[0020]图4为一标准曲线显示RL信号(RLUs)的相对量，是由加入不同浓度的3MC至37°C下的AAPA细胞溶解物中所生成。
[0021]图5为一标准曲线显示RLUs的相对量，是由加入不同浓度的T⑶D至37°C下的AAPA细胞溶解物中所生成。

【具体实施方式】
[0022]除非另有定义，所有于此所用技术性及科学性术语，皆与本发明所属领域技术人员所习知的意义相同。
[0023]除非文中另有清楚地指出，否则本文所使用的「一」、「一种」、及「该」包括复数形式的含义。因此，例如当提及「一样本」时，包括复数个该样本及本发明所属领域技术人员所习知的同等物。
[0024]在此所使用的「戴奥辛」或「类戴奥辛化合物」一词是指多卤芳香烃的家族，包括多氯二联苯戴奥辛、多氯二联苯呋喃、多氯联苯，以及具有与戴奥辛相似毒性的结构相似物。类戴奥辛化合物可为一个或多个化合物，是选自一化学物质家族，该家族由约210个戴奥辛衍生物所组成，其包括75种的多氯二联苯戴奥辛(polychlorinated dibenzo-p-d1xins,PCDDs)及 135 种的多氯二联苯呋喃(polychlorinated dibenzofurans, PCDFs),即如Hu et al., J.Toxicol.Environ.Health B Crit.Rev.2:183-210 所述者。于本发明的一实施例中，该类戴奥辛化合物为2，3，7，8-四氯双苯-P-戴奥辛(TCDD)或3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene, 3MC)。于本发明中，该类戴奥辛化合物亦可于试验样本中为一混合物的形式，其中含有一种以上的类戴奥辛化合物。
[0025]在此所使用的「芳香烃受体」、或缩写为「AHR」一词包含自然存在的及其重组的形式，以及具相同功能性的变体或其片段。一具功能性的AHR，当以不活化或无配体形式存在时，可与其结合对象结合以构成一异聚体，以及当其与一配体结合时(如类戴奥辛化合物)，其易于自异聚体中解离出来。该活化或配体结合型式的AHR接着会与ARNT蛋白结合。
[0026]在此所使用的「结合对象」一词是指包含所有会与不活化的AHR蛋白结合成异聚体的分子，特别是指蛋白分子。该结合对象包括但不限于热休克蛋白质90(HSP90)、芳香烃受体交互作用蛋白(AHR-1nteracting protein, AIP)、P23及其他存在于异聚体的蛋白分子、或其组合。于一较佳的具体实施例中，该结合对象是自然存在的或重组的HSP90、或为一具相同功能的变体或其片段。在此所使用的「芳香烃受体核转位子」或缩写为「ARNT」一词是指包含自然存在的及其重组的形式，以及具相同功能性的变体或其片段。一具功能性的ARNT是能与AHR配体复合物结合。
[0027]在此所使用的「报导子胜肽」一词是指一胜肽标签，是被用于与AHR、其结合对象、或ARNT进行融合，以构成一融合蛋白，以及其可以适用的方法进行分析，进而检测融合蛋白的存在与否及/或存在量、或融合蛋白间的交互作用。于一具体实施例中，青荧光蛋白(CFP)及黄荧光蛋白(YFP)于该分析方法中作为一报导子胜肽对，以进行FRET分析。于另一具体实施例中，一生物发旋旋光性荧光酶，较佳为海肾荧光酶(Renilla luciferase, RL)，是与YFP—同被用于该分析方法中，作为一报导子胜肽对，以进行BRET分析。于一较佳的具体实施例中，海肾荧光酶(RL)搭配腔肠素(作为一可催化的受质)被用于该分析方法中，其中该受质通过酵素性的催化反应以进行氧化而发出冷光。
[0028]在此所使用的「全细胞溶解物」一词是指无活细胞悬浮液，是将细胞溶解以取得，其产生自然的或重组形式的一或多个可用于施行该分析方法的蛋白。根据本发明，该全细胞溶解物是衍生自一经基因工程改造可表达一与报导子胜肽融合的AHR蛋白的细胞。再者，一或多个其结合对象，像是HSP90、或ARNT亦可被使用。于本发明的一具体实施例中，该全细胞溶解物是衍生自一经基因工程改造可共表达AHR蛋白及HSP90蛋白的细胞。于本发明的一特定实施例中，该细胞被制备用以共表达与RL、ΑΙΡ、P23融合的AHR蛋白，及与YFP融合的HSP90蛋白，称作「AAPH细胞」。于本发明另一具体实施例中，该全细胞溶解物衍生自一经基因工程改造可共表达AHR蛋白及ARNT蛋白的细胞。于本发明的一特定实施例中，该细胞被制备用以共表达与RL、ΑΙΡ、P23融合的AHR蛋白，及与YFP融合的ARNT蛋白，称作「AAPA细胞」。较佳地，AIP可为一具His标签的AIP，以及P23可为一具His标签的P23。于本发明的一特定实施例中，该细胞被制备用以共表达与RL、ΑΙΡ、P23融合的AHR蛋白、与YFP融合的ARNT蛋白，及具His标签的ARNT蛋白，称作「AAPAA细胞」。此外，于本发明所使用到的该细胞可衍生自一稳定的细胞株，像是一哺乳动物的细胞株。
[0029]在此所使用的「一段足够的时间，以使得游离复合物中的融合蛋白进行降解」一词是指:当处理类戴奥辛化合物时，有一段足够的时间，足以有效地产生一可测得的AHR融合蛋白的减少量，此减少量相较于未经类戴奥辛化合物处理的对照组，可被直接认定与存在于试验样本中完整AHR蛋白的量成正比。该段时间可能会因温度、该报导子系统的灵敏度、用于试验的细胞株、及其他可能影响测量AHR降解的因子而有所不同。典型地，该段时间介于30分钟至2小时。
[0030]在此所使用的「可测得的信号」一词是指一于报导子系统中一性质的改变或存在，其可被感知到或感测到，无论是通过直接的观察或借助工具，以及此为该融合蛋白存在于该试验样本中的功能。部分可测得信号的实施例为可见光或红外光吸收的荧光、磷光、或化学发光的改变。其他可测得信号的实施例可为电化学性质的改变。
[0031]于本发明中，提供一种于不含细胞的系统中检测类戴奥辛化合物的方法。该方法包含:
[0032]提供一衍生自一细胞的全细胞溶解物，该细胞经转染而可表达一或多个与一报导子胜肽融合的融合蛋白，其中之一包含融合至一报导子胜肽的AHR，以及其中该全细胞溶解物包含存在于一游离复合物中的融合蛋白；
[0033]将试验样本与该全细胞溶解物接触一段足够的时间，以使得游离复合物中的融合蛋白在类戴奥辛化合物存在情况下，进行降解；以及
[0034]检测由该报导子胜肽所生成的可测得的信号，以作为融合蛋白的量化指标，以及与一参考信号进行比较，该参考信号由已知浓度的类戴奥辛化合物所产生，接着判定于试验样本中类戴奥辛化合物的存在或含量。
[0035]于本发明中，该细胞被制备以表达与一报导子胜肽融合的AHR融合蛋白，以及接着通过使用任何标准的或该领域常用的方法将该细胞溶解以得到该全细胞溶解物。于本发明的一具体实施例中，该细胞被制备以共表达融合至报导子胜肽的AHR，及一或多个AHR的结合对象，像是HSP90或ARNT。
[0036]根据本发明，一或多个除HSP90以外的结合对象，可进一步结合以形成一稳定的复合物。于本发明中所用的除了 HSP90以外的结合对象是选自由AIP、P23及其组合所组成的群组。如实施例2中所示，根据本发明中的一细胞的实施例为AAPA细胞，其共表达AHR、AIP、P23及ARNT ；以及其他实施例为AAPH细胞，其共表达AHR、AIP、P23及HSP90。用于检测于试验样本中的类戴奥辛化合物的无细胞系统,是通过使用细胞的全细胞溶解物来建立，其中该细胞根据本发明制备以表达AHR，特别是指AAPA细胞或AAPH细胞。此外，用于检测试验样本中类戴奥辛化合物的方法，亦使用该等细胞的全细胞溶解物，像是AAPA细胞或AAPH细胞皆可使用。于实施例3及4中，该用于检测3MC或TCDD的方法，是使用AAPA细胞的全细胞溶解物被确认可使用。
[0037]根据本发明，于试验样本中的类戴奥辛化合物，可通过将测得的信号与对照组试验中所测得的参考信号比较，以定性方式检测，其中于对照组试验中将全细胞溶解物与试验样本的化学物质接触，不会对于AHR路径有任何影响；或可通过将测得的信号与一标准曲线图进行比较，以定量方式检测，其中该标准曲线是利用对应已知浓度的类戴奥辛化合物所描绘。
[0038]于本发明中，任何共振能量转移技术可搭配本发明的方法以增强灵敏度及可信度。例如，荧光共振能量转移技术(FRET)或生物发光共振能量转移技术(BRET)可被用于本发明中。本发明的一实施例中，使用生物发光共振能量转移技术(BRET)即可不须如同荧光共振能量转移分析(FRET) —样需使用激发光以诱发荧光转移，其是通过将常用于FRET中的青荧光蛋白(CFP)标签以一生物发旋旋光性荧光酶取代，该荧光酶可源自海三色堇的海肾(Xu, et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96 (I): 151-156)。于本领域中众所皆知的是，BRET及FRET在灵敏度及可信度上是相媲美的。
[0039]根据本发明，当该方法搭配BRET技术时，可有效增强对于类戴奥辛化合物的敏感度至微微摩尔等级，相较于传统以FRET为基础的戴奥辛检测系统。
[0040]因此，本发明提供一无细胞系统，可用于施行本发明所述用于检测试验样本中类戴奥辛化合物的方法，包含一衍生自一细胞的全细胞溶解物，该细胞经转染可表达一或多个与一报导子胜肽融合的融合蛋白，其中之一包含一 AHR，以及其中该全细胞溶解物包含存在于一游离复合物中的融合蛋白；以及一种可用于检测由该报导子胜肽所生成的可测得的信号的装置。本发明的方法及无细胞系统，提供给用户更节省试验时间及符合成本效益等优点。此外，本发明可建立了一大规模且高速的筛选平台，以筛选可能受戴奥辛污染的样本。
[0041]本发明借助以下的实施例更特定地说明，所提供的实施例仅用于示例，而非用于限制的目的。
[0042]以下实施例仅用于示例的目的，而非用以限制本发明的范畴。
[0043]实施例1:质粒的构建
[0044]AHR (图1A所示的构建)、AIP及P23 (图1B所示的构建)、ARNT (图1C所示的构建)、及HSP90 (图1D所示的构建)是从HEK293cDNA中扩增而得，且所有的点突变皆被修正。海肾突光酶(RU 衍生自 pRL-TK(Promega Corporat1n, Madison, WI, USA)以及 YFP 衍生自 pEYFP-Nl(Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA.USA)。
[0045]实施例2:稳定的转染细胞株的生成
[0046]利用Iipofectamin 2000? 转染剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),根据制造商的使用说明，将AHR-RL、AIP-HIS及P23-HIS转染至四环霉素调控的表达细胞(T-REx?细胞)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。将经转染的细胞培养于 DMEM 培养基(Gibco, USA)，其中含有 10 % 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) (Gibco, USA)、5 μ g/ml 灭痕素(Blasticidin)、250 μ g/ml 博莱霉素(Zeocin)及 500 μ g/ml G418。接着将优化的细胞株以ARNT-YFP或HSP90-YFP进行转染，并以200 μ g/ml潮霉素(Hygromycin)进行筛选，以得到转染ARNT-YFP的稳定细胞株(称为「AAPA细胞」)，以及得到转染HSP90-YFP的稳定细胞株(称为「AAPH细胞」)。
[0047]实施例3:于AAPA及AAPH细胞中通过BRET分析法检测戴奥辛
[0048]将实施例2中制备的AAPH及AAPA细胞，以I μ g/ml四环霉素处理24小时，接着加入10 μ M 3MC3小时。以西方墨溃法确认经诱导的AHR-RL、AIP-His (有His标签的ΑΙΡ)、P23-HIS (有His标签的P23)、HSP90-YFP、或ARNT-YFP的表达情形。以特定的抗体对细胞质及细胞核片段进行检测，其包括ant1-RL、ant1-YFP、ant1-LaminA/C及ant1-GAPDH。Western bolt的结果显示于图2A，其可确认将AAPH及AAPA细胞株以3MC处理后，AHR及ARNT蛋白的定位。
[0049]为了可使诱导的蛋白表达及AHR复合物形成，根据实施例2所述的方法，制备稳定共转染AHR-RL、ΑΙΡ-HIS、P23-HIS及ARNT-YFP的AAPA细胞，再以I μ g/ml的四环霉素处理48小时。接着将处理后的细胞以磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS)冲洗两次。
[0050]为了检测戴奥辛，将不同浓度的3-甲基胆蒽(3MC) (BoehringerMannheim, Mannheim, Germany)与细胞混合，并于96孔白色聚苯乙烯盘(Corning, USA)中，于37°C培养I小时。BRET信号是通过加入海肾荧光酶的受质-腔肠素至最终浓度为0.35M来判定。将所得的BRET信号与3MC的添加浓度对照作为图表，结果如图2B。如图2B所示，于AAPA细胞(其可共表达AHR-RL、AIP、P23及ARNT-YFP)中该BRET信号，是以剂量依存方式增加。
[0051]另一方面，该AAPH 细胞经稳定共转染 AHR-RL、AIP-HIS、P23-HIS 及 HSP90-YFP，其经制备后接着与不同浓度的3MC混合,并于96孔白色聚苯乙烯盘(Corning, USA)中，于37°C培养。如图2C所示，当以3MC处理AAPH细胞(其可共表达AHR-RL、AIP-HIS、P23_HIS及HSP90-YFP)时，该BRET信号遂被以剂量依存方式抑制。
[0052]实施例4:通过于无细胞系统中降解AHR-RL以检测戴奥辛
[0053]将从实施例2取得的5X 16个AAPA细胞培养于15公分盘中培养24小时，盘中含有25ml DMEM培养基，且该培养基中含有10% FBS及3.5 μ g/ml四环霉素。收获细胞并重新悬浮于1ml预冷的PBS中。于冰上使用超音波破碎机(Branson, Danbury, CT, USA),通过超音波将细胞溶解，其中震幅为10%，30个循环，5秒开，15秒关。将细胞碎片以l，000g离心10分钟移除。进行检测时，将90μ1的不含细胞碎片的细胞溶解物和不同浓度的3MC混合，并在室温下培养于96孔白色聚苯乙烯盘(Corning, USA)中。海肾荧光酶信号通过加入腔肠素至终浓度为0.35 μ M后即可判定。检测T⑶D的结果显示于图3中(y =136.97X+2251.9，R2 = 0.9794)。
[0054]此外，将不含细胞的细胞溶解物及不同浓度的3MC及T⑶D混合，并在37°C下分别培养于96孔白色聚苯乙烯盘(Costar)中。检测3MC及T⑶D的结果分别如图4及图5所示。结果显示，于无细胞系统中，经过3MC或TCDD的处理，海肾荧光酶信号会以剂量依存方式增加，且3MC或T⑶D的检测极限可低至10_16M。如图4，该信号明显地随着3MC的处理，以一种剂量依存方式(y = 114.86x+2330, R2 = 0.9794)增加。同时如图5所示，该信号明显地随着TCDD的处理，以一种剂量依存方式(y = 4440.2x+130544, R2 = 0.977)增加。于无细胞系统中，无论是对于3MC及TCDD的检测皆具有很好的相关性，且相关系数对于该两种物质的检测皆大于0.95。
[0055]根据本发明指出，3MC或T⑶D诱导的BRET信号，首次可于1_ρΜ处理时观察到，意味此检测系统的灵敏度可达微微摩尔等级。此外,通过加入3MC或TCDD可诱导出的AHR-RL降解信号，可检测的浓度可低至10aM。基于以上结果的结论，相较于该领域习知的检测系统，该BRET为基底的戴奥辛检测系统更为灵敏。
[0056]当参照上述较佳具体实施例描述本发明时，应被了解的是这些较佳具体实施例仅用于例示的目的，而非用以限制本发明的范畴，且对于本领域技术人员而言，很清楚这些可能进行的不同修饰及改变，不会背离本发明的精神及范畴。
【权利要求】
1.一种检测试验样本中类戴奥辛化合物的方法，其包含: 提供一衍生自一细胞的全细胞溶解物，该细胞经转染而可表达一或多个与一报导子胜肽融合的融合蛋白，其中之一包含一芳香烃受体(AHR)，以及其中该全细胞溶解物包含存在于一游离复合物中的融合蛋白； 将试验样本与该全细胞溶解物接触一段足够的时间，以使得游离复合物中的融合蛋白在类戴奥辛化合物存在情况下进行降解；以及 检测由该报导子胜肽所生成的可测得的信号，以作为融合蛋白的量化指标，以及与一参考信号进行比较，该参考信号是由已知浓度的类戴奥辛化合物所产生，接着判定于试验样本中类戴奥辛化合物的存在或含量。
2.如权利要求1的方法，其中该类戴奥辛化合物包含多氯二联苯戴奥辛、多氯二联苯呋喃、多氯联苯及具有戴奥辛毒性的结构相似物中的任何化合物，或其混合物。
3.如权利要求2的方法，其中该类戴奥辛化合物为2,3,7,8-四氯双苯-p-戴奥辛(TCDD)或3-甲基胆蒽(3MC)。
4.如权利要求1的方法，其中该全细胞溶解物衍生自一经转染的细胞，其可共表达AHR，及一 AHR结合对象。
5.如权利要求4的方法，其中该结合对象为热休克蛋白90(HSP90)，或一具相同功能性的变体或其片段。
6.如权利要求4的方法，其中该全细胞溶解物衍生自一经转染的细胞，其可共表达AHR、HSP90及一或多个非HSP90的AHR结合对象。
7.如权利要求6的方法，其中该非HSP90的AHR结合对象选自由芳香烃受体交互作用蛋白(AIP)、P23及其组合所组成的群组。
8.如权利要求4的方法，其中该全细胞溶解物衍生自一经转染的细胞，其可共表达AHR、AIP、P23 及 HSP90。
9.如权利要求1的方法，其中该全细胞溶解物衍生自一经转染的细胞，其可共表达一包含与报导子胜肽融合的芳香烃受体(AHR)的融合蛋白，以及一包含与报导子融合的芳香烃受体核转位子(ARNT)或具相同功能性的变体或其片段的第三融合蛋白。
10.如权利要求9的方法，其中该全细胞溶解物衍生自一经转染的细胞，其可共表达AHR、ARNT及一或多个非HSP90的AHR结合对象。
11.如权利要求10的方法，其中该非HSP90的AHR结合对象选自由AIP、P23及其组合所组成的群组。
12.如权利要求9的方法，其中该全细胞溶解物衍生自一经转染的细胞，其可共表达AHR、AIP、P23及 ARNT。
13.如权利要求1的方法，其中任何的融合蛋白为自然存在及重组的类型。
14.如权利要求1的方法，其中该报导子胜肽为青荧光蛋白(CFP)或黄荧光蛋白(YFP) ο
15.如权利要求1的方法，其中该报导子胜肽为生物发旋旋光性荧光酶。
16.如权利要求15的方法，其中该生物发旋旋光性荧光酶为海肾荧光酶(RL)。
17.如权利要求1的方法，其中该全细胞溶解物衍生自一哺乳动物细胞株。
18.如权利要求12的方法，其中该全细胞溶解物衍生自一经转染的细胞，其可共表达融合至RL的AHR、具His标签的AIP、具His标签的P23及融合至YFP的ARNT。
19.如权利要求1的方法，是结合生物发光共振能量转移(BRET)技术，以增进灵敏度。
20.一种用于施行如权利要求1所述方法的无细胞系统，其包含一衍生自一细胞的全细胞溶解物，该细胞经转染可表达一或多个与一报导子胜肽融合的融合蛋白，其中之一包含一 AHR，以及其中该全细胞溶解物包含存在于一游离复合物中的融合蛋白，以及一种用于检测由该报导子胜肽所生成的可检测信号的装置。
【文档编号】G01N33/567GK104395753SQ201280072473
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2012年9月5日 优先权日:2012年4月19日
【发明者】李心予 申请人:李心予