用于检测多特异性结合物的游离结合搭档的方法

用于检测多特异性结合物的游离结合搭档的方法
【专利摘要】本文报道了用于检测样品中的多特异性抗体的游离抗原的方法，从而待检测的抗原能够被多特异性抗体的第一结合位点特异性结合，包括孵育包含游离抗原和多特异性抗体的样品与抗独特型抗体的步骤，所述抗独特型抗体特异性结合多特异性抗体的不同于第一结合位点的第二结合位点，从而从样品中耗尽了多特异性抗体。
【专利说明】用于检测多特异性结合物的游离结合搭档的方法
[0001]本发明涉及用于检测样品中的游离的(即，未复合的)结合搭档的方法，所述结合搭档(binding partner)可以被样品中的多特异性结合物(multispecific binder)特异性结合，其中在检测游离的结合搭档之前，从样品中耗尽了与多特异性结合物结合的结合搭档。
_2] 发明背景
[0003]含有抗体的标准固相免疫测定涉及在固相上吸附/固定的抗体(捕获抗体)、抗原和针对与酶或可检测的标记(示踪抗体)缀合的抗原的另一表位的抗体之间形成复合物。在测定中，形成夹心物(sandwich):固相/捕获抗体/抗原/示踪抗体。在夹心物等催化的反应中，抗体-缀合酶的活性与孵育基质中的抗原浓度成比例。抗独特型抗体测定提及在例如 US5, 219，730 ；W0 87/002778 ；EP O 139 389 和 EP O 170 302 中。ffadhwa,M.等人(J.1mmunol.Methods278 (2003) 1-17)报道了用于检测、测量和表征由生物治疗剂诱导的不理想抗体的对策。EP I 917 854中报道了用于生产抗独特型抗体的方法。
[0004]Chen, Y.-P.等人(Clin.Vac.1mmunol.14(2007)720-725)报道了通过同时针对人红细胞和乙肝病毒表面抗原的双特异性双抗体介导的凝集测定快速检测乙肝病毒表面抗原。Bruynck，A.等人(J.Cancer67 (1993) 436-440)报道了用于癌症治疗的人源化双特异性单克隆抗体的特征。在WO 2006/096697中，报道了用于确定蛋白质二价和抗体治疗剂的方法。
[0005]发明概沭
[0006]本文报道了用于检测游离的(即，未复合的)结合搭档的存在，和/或用于确定游离的(即，未复合的)结合搭档的量的方法，所述结合搭档可以特异性通过多特异性结合物的至少一个结合特异性结合。已发现，在确定游离结合搭档的存在或量之前，从样品中耗尽被多特异性结合物特异性结合的结合搭档，即，结合搭档-多特异性结合物-复合物，是有利的。根据本文报道的方法，多特异性结合物的耗尽是通过孵育样品与单特异性结合物实现的，所述单特异性结合物特异性结合多特异性结合物的一个结合特异性，从而单特异性结合物特异性结合多特异性结合物的结合特异性，所述多特异性结合物不结合待确定的结合搭档(参见图2)。
[0007]本文报道的一个方面是用于体外确定结合搭档(抗原、靶和被分析物)的存在和/或量的方法，所述结合搭档可以被多特异性结合物的第一结合特异性特异性结合，其中在检测结合搭档之前，通过孵育样品和单特异性结合物，耗尽了与多特异性结合物结合的结合搭档，其中单特异性结合物特异性结合多特异性结合物的第二结合特异性。
[0008]在一个实施方案中，待检测的结合搭档是未复合的结合搭档或游离结合搭档。
[0009]因此，本文报道的一个方面是用于确定多特异性结合物的结合搭档的存在和/或量的体外方法，使得多特异性结合物的第一结合特异性可以特异性结合结合搭档，包括步骤:
[0010]-孵育包含结合搭档和多特异性结合物的样品与单特异性结合物，所述单特异性结合物特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性结合物的第二结合特异性。[0011]在一个实施方案中，方法包括步骤:
[0012]-孵育包含结合搭档和多特异性结合物的样品与单特异性结合物，所述单特异性结合物特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性结合物的第二结合特异性，和
[0013]-确定耗尽多特异性结合物的样品中的结合搭档的量。
[0014]在一个实施方案中，方法包括步骤:
[0015]-孵育包含结合搭档和多特异性结合物的样品与单特异性结合物，所述单特异性结合物特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性结合物的第二结合特异性，
[0016]-在确定游离的结合搭档的存在或量之前，从样品中耗尽单特异性结合物-多特异性结合物-复合物，
[0017]-确定耗尽多特异性结合物的样品中的结合搭档的量。
[0018]随着与特异性结合多特异性结合物的第二结合特异性的单特异性结合物孵育，从样品中去除了多特异性结合物。同时，还从样品中去除了结合搭档-多特异性结合物-复合物。
[0019]在一个实施方案中，多特异性结合物选自抗体、包含抗体或抗体片段和非抗体多肽的融合多肽、包含抗体或抗体片段和可溶性受体的融合多肽，或包含抗体或抗体片段和肽类结合分子的融合多肽。
[0020]在一个实施方案中，多特异性结合物是抗体。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体、或三特异性抗体、或四特异性抗体、或五特异性抗体、或六特异性抗体。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。
[0021]在一个实施方案中，单特异性结合物是抗独特型抗体。
[0022]在一个实施方案中，结合特异性是结合位点或一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。
[0023]在一个实施方案中，抗独特型抗体与固相结合。
[0024]在一个实施方案中，抗独特型抗体是生物素化的，且固相包被了链霉抗生物素。在一个实施方案中，固相是是包被了链霉抗生物素的顺磁珠或包被了链霉抗生物素的琼脂糖珠。
[0025]本文报道的一个方面是使用免疫测定，免疫学确定样品中的多特异性结合物的结合搭档的存在和/或量的方法，其中在确定结合搭档之前，从样品中耗尽多特异性结合物。
[0026]在本文报道的所有方面的一个实施方案中，结合搭档是游离的结合搭档，即，没有与多特异性结合物结合或复合的结合搭档。
[0027]在一个实施方案中，抗独特型抗体是针对多特异性结合物的生物素化的抗独特型抗体，并通过链霉抗生物素与固相缀合。
[0028]在本文报道的方法的一个实施方案中，抗独特型抗体是包含至少两种抗独特型抗体的混合物，所述抗独特型抗体在它们与固相缀合的抗体位点中不同。
[0029]在一个实施方案中，抗体与其缀合搭档的缀合是通过化学结合来实施的，所述化学结合经由N-末端和/或ε -氨基(赖氨酸)，不同赖氨酸的ε -氨基，药物抗体的氨基酸骨架的羧基_、巯基_、羟基-和/或酚-官能团，和/或药物抗体的碳水化合物结构的糖醇基。
[0030]在一个实施方案中，抗独特型抗体混合物包含通过至少两种不同的氨基与固相缀合的抗独特型抗体。这类通过不同氨基的偶联可以通过如下实施:第一步，ε-氨基的一部分与化学保护剂酰基化，例如通过朽1康酰化(citraconylat1n)。在第二步,通过剩余氨基实施缀合。之后，去除柠康酰化作用，抗体通过剩余的游离氨基与固相缀合，即，获得的抗体通过未被柠康酰化保护的氨基与固相缀合。合适的化学保护剂在未保护的侧链胺上形成键，与N-末端的键不同且较不稳定。许多这类化学保护剂是已知的(参见例如EP O 651761)。在一个实施方案中，化学保护剂包括环状二羧酸酸酐，例如马来酸酐或柠康酸酐。
[0031]在一个实施方案中，抗独特型抗体通过被动吸附与固相缀合。被动吸附是例如Butler, J.E.在 “Solid Phases in Immunoassay，，(1996) 205-225 和 Diamandis, Ε.P.和Christopoulos, Τ.K.(编者)在 “ Immunoassays” (1996) Academic Press (San Diego)中描述的。
[0032]在一个实施方案中，抗独特型抗体通过特定的结合对缀合(固定)。在一个实施方案中，这类结合对(第一组分/第二组分)选自链霉抗生物素或抗生物素蛋白/生物素、抗体 / 抗原(参见例如，Hermanson, G.T.等人，B1conjugate Techniques, AcademicPress (1996))、凝集素/多糖、类固醇/类固醇结合蛋白、激素/激素受体、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G等。在一个实施方案中，抗独特型抗体与生物素缀合，且通过固定的抗生物素蛋白或链霉抗生物素实施固定。
[0033]本文报道的一个方面是用于确定样品中的多特异性抗体的抗原的存在和/或量的体外方法，其中待检测的抗原可以被多特异性抗体的第一结合特异性可以特异性结合，包括步骤:
[0034]-孵育包含多特异性抗体、结合多特异性抗体的抗原和游离抗原的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性抗体的第二结合特异性。
[0035]在一个实施方案中，方法包括步骤:
[0036]-孵育包含抗原和多特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性抗体的第二结合特异性，和
[0037]-确定耗尽多特异性抗体的样品中的抗原的量。
[0038]在一个实施方案中，方法包括步骤:
[0039]-孵育包含抗原和多特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性抗体的第二结合特异性，
[0040]-在确定游离抗原的存在或量之前，从样品中耗尽抗独特型抗体-多特异性抗体-复合物，
[0041]-确定耗尽多特异性抗体的样品中的抗原的量。
[0042]随着与特异性结合多特异性抗体的第二结合特异性的抗独特型抗体孵育，从样品中去除多特异性抗体。同时还从样品中去除抗原-多特异性抗体-复合物。
[0043]在一个实施方案中，样品包含多特异性抗体、游离抗原和多特异性抗体-抗原复合物，且检测多特异性抗体的游离抗原。
[0044]在一个实施方案中，抗独特型抗体与顺磁珠缀合。
[0045]在一个实施方案中，抗独特型抗体与固相缀合。
[0046]在一个实施方案中，抗独特型抗体是生物素化的，且固相包被了链霉抗生物素。在一个实施方案中，固相是包被了链霉抗生物素的顺磁珠或包被了链霉抗生物素的琼脂糖珠。
[0047]在一个实施方案中，抗独特型抗体与多特异性抗体的第二结合特异性具有15I/mol*s或更高的解离常数ka。
[0048]在一个实施方案中，抗独特型抗体对于与多特异性抗体的第二结合特异性的结合具有5*1-8Hi01/1或更低的Kd值。
[0049]在一个实施方案中，结合特异性是结合位点。在一个实施方案中，结合位点是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。
[0050]在一个实施方案中，与抗独特型抗体孵育约10分钟至约36小时。
[0051]在一个实施方案中，调整样品至多特异性抗体浓度为约2 μ g/ml至约15 μ g/ml。
[0052]在一个实施方案中，调整样品至总抗原浓度为约lng/ml至约250ng/ml。
[0053]在一个实施方案中，方法包括下列步骤:
[0054]-孵育包含多特异性抗体、多特异性抗体结合的抗原和游离抗原的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性抗体的第二结合特异性，以形成抗独特型抗体-多特异性抗体复合物，和
[0055]-从样品中去除抗独特型抗体-多特异性抗体复合物。
[0056]在一个实施方案中，抗独特型抗体-多特异性抗体复合物是抗独特型抗体-多特异性抗体复合物和抗独特型抗体-多特异性抗体-抗原复合物的混合物。
[0057]在一个实施方案中，方法包括下列步骤:
[0058]-孵育包含抗原和多特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性抗体的第二结合特异性，从而形成抗独特型抗体-多特异性抗体复合物，
[0059]-从样品中去除抗独特型抗体-多特异性抗体复合物，和
[0060]-确定耗尽了多特异性抗体的样品中的抗原的量。
[0061]在一个实施方案中，确定抗原的量包括下列步骤:
[0062]-孵育耗尽了多特异性抗体的样品与捕获抗体，所述捕获抗体特异性结合抗原，形成捕获抗体-抗原复合物，和
[0063]-关联所形成的捕获抗体-抗原复合物与样品中的抗原的量。
[0064]在一个实施方案中，确定抗原的量包括以下步骤:
[0065]-孵育耗尽了多特异性抗体的样品与捕获抗体，所述捕获抗体特异性结合抗原，形成捕获抗体-抗原复合物，
[0066]-孵育捕获抗体-抗原复合物与示踪抗体，使捕获抗体和示踪抗体结合抗原上的不重叠表位，和
[0067]-关联所形成的捕获抗体-抗原-示踪抗体复合物与样品中的抗原的量。
[0068]在一个实施方案中，确定抗原的量包括以下步骤:
[0069]-孵育耗尽了多特异性抗体的样品与捕获抗体，所述捕获抗体特异性结合抗原，形成捕获抗体-抗原复合物，
[0070]-孵育捕获抗体-抗原复合物与示踪抗体，使捕获抗体和示踪抗体结合抗原上的不重叠表位，[0071 ]-孵育捕获抗体-抗原-示踪抗体复合物与包含可检测的标记的检测抗体，使检测抗体在示踪抗体的可变结构域外的表位上特异性结合示踪抗体，和
[0072]-关联所形成的捕获抗体-抗原-示踪抗体复合物与样品中的抗原的量。
[0073]在一个实施方案中，多特异性抗体是具有第一结合特异性和并且具有第二结合特异性的双特异性抗体，所述第一结合特异性特异性结合第一抗原或抗原上的第一表位，所述第二结合特异性特异性结合第二抗原或抗原上的第二表位。
[0074]本文报道的一个方面是特异性结合多特异性抗体的第一结合特异性的抗独特型抗体的用途，用于从样品中耗尽与多特异性抗体的第二结合特异性结合的抗原。
[0075]发明详沭
[0076]本文报道了用于预处理样品，检测临床前和临床样品中的多特异性结合物的“游离结合搭档”的体外方法，所述多特异性结合物例如双特异性抗体/药物。
[0077]已发现在检测游离的结合搭档之前，必须从样品中耗尽多特异性结合物。
[0078]本文报道了特异性结合治疗性多特异性抗体的结合特异性的抗独特型抗体的用途，用于确定多特异性治疗性抗体的抗原的水平，所述抗原能够但是不被多特异性治疗性抗体的不同的第二结合特异性结合。抗独特型抗体用于从样品中耗尽多特异性抗体和多特异性抗体-待检测抗原-复合物。
[0079]因此，本文报道了用于确定多特异性结合物的游离结合搭档(抗原、靶和被分析物)的体外方法，所述游离结合搭档可以被多特异性结合物的第一结合特异性特异性地结合，其中在确定游离结合搭档之前，通过孵育样品和特异性结合多特异性结合物的第二结合特异性并且随之从样品中耗尽多特异性结合物和多特异性结合物-结合搭档-复合物的单特异性结合物，从样品中耗尽多特异性结合物，其中第二结合特异性不同于第一结合特异性。
[0080]确定总抗原、双特异性抗体-结合的抗原和游离抗原有助于监控治疗性抗体的疗法。总抗原代表游离的和双特异性抗体-结合的抗原的总和。
[0081]在下文中，用这样的多特异性抗体和抗原示例本文报道的方法，作为多特异性结合物的实施方案，所述多特异性抗体特异性结合多种抗原或相同抗原上的多个表位，作为结合搭档的实施方案，所述抗原被多特异性抗体的一个结合特异性特异性的结合。
[0082]本文中的术语“抗体”是广义使用的，涵盖了各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要其表现出理想的抗原结合活性。
[0083]在某些实施方案中，抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同的位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一个结合特异性是针对第一抗原的，另一个结合特异性是针对不同的第二抗原的。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合相同抗原的2个不同的表位。双特异性抗体可以被制备为全长抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗体是特异性结合第一和第二抗原的双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体具有i)特异性结合第一抗原或抗原上的第一表位的第一结合特异性，和ii)特异性结合第二抗原或相同抗原上的第二表位的第二结合特异性。在一个实施方案中，相同抗原上的第二表位是不重叠的表位。
[0084]多特异性抗体描述在WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792 或 WO2010/145793 中。
[0085]“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’ -SH、F(ab' )2 ;双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv);和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0086]抗体的“类”指抗体重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类抗体:1gA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中若干可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG” IgG2' IgG3' IgG4'IgA1和18?。与不同类型的免疫球蛋白对应的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、Y和μ。
[0087]术语“游离抗原”表示这样的抗原，其可以被抗体的结合特异性特异的结合，但目前还没有结合该结合特异性。在一个实施方案中，游离抗原是未结合抗体的抗原或未与抗体复合的抗原。
[0088]术语“Fe-区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区域，其含有恒定区的至少一部分。术语包括天然序列Fe-区和变体Fe-区。在一个实施方案中，人IgG重链Fe-区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而,Fe-区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另外说明，否则Fe-区或恒定区的氨基酸残基编号是根据EU编号系统的，也被称为 EU 指数，如 Kabat, Ε.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第 5 版，Public Health Service, Nat1nal Institutes of Health, Bethesda,MD(1991)，NIHPublicat1n91-3242。
[0089]“框架”或“FR”指除超变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR一般由4个FR结构域组成:FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般出现在VH(或VL)的下列序列中:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
[0090]“人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞生产的抗体的氨基酸序列，或源自利用人抗体储库或其他人抗体编码序列的来自非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这一定义具体排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
[0091]“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，通常2个可变结构域，其中所有的或基本上所有的HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，而所有的或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选的可包括至少一部分源自人抗体的抗体恒定区。抗体的“人源化形态”，例如非人抗体，指经过了人源化作用的抗体。
[0092]如本文中使用的，术语“超变区”或“HVR”指抗体可变结构域中序列高度变化和/或形成结构定义的环(“超变环”)的每个区域。一般而言，天然的四链抗体包括6个HVR;3个在VH中(H1、H2、H3)，3个在VL中(L1、L2、L3)。HVR —般包括来自超变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。示例性的超变环出现在第26-32位(LI)、第50-52位(L2)、第91-96位(L3)、第26-32位(Hl)、第 53-55 位(H2)和第 96-101 位(H3)氨基酸残基(Chothia，C.和 Lesk，A.M.，J.Mol.B1l.196(1987)901-917)。示例性 CDR (CDR_L1、CDR_L2、CDR-L3、CDR-Hl、CDR_H2 和 CDR-H3)出现在LI的第24-34位、L2的第50-56位、L3的第89-97位、Hl的第31-35B位、H2的第 50-65 位和 H3 的第 95-102 位氛基酸残基(Kabat, Ε.A.等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, Nat1nal Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991) ,NIH Publicat1n91-3242)。除了 VH 中的 CDRl 外，CDR—般包括形成超变环的氨基酸残基。CDR还包括“特异性决定残基”或“SDR”，是接触抗原的残基。包含在CDR区域中的SDR被称为缩写-CDR或a_CDR。示例性a_CDR(a_CDR-Ll、a_CDR_L2、a-CDR-L3、a-CDR-Hl、a_CDR-H2 和 a_CDR_H3)出现在 LI 的第 31-34 位、L2 的第 50-55 位、L3的第89-96位、Hl的第31-35B位、H2的第50-58位和H3的第95-102位氨基酸残基(Almagro, J.C.和 Fransson, J.，Front.B1sc1.13(2008) 1619-1633)。除非另外指出，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中是根据Kabat等人，见上文编号的。
[0093]如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除可能的变体抗体外，包含在群体中的单个抗体是相同的和/或结合相同表位，例如含有天然存在的突变或在生产单克隆抗体制品的过程中产生的突变，这类变体一般只以微量存在。与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，单克隆抗体制品的每个单克隆抗体都针对抗原上的单个决定子。因此，修饰词“单克隆”表示从基本均质的抗体群体中获得的抗体的特征，而不被视为要求通过任何特定的方法生产抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了这类方法和其他用于制备单克隆抗体的示例性方法。
[0094]术语“可变区”或“可变结构域”指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL) —般具有相似的结构，每个结构域包含4个保守的框架区(FR)和3个超变区(HVR)(参见例如Kindt，T.J.等人，Kuby Immunology,第 6 版，W.H.Freeman 和 C0.，N.Y.(2007),第 91 页)。单个 VH 或 VL 结构域足以产生抗原-结合特异性。此外，可以使用结合抗原的抗体的VH或VL结构域，分别筛选互补VL或VH结构域文库,分离结合特定抗原的抗体(参见例如Portolano, S.等人，J.1mmunol.150(1993)880-887 ；Clackson, T.等人，Nature352 (1991) 624-628)。
[0095]术语“抗独特型抗体”表示特异性结合亲本抗体的结合特异性(如结合位点)的抗体，即，针对例如亲本抗体的抗原结合位点。在一个实施方案中，抗独特型抗体特异性结合亲本抗体的一个或多个CDR。在一个实施方案中，亲本抗体是治疗性抗体。在一个实施方案中，亲本抗体是多特异性抗体。在一个实施方案中，亲本抗体是双特异性抗体。
[0096]如果通过表面等离振子共振(SPR)测定检测到信号降低50%或更多，在一个实施方案中，降低75%或更多，则两个表位是重叠的，所述SPR使用固定的抗体和可溶性抗原，或反之亦然，其中研究的表位的浓度是20-50nM，需要检测表位重叠的抗体的浓度是ΙΟΟηΜ。可选的，可以使用这样的方法，其中结合相同抗原的两个抗体的表位重叠是在竞争性测试系统的帮助下确定的。出于该目的，例如在基于细胞的酶免疫测定(ELISA)的帮助下，应用表达重组抗原表位的细胞，测试需要检测表位重叠的抗体是否与其它抗体竞争结合固定抗原。出于该目的，孵育固定抗原与标记形态的抗体和需要确定表位重叠的过量抗体。通过检测结合的标记，可以简单地验证表位重叠。如果关于已知抗体，确定了在相同浓度下，信号降低大于70 %，在一个实施方案中，降低大于80 %，或在更高浓度下(在一种情形中，15-倍过量的需要被测定表位重叠的抗体)，替换大于80%，在一个实施方案中，替换大于90%,则存在表位一致性或重叠,且两种抗体结合相同抗原上相同的或重叠的表位。
[0097]不同的免疫测定的原则描述在例如Hage，D.S.(Anal.Chem.71 (1999) 294R-304R)中。Lu，B.等人(Analystl21 (1996)29R-32R)报道了定向固定抗体，用于免疫测定。例如ffilchek, M.,和 Bayer, Ε.A.,在 Methods Enzymo1.184(1990)467-469 报道了抗生物素蛋白-生物素-介导的免疫测定。
[0098]单克隆抗体及其恒定结构域作为蛋白质含有多个反应性侧链，用于偶联结合搭档，如表面、蛋白质、聚合物(例如，PEG、纤维素或聚苯乙烯)、酶或结合对的成员。抗体的化学反应基是例如氨基(赖氨酸、^1-氨基)、巯基(胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)、羧酸基(天冬氨酸、谷氨酸)和糖醇基。这类方法描述在例如Aslam M.和Dent，A.的“B1conjugat1n”，MacMillan Ref.Ltd.1999,第 50-100 页中。
[0099]最常见的蛋白质反应基团之一是氨基酸赖氨酸的脂肪族ε-胺。一般而言，几乎所有的抗体都含有丰富的赖氨酸。在高于ΡΗ8.0时(pKa = 9.18)，赖氨酸胺是相当好的亲核基团，因此简单完全的与多种试剂反应，形成稳定的键。胺-反应试剂主要与赖氨酸和蛋白质的α-氨基反应。反应性酯，特别是N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)酯，是最常应用的修饰胺基的试剂。用于在含水环境中反应的最佳pH是ρΗ8.0至9.0。异硫氰酸盐/酯是胺修饰试剂，与蛋白质形成硫脲键。它们在含水溶液中与蛋白质胺反应(最佳是在ΡΗ9.0至
9.5)。醛类在温和的含水条件下与脂肪族或芳香族胺类、肼类和酰肼类反应，形成亚胺中间物(希夫氏碱)。希夫氏碱可以用温和的或强的还原剂(如硼氢化钠或氰硼氢化钠)选择性还原，衍生出稳定的烷基胺键。用于修饰胺类的其他试剂是酸酐。例如，二乙烯三胺五乙酸酸酐(DTPA)是含有2个胺-反应性酸酐基的双功能螯合剂。它可以与蛋白质的N-末端和ε-氨基反应，形成酰胺键。打开酸酐环，生成多价的金属螯合臂，其能够与配位复合物中的金属紧密结合。
[0100]抗体中另一种常见的反应基是来自含硫氨基酸一胱氨酸及其还原产物半胱氨酸(或二分之一胱氨酸)的巯基残基。半胱氨酸含有游离的巯基，比胺更亲核，一般是蛋白质中的最反应性官能团。巯基一般在中性PH下是反应性的，因此可以在存在胺的条件下与其他分子选择性偶联。由于游离的巯基是相对反应性的，具有这些基团的蛋白质的基团通常以二硫基或二硫键的氧化形态存在。在这类蛋白质中，用试剂如二硫苏糖醇(DTT)还原二硫键是生成反应性游离巯基必需的。巯基反应试剂是蛋白质上将偶联巯基以形成硫醚偶联产物的试剂。这些试剂在弱酸性至中性PH下快速的反应，因此可以在存在胺基的条件下选择性反应。文献报道了若干种硫醇化交联剂的用途，如Traut试剂(2-亚氨基硫杂环戊烷)、琥珀酰亚氨基(乙酰硫基)乙酸酯(SATA)和磺基琥珀酰亚氨基6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺基]己酸酯(Sulfo-LC-SPDP)，用于提供通过反应性氨基导入多个巯基的有效方式。卤乙酰基衍生物(例如碘乙酰胺)形成硫醚键，并且也是用于巯基修饰的试剂。其他有效的试剂是马来酰亚胺。马来酰亚胺与巯基反应性试剂的反应基本上和与碘乙酰胺的反应相同。马来酰亚胺在弱酸性至中性PH下快速的反应。
[0101]抗体中的另一类常见反应基是羧酸。蛋白质在C-末端位置上、在天冬氨酸和谷氨酸的侧链中含有羧酸基。羧酸在水中相对较低的反应性通常导致难以利用这类基团选择性的修饰蛋白质和其他生物分子。当进行修饰时，通常利用水溶性碳二亚胺将羧酸基转化为反应性酯，并且所述羧酸基与亲核试剂如胺、酰肼或肼反应。含胺的试剂应该是弱碱性的，从而在存在赖氨酸的更强碱性的ε -氨基的条件下，与活化的羧酸选择性反应，形成稳定的酰胺键。当PH升高到高于8.0时，可以发生蛋白质交联。
[0102]高碘酸钠可用于将与抗体相连的碳水化合物部分中的糖的醇部分氧化为醛。每个醛基可以与针对羧酸所述的胺、酰肼或肼反应。由于碳水化合物部分主要出现在抗体的可结晶片段(Fe)区中，可以通过定点修饰远离抗原结合位点的碳水化合物来实现缀合。形成希夫氏碱中间物，可以通过用氰硼氢化钠(温和的和选择性的)或硼氢化钠(强)水溶性还原剂还原中间物，将其还原成烷基胺。
[0103]术语“样品”包括但不限于来自活物或之前的活物的任意量的物质。这类活物包括但不限于人、小鼠、猴、大鼠、兔和其他动物。在一个实施方案中，样品获得自猴子尤其食蟹猴、或兔、或小鼠、或大鼠。在一个实施方案中，这类物质包括但不限于来自个体的全血、血清或血浆，这是临床常规中最普遍使用的样品源。
[0104]术语“固相”表示非液体的物质，包括由例如聚合物、金属(顺磁、铁磁颗粒)、玻璃和陶瓷的材料制成的颗粒(包括微粒和珠子)；凝胶物质，如硅石、矾土和聚合物凝胶；毛细管，可由聚合物、金属、玻璃和/或陶瓷制成；沸石和其他多孔物质；电极；微滴定板；固体条(stripe);和比色杯、试管或其他分光光度计的样品容器。固相组分与惰性固体表面的区别在于“固相”在其表面上含有至少一个部分预期与样品中的物质相互作用。固相可以是固定组分，如试管、条、比色杯或微滴定板，或者可以是不固定的组分，如珠子和微粒。可以使用多种允许蛋白质和其他物质非共价或共价连接的微粒。这类颗粒包括聚合物颗粒，如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸酯)；金粒，如金纳米颗粒和金胶体；以及陶瓷颗粒，如硅石、玻璃和金属氧化物颗粒。参见例如，Martin, C.R.等，Analytical Chemistry-News &Features, 70 (1998) 322A-327A,或 Butler, J.Ε.，Methods22 (2000) 4-23?
[0105]在一个实施方案中，从色素原(荧光或发光的基团和染料)、酶、NMR-活性基、金属颗粒或半抗原(如地高辛配基)中选择可检测的标记。可检测的标记还可以是可以光可激活的交联基团，例如，叠氮基或IH-氮杂环丙烯基。还在一个实施方案中，可以通过电化学发光检测的金属螯合物是发出信号的基团，特别优选的是钌螯合物，例如，钌(双吡啶)32+螯合物。合适的钌标记基团描述在例如EP O 580 979、WO 90/05301、WO 90/11511和WO 92/14138 中。
[0106]本文中报道了用于确定样品中的多特异性抗体的(游离)抗原的存在和/或量的方法，包括特异性结合多特异性抗体的一个结合特异性的固相固定的抗独特型抗体，该结合特异性不是多特异性抗体中特异性结合待确定的(游离)抗原的结合特异性，用于在确定(游离)抗原的量之前，从样品中耗尽复合形态的或非复合形态的多特异性抗体。
[0107]在一个实施方案中，通过抗原桥接免疫测定法，确定耗尽了多特异性抗体的样品中的抗原的存在和/或量。在一个实施方案中，免疫测定法包括捕获抗体和示踪抗体，其中捕获抗体与固相缀合，而示踪抗体与可检测的标记缀合。
[0108]在一个实施方案中，方法包括在确定游离的结合搭档的存在或量之前，从样品中耗尽单特异性结合物-多特异性结合物-复合物。
[0109] 本文报道的一个方面是用于确定样品中的多特异性抗体的抗原的存在和/或量的体外方法，其中待检测的抗原可以被多特异性抗体的第一结合特异性特异的结合，包括步骤:
[0110]-孵育包含抗原和多特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合多特异性抗体中不同于第一结合特异性的第二结合特异性，从而从样品中去除多特异性抗体。
[0111]本领域技术人员已知，由于平衡热力学，包含抗原和可以特异性结合抗原的抗体的样品包括游离抗原、结合抗体的抗原和游离抗体的混合物。
[0112]在一个实施方案中，方法包括下列步骤:
[0113]-孵育包含抗原和多特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合多特异性抗体中不同于第一结合特异性的第二结合特异性，从而形成抗独特型抗体-多特异性抗体复合物，和
[0114]-从样品中去除抗独特型抗体-多特异性抗体复合物。
[0115]在一个实施方案中，方法包括下列步骤:
[0116]-孵育包含抗原和多特异性抗体的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异的结合多特异性抗体中不同于第一结合特异性的第二结合特异性，从而形成抗独特型抗体-多特异性抗体复合物，
[0117]-从样品中去除抗独特型抗体-多特异性抗体复合物，和
[0118]-确定耗尽了多特异性抗体的样品中的抗原的量。
[0119]在一个实施方案中，方法包括步骤:
[0120]-在确定游离的结合搭档的的存在或量之前，从样品中耗尽单特异性结合物-多特异性结合物-复合物。
[0121]在一个实施方案中，方法包括步骤:
[0122]-孵育包含结合搭档和多特异性结合物的样品与单特异性结合物，所述单特异性结合物特异的结合多特异性抗体中不同于第一结合特异性的第二结合特异性，
[0123]-在确定游离的结合搭档的存在或量之前，从样品中耗尽单特异性结合物-多特异性结合物-复合物，和
[0124]-确定耗尽了多特异性结合物的样品中的结合搭档的量。
[0125]在一个实施方案中，通过抗原桥接免疫测定法，确定抗原的存在和/或量。
[0126]在一个实施方案中，确定抗原的存在和/或量是确定游离抗原的量。
[0127]在一个实施方案中，确定抗原的存在和/或量包括下列步骤:
[0128]-孵育耗尽了多特异性抗体的样品与特异性结合抗原的捕获抗体，形成捕获抗体-抗原复合物，和
[0129]-关联所形成的捕获抗体-抗原复合物的量与样品中的抗原的量。
[0130]在一个实施方案中，确定抗原的存在和/或量包括下列步骤:
[0131]-孵育耗尽了多特异性抗体的样品与特异性结合抗原的捕获抗体，形成捕获抗体-抗原复合物，
[0132]-孵育捕获抗体-抗原复合物与示踪抗体，其中捕获抗体和示踪抗体结合抗原上的不重叠的表位,和
[0133]-关联所形成的捕获抗体-抗原-示踪抗体复合物与样品中的抗原的量。[0134]在一个实施方案中，示踪抗体包括可检测的标记。
[0135]在一个实施方案中，确定抗原的存在和/或量包括下列步骤:
[0136]-孵育耗尽了多特异性抗体的样品与特异性结合抗原的捕获抗体，形成捕获抗体-抗原复合物，
[0137]-孵育捕获抗体-抗原复合物与示踪抗体，其中捕获抗体和示踪抗体结合抗原上的不重叠的表位，
[0138]-孵育捕获抗体-抗原-示踪抗体复合物与包含可检测的标记的检测抗体，其中检测抗体在示踪抗体的可变结构域之外的表位上特异性结合示踪抗体，和
[0139]-关联所形成的捕获抗体-游离抗原-示踪抗体复合物与样品中的抗原的量。
[0140]在一个实施方案中，捕获抗体和示踪抗体结合抗原上的不重叠的表位。
[0141]在一个实施方案中，抗独特型抗体和/或捕获抗体与固相缀合。
[0142]用于本文报道的方法中的抗独特型抗体和/或捕获抗体可以与固相缀合。在一个实施方案中，缀合是通过化学结合来实施的，所述化学结合经由N-末端和/或ε -氨基(赖氨酸)、不同赖氨酸的ε -氨基、抗体的氨基酸骨架的羧基_、巯基_、羟基-和/或酚-官能团，和/或抗体的碳水化合物结构的糖醇基。在一个实施方案中，抗独特型抗体和/或捕获抗体是至少两种与固相缀合的抗体的混合物，其中至少两种与固相缀合的抗体与固相缀合的位点不同。例如，至少两种与固相缀合的抗体的混合物可包括通过抗体的氨基酸骨架的氨基酸与固相缀合的抗体，和通过抗体的碳水化合物结构的糖醇基与固相缀合的抗体。此外，例如，至少两种与固相缀合的抗体的混合物可包括通过其氨基酸骨架的不同氨基酸残基与固相缀合的抗体。表述方式“不同的氨基酸残基”表示两种不同类型的氨基酸，如赖氨酸和天冬氨酸，或酪氨酸和谷氨酸，或氨基酸骨架中在抗体氨基酸序列中不同位置上的两个氨基酸残基。在后一种情况下，氨基酸可以是相同种类或不同种类的。表述方式“抗体位点不同”表示位点类型的不同，例如氨基酸或糖醇基，或(例如抗体与固相缀合的位置上)氨基酸骨架的氨基酸数不同。相同的应用也可以用于本文报道的方法中使用的示踪抗体。
[0143]在方法的一个实施方案中，免疫测定包括捕获抗体、示踪抗体和检测抗体，其中捕获抗体是针对通过链霉抗生物素与固相缀合的抗原的生物素化抗体，示踪抗体是针对与地高辛配基缀合的抗原的抗体，和检测抗体是针对与辣根过氧化物酶缀合的地高辛配基的抗体。
[0144]用于从包含抗原X和/或抗原Y的样品中耗尽由特异结合抗原X和抗原Y的双特异性抗体组成的复合物的一般方法(分别用于确定抗原X或抗原Y)，包括下列步骤:
[0145]-装配特异性结合抗原X和抗原Y的双特异性抗体(抗Χ/Υ抗体)的复合物:
[0146]室温孵育恒定浓度的抗原X与递增量的双特异性单克隆抗体I小时，所述抗体的第一结合特异性特异的结合抗原X，第二结合特异性特异的结合抗原Y(抗Χ/Υ抗体)。之后，使用该样品作为耗尽步骤中的阳性对照。
[0147]-耗尽步骤:
[0148]为了耗尽与抗Χ/Υ抗体结合的抗原X，将针对特异性结合抗原Y(抗-1d Y抗体-BI)的结合特异性的生物素化抗-独特型抗体与约?ο μ g/ml包被了磁性链霉抗生物素的珠子(SA-beads)结合。每个样品洗涤600 μ ISA-Beads，并用磁性分离器从上清液中分离。将600 μ I含有生物素化的抗-1d Y抗体的溶液与SA-Beads混合，室温孵育约I小时。通过用磁性分离器洗涤3次，去除过多的未结合的抗独特型抗体。然后，孵育包被了抗独特型抗体的珠子和约250 μ I含有抗Χ/Υ抗体与抗原X的复合物的样品。混合物在室温下孵育振荡约I小时。在孵育后，用磁性分离器分离样品与珠子。采集上清液用于在ELISA中分析“游离”抗原X(参见例如实施例2)。将剩余的珠子转移到ELECSYS容器中，根据标准的用户指导性操作规程(参见例如实施例3)，用ELECSYS2010分析仪分析与珠子结合的抗原X (结合双特异性抗体的抗原X)。
[0149]为了耗尽与抗Χ/Υ抗体结合的抗原Y，将针对特异性结合抗原Χ(抗-1d X抗体-BI)的结合特异性的生物素化抗-独特型抗体与约?ο μ g/ml包被了磁性链霉抗生物素的珠子(SA-beads)结合。每个样品洗涤600 μ ISA-Beads，并用磁性分离器从上清液中分离。将600 μ I含有生物素化的抗-1d X抗体的溶液与SA-Beads混合，室温孵育约I小时。通过用磁性分离器洗涤珠子3次，去除过多的未结合的抗独特型抗体。然后，孵育包被了抗独特型抗体的珠子和约250 μ I含有抗Χ/Υ抗体与抗原Y的复合物的样品。混合物在室温下孵育振荡约I小时。在孵育后，用磁性分离器分离样品与珠子。采集上清液用于在ELISA中分析“游离”抗原Y(参见例如实施例2)。将剩余的珠子转移到ELECSYS容器中，根据标准的用户指导性操作规程(参见例如实施例3)，用ELECSYS 2010分析仪分析与珠子结合的抗原Y(结合双特异性抗体的抗原Y)。
[0150]在一个实施方案中，抗独特型抗体具有105l/mol*s或更高的解离常数ka。在一个实施方案中，抗独特型抗体具有l*105l/mol*s或更高的解离常数。在一个实施方案中，抗独特型抗体还具有5*10_8mol/l或更低的Kd值。在一个实施方案中，抗独特型抗体还具有l*10_9mOl/l或更低的Kd值。
[0151]在一个实施方案中，在耗尽步骤中孵育约5分钟至约36小时。在一个实施方案中，在耗尽步骤中孵育约约15分钟至约30小时。 [0152]在一个实施方案中,将样品调节至多特异性抗体的浓度为约2 μ g/ml至约15 μ g/ml ο在一个实施方案中，将样品调节至多特异性抗体的浓度为约3 μ g/ml至约12 μ g/ml。
[0153]在一个实施方案中,将样品调节至总抗原浓度为约lpg/ml至约I μ g/ml。在一个实施方案中，将样品调节至总抗原浓度为约10pg/ml至约500ng/ml。在一个实施方案中，将样品调节至总抗原浓度为约100pg/ml至约250ng/ml。在一个实施方案中，将样品调节至总抗原浓度为约lng/ml至约100ng/ml。
[0154]在双特异性抗体针对ANG2和VEGF的情况下，作用机制是同时阻断用于与其相应受体结合的两种抗原。在缺少游离抗原(能够结合受体)的条件下，抑制信号通路。在游离抗原和抗体结合的抗原之间的差异是有利的。
[0155]提供下列实施例和附图以帮助理解本发明，但所附权利要求陈述了本发明的实际范围。应理解，在不脱离本发明精神的条件下，可以对所述方法进行修饰。
具体实施方案
[0156]1、用于体外确定结合搭档的存在和/或量的方法，所述结合搭档能够被多特异性结合物的第一结合特异性特异性地结合，其中在检测结合搭档之前，通过孵育样品和单特异性结合物，耗尽了与多特异性结合物结合的结合搭档，其中单特异性结合物特异性结合多特异性结合物的第二结合特异性。[0157]2、使用免疫测定，免疫学确定样品中的多特异性结合物的结合搭档的存在和/或量的方法，其中在确定结合搭档之前，从样品中耗尽多特异性结合物。
[0158]3、用于确定多特异性结合物的结合搭档的存在和/或量的体外方法，其中结合搭档能够被多特异性结合物的第一结合特异性特异性结合，包括步骤:
[0159]-孵育包含结合搭档和多特异性结合物的样品与单特异性结合物，所述单特异性结合物特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性结合物的第二结合特异性。
[0160]4、用于确定样品中的多特异性抗体的抗原的存在和/或量的体外方法，其中待检测的抗原能够被多特异性抗体的第一结合特异性特异性结合，包括步骤:
[0161]-孵育包含多特异性抗体、结合多特异性抗体的抗原和游离抗原的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性抗体的第二结合特异性。
[0162]5、根据条目3至4的任一项的方法，其特征是还包括以下步骤作为第二步:
[0163]-在确定游离的结合搭档的存在和/或量之前，从样品中耗尽单特异性结合物-多特异性结合物-复合物。
[0164]6、根据条目3至5的任一项的方法，其特征是包括以下步骤作为最终步骤:
[0165]-确定耗尽多特异性结合物的样品中的结合搭档的量。
[0166]7、根据条目2至6的任一项的方法，其特征是包括以下步骤:
[0167]-孵育包含结合搭档和多特异性结合物的样品与单特异性结合物，所述单特异性结合物特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性结合物的第二结合特异性，
[0168]-在确定游离的结合搭档的存在或量之前，从样品中耗尽单特异性结合物-多特异性结合物-复合物，和
[0169]-确定耗尽多特异性结合物的样品中的结合搭档的量。
[0170]8、根据条目I至7的任一项的方法，其特征是结合搭档选自抗原、靶和被分析物。
[0171]9、根据条目I至8的任一项的方法，其特征是结合搭档是未复合的结合搭档或游离的结合搭档。
[0172]10、根据条目I至9的任一项的方法，其特征是结合特异性是结合位点或一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。
[0173]11、根据条目I至10的任一项的方法，其特征是多特异性结合物选自抗体、包含抗体或抗体片段和非抗体多肽的融合多肽、包含抗体或抗体片段和可溶性受体的融合多肽，或包含抗体或抗体片段和肽类结合分子的融合多肽。
[0174]12、根据条目I至11的任一项的方法，其特征是多特异性结合物是抗体。
[0175]13、根据条目8至12的任一项的方法，其特征是确定抗原的存在和/或量，包括以下步骤:
[0176]-孵育耗尽了多特异性抗体的样品与捕获抗体，从而形成捕获抗体-抗原复合物，所述捕获抗体特异性结合抗原，和
[0177]-关联所形成的捕获抗体-抗原复合物与样品中的抗原的量。
[0178]14、根据条目8至13的任一项的方法，其特征是确定抗原的量，包括以下步骤:
[0179]-孵育耗尽了多特异性抗体的样品与捕获抗体，从而形成捕获抗体-抗原复合物，所述捕获抗体特异性结合抗原，[0180]-孵育捕获抗体-抗原复合物与示踪抗体，其中捕获抗体和示踪抗体结合抗原上的不重叠表位，和
[0181]-关联所形成的捕获抗体-抗原-示踪抗体复合物与样品中的抗原的量。
[0182]15、根据条目8至14的任一项的方法，其特征是确定抗原的量，包括以下步骤:
[0183]-孵育耗尽了多特异性抗体的样品与捕获抗体，从而形成捕获抗体-抗原复合物，所述捕获抗体特异性结合抗原，
[0184]-孵育捕获抗体-抗原复合物与示踪抗体，其中捕获抗体和示踪抗体结合抗原上的不重叠表位，
[0185]-孵育捕获抗体-抗原-示踪抗体复合物与包含可检测的标记的检测抗体，其中检测抗体在示踪抗体的可变结构域外的表位上特异性地结合示踪抗体，和
[0186]-关联所形成的捕获抗体-抗原-示踪抗体复合物与样品中的抗原的量。
[0187]16、根据条目11至15的任一项的方法，其特征是抗体是双特异性抗体、或三特异性抗体、或四特异性抗体、或五特异性抗体、或六特异性抗体。
[0188]17、根据条目11至16的任一项的方法，其特征是抗体是双特异性抗体。
[0189]18、根据条目11至17的任一项的方法，其特征是抗体是具有第一结合特异性和具有第二结合特异性的双特异性抗体，所述第一结合特异性特异性结合第一抗原或抗原上的第一表位，所述第二结合特异性特异性结合第二抗原或抗原上的第二表位。
[0190]19、根据条目I至18的任一项的方法，其特征是单特异性结合物是抗独特型抗体。
[0191]20、根据条目19的方法，其特征是方法包括以下步骤:
[0192]-孵育包含多特异性抗体、结合多特异性抗体的抗原和游离抗原的样品与抗独特型抗体，从而形成抗独特型抗体-多特异性抗体复合物，所述抗独特型抗体特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性抗体的第二结合特异性，和
[0193]-从样品中去除抗独特型抗体-多特异性抗体复合物。
[0194]21、根据条目19至20的任一项的方法，其特征是方法包括以下步骤:
[0195]-孵育包含抗原和多特异性抗体的样品与抗独特型抗体，从而形成抗独特型抗体-多特异性抗体复合物，所述抗独特型抗体特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性抗体的第二结合特异性，
[0196]-从样品中去除抗独特型抗体-多特异性抗体复合物，和
[0197]-确定耗尽了多特异性抗体的样品中的抗原的量。
[0198]22、根据条目20至21的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体-多特异性抗体复合物是抗独特型抗体-多特异性抗体复合物和抗独特型抗体-多特异性抗体-抗原复合物的混合物。
[0199]23、根据条目19至22的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体对于多特异性抗体的第二结合特异性具有105l/mol*s或更高的解离常数ka。
[0200]24、根据条目19至23的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体对于与多特异性抗体的第二结合特异性的结合具有5*10_8mol/l或更低的Kd值。
[0201]25、根据条目19至24的任一项的方法，其特征是与抗独特型抗体孵育约10分钟至约36小时。
[0202]26、根据条目I至25的任一项的方法，其特征是调整样品至多特异性抗体浓度为约 2 μ g/ml 至约 15 μ g/ml。
[0203]27、根据条目I至26的任一项的方法，其特征是调整样品至总抗原浓度为约Ing/ml 至约 250ng/ml。
[0204]28、根据条目19至27的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体与固相结合或缀
口 O
[0205]29、根据条目19至28的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体通过特定的结合对缀合(固定)。
[0206]30、根据条目29的方法，其特征是结合对(第一组分/第二组分)选自链霉抗生物素或抗生物素蛋白/生物素、抗体/抗原、凝集素/多糖、类固醇/类固醇结合蛋白、激素/激素受体、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G。
[0207]31、根据条目29至30的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体与生物素缀合，且通过固定的抗生物素蛋白或链霉抗生物素实施固定。
[0208]32、根据条目19至31的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体是生物素化的，且固相包被了链霉抗生物素。
[0209]33、根据条目19至31的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体是针对多特异性结合物的生物素化的抗独特型抗体，且通过链霉抗生物素与固相缀合。
[0210]34、根据条目28至33的任一项的方法，其特征是固相是包被了链霉抗生物素的顺磁珠或包被了链霉抗生物素的琼脂糖珠。
[0211]35、根据条目19至34的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体是包含至少两种抗独特型抗体的混合物，所述抗独特型抗体在它们与固相缀合的抗体位点上不同。
[0212]36、根据条目19至35的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体混合物包含通过至少两种不同的氨基与固相缀合的抗独特型抗体。
[0213]37、根据条目28至36的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体与其缀合搭档的缀合是通过化学结合实施的，所述化学结合经由N-末端和/或ε-氨基(赖氨酸)和/或不同赖氨酸的ε -氨基、药物抗体的氨基酸骨架的羧基_、巯基_、羟基-和/或酚-官能团，和/或药物抗体的碳水化合物结构的糖醇基。
[0214]38、根据条目28至37的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体通过被动吸附与固
相缀合。
[0215]39、根据条目I至38的任一项的方法，其特征是样品包含多特异性抗体、游离抗原和多特异性抗体-抗原复合物，且检测是检测多特异性抗体的游离抗原。
[0216]40、特异性结合多特异性抗体的第一结合特异性的抗独特型抗体的用途，用于从样品中耗尽与多特异性抗体的第二结合特异性结合的抗原。
[0217]附图描沭
[0218]图1结合药物的靶(与双特异性抗体结合的抗原)与游离靶(游离抗原)之间的平衡。
[0219]图2使用针对双特异性抗体的ANG2结合特异性的抗独特型抗体，耗尽与双特异性抗ANG2/VEGF抗体结合的VEGF ;将针对双特异性抗体的ANG2结合特异性的生物素化抗独特型抗体固定在包被了链霉抗生物素的磁珠上；在孵育这些磁珠和样品(例如血清样品)后，双特异性抗ANG2/VEGF抗体被固定的抗独特型抗体结合和耗尽；共-耗尽与双特异性抗体结合的VEGF ;游离VEGF (未与双特异性抗体结合)仍然保留在血清样品的上清液中。
[0220]图3用于检测VEGF的夹心ELISA:固定的抗VEGF抗体结合VEGF，另一种标记的抗VEGF抗体允许检测结合的VEGF ;测定用于检测耗尽后的样品上清液中的“游离"VEGF ;为了检测c-MET，应用使用了两种抗c-MET抗体的相同测定模式。
[0221]图4在免疫耗尽之前和之后的C-MET水平:用特异性结合双特异性抗体的HER3结合特异性的抗独特型抗体，耗尽含有50ng/ml c-MET和递增量的双特异性抗HER3/c_MET抗体的样品中的双特异性抗体；示意图显示了 ELISA确定的耗尽前后的c-MET浓度；c_MET的水平在耗尽前相似，不依赖于双特异性抗体的量；通过耗尽，去除了与双特异性抗体结合的c-MET (结合药物的靶)；耗尽后检测到的c-MET (游离c-MET)浓度在存在2微克/ml双特异性抗体时是约lng/ml，。
[0222]图5比较若干用于免疫耗尽的抗独特型抗体:使用4种特异性结合双特异性抗体的HER3结合特异性的抗独特型抗体，耗尽“结合”双特异性抗体的c-MET ;如图4所述进行实验；用抗体M2.11.125的耗尽比其他3种抗独特型抗体效率低。
[0223]图6耗尽后的缓冲液和血清样品的上清液中的VEGF的量:用特异性结合双特异性抗体的ANG2结合特异性的抗独特型抗体，耗尽含有50ng/ml VEGF和递增量的双特异性抗ANG2/VEGF抗体的缓冲液和血清样品；通过ELISA测量免疫耗尽前后的VEGF浓度(图3);对血清/血浆中的结合药物的靶的耗尽与对测定缓冲液中的效率类似；在耗尽前的双特异性抗体浓度依赖性信号过程是由于测定模式，以及测定使用的多特异性结合物和抗VEGF抗体之一特异性结合的VEGF上的表位重叠造成的。
[0224]图7在免疫耗尽后，用固定在链霉抗生物素珠子上的抗独特型抗体检测结合药物的靶:将分离的磁珠转移到ELECSYS2010分析仪中；用钌标记的抗VEGF抗体检测珠子结合的抗独特型抗体/双特异性抗体/VEGF-复合物中的VEGF。
[0225]实施例
[0226]实施例1
[0227]耗尽结合药物的靶(结合抗体的抗原)-在双特异性药物分子的情况下
[0228]从样品中耗尽杭ANG2/VEGF杭体-VEGF复合物
[0229]A)装配杭ANG2/VEGF杭体和VEGF的复合物
[0230]将恒定浓度的VEGF与递增量的双特异性抗体在室温孵育I小时，所述双特异性抗体以第一结合特异性特异性结合ANG2，且以第二结合特异性特异性结合VEGF (抗ANG2/VEGF抗体)。然后，使用这些样品作为阳性对照用于耗尽步骤或用在耗尽步骤中。
[0231]B)耗尽步骤
[0232]为了耗尽与抗ANG2/VEGF抗体结合的VEGF，将针对这样的结合特异性的生物素化抗独特型抗体与10 μ g/ml包被了磁性链霉抗生物素的珠子(SAbeads)结合,所述结合特异性特异的结合ANG2 (抗-1d ANG2抗体-BI)。每个样品洗涤600 μ ISA-Beads,并用磁性分离器从上清液中分离。将约600 μ I含有抗id ANG2抗体的溶液与SA-Beads混合，室温孵育I小时。通过用磁性分离器洗涤珠子3次，去除过多的未结合的抗体。然后，孵育包被了抗体的珠子和250 μ I含有抗ANG2/VEGF抗体和VEGF的复合物的样品。样品在室温下孵育振荡I小时。在孵育后，用磁性分离器分离样品与珠子。采集上清液，用于使用ELISA分析“游离"VEGF(参见实施例2)。将剩余的珠子转移到ELECSYS容器中，根据生产商的说明，用ELECSYS2010分析仪分析与珠子结合的VEGF (结合了抗-ANG2/VEGF抗体的VEGF)(参见实施例3)。
[0233]使用两种不同的针对ANG2结合特异性的抗独特型抗体耗尽VEGF(也参见实施例5):
[0234]i)多克隆抗 id ANG2 抗体 Rb-1gG-BI，
[0235]ii)单克隆抗 id ANG2 抗体 M-2.3.55-BI。
[0236]从样品中耗尽杭HER3/c-MET杭体_c_MET复合物
[0237]A)装配抗HER3/C-MET抗体和c_MET的复合物
[0238]将恒定浓度的c-MET与递增量的双特异性抗体在室温孵育I小时，所述双特异性抗体以第一结合特异性特异性结合HER3，并且以第二结合特异性特异性结合c-MET (抗-HER3/C-MET抗体)。然后，用珠子处理该样品，用于耗尽抗HER3/C_Met抗体-c-MET复合物。
[0239]B)耗尽步骤
[0240]为了耗尽与抗HER3/C-MET抗体结合的c_MET，将针对这样的结合特异性的生物素化抗独特型抗体与约10 μ g/ml包被了磁性链霉抗生物素的珠子(SAbeads)结合,所述结合特异性特异的结合HER3 (抗-1d HER3抗体-BI)。每个样品洗涤600 μ ISA-Beads,并用磁性分离器从上清液中分离。将约600 μ I含有抗id HER3抗体Ml.1.10-BI的溶液与SA-Beads混合，室温孵育I小时。通过用磁性分离器洗涤珠子3次，去除过多的未结合的抗体。然后，孵育包被了抗体的珠子和250 μ I含有抗HER3/C-MET抗体和c-MET的复合物的样品。样品在室温下孵育振荡I小时。在孵育后，用磁性分离器分离样品与珠子。采集上清液，用于在ELISA中分析“游离” c-MET。
[0241]评估了 4种针对HER3结合特异性的抗独特型抗体耗尽结合了抗HER3/c_MET抗体的c-MET (还参见实施例4):
[0242]i)单克隆抗 id HER3 抗体 M-1.1.1O-1gG,
[0243]ii)单克隆抗 id HER3 抗体 M-2.11.123-1gG，
[0244]iii)单克隆抗 id HER3 抗体 M-2.5.45-1gG，
[0245]iv)单克隆抗 id HER3 抗体 M-2.9.55-1gG。
[0246]实施例2
[0247]酶联免疫吸附测定
[0248]用于检测VEGF的ELISA
[0249]根据生产商的说明(R+D Systems Cat#DVE00)使用可商购的夹心免疫测定法。
[0250]将耗尽步骤(参见实施例1)的上清液样品稀释10倍，并添加到预包被的显微平板(R+D Systems)的孔中。包含在样品中的游离VEGF被包被在显微平板的孔上的抗VEGF抗体结合。在室温孵育2小时后，洗涤平板3次，去除未结合的样品。然后，向孔中加入多克隆连接了 HRP的抗VEGF抗体(连接辣根过氧化物酶的抗VEGF抗体)，并在室温再孵育2小时。再次洗涤步骤后，向孔中加入TMB底物溶液。在测量前，通过添加硫酸终止显色反应(参见图3)。
[0251]用于检测c-MET 的 ELISA
[0252]使用可商购的夹心免疫测定(R+D Systems Cat#DY358)。[0253]在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，将小鼠单克隆抗c-MET抗体稀释至约180 μ g/ml的工作浓度。将约100 μ I的该溶液移液到Nunc Maxisorb平板的每个孔中，室温孵育I小时。在用捕获抗体包被平板的孔之后，用补充了 0.05% (w/v) Tween的PBS洗涤平板3次，并用包含1% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS室温封闭I小时。在添加样品前，用PBS洗涤平板3次。
[0254]将来自c-MET耗尽步骤的上清液(参见实施例1)稀释10倍。将约100 μ I每个样品的稀释液和一系列稀释的校正标准移液到已包被和封闭的显微平板的2个孔的每个中，室温孵育I小时。
[0255]在孵育后，洗涤平板3次，去除未结合的样品。然后，向孔中加入多克隆的连接了生物素的抗c-MET抗体，并在室温再孵育2小时。再次洗涤步骤后，将链霉抗生物素-HRP缀合物(R+D systems)稀释200倍，将100 μ I该溶液移液到显微平板的每个孔中，室温孵育I小时。在另一个洗涤步骤后，向孔中加入TMB底物溶液，在测量前，通过添加硫酸终止显色反应(参见图4)。
[0256]实施例3
[0257]用于检测抗原X和抗Χ/Υ抗体的结合复合物的ELECSYS
[0258]洗涤用于耗尽步骤中的珠子(参见实施例1)，并用磁性分离器在ELECSYS测定缓冲液中分离3次，去除未结合的物质。将来自每个样品的珠子溶解在600 μ I ELECSYS测定缓冲液中，采集用于分析。
[0259]简而言之,用10 μ I缓冲液和20 μ I钌标记的针对抗原X的抗体(15 μ g/ml)孵育170 μ I珠子15分钟。检测与固定在SA-Beads上的抗原X-抗Χ/Υ抗体-抗独特型抗体复合物结合的钌标记的抗体(参见例如Stockmann,W.等,Wien.Klin.Wochenschr.110(1998)Supp1.3:10-21 ；Forest, J.C.等，Clin.B1chem.31(1998)81-88)。
[0260]实施例4
[0261]评估抗独特型抗体作为耗尽工具
[0262]根据实施例1描述的方法，使用具有不同动力学常数的不同抗独特型抗体用于耗尽抗HER3/C-MET抗体及其复合物。
[0263]通过表面等离振子共振，评估抗独特型抗体与抗HER3/C-MET抗体的HER3结合特异性特异性结合的动力学常数
[0264]用使用CM5芯片的BIAcore? τιοο仪器实施所有的测量。通过标准的胺偶联实现芯片包被。除非另外指出，在25°C下，在HBS缓冲液(HEPES，NaCl，pH7.4)中实施所有的孵育。在CM5芯片的一个流动室中，通过胺偶联固定饱和量的多克隆山羊抗小鼠Fc-Y抗体。之后，以30 μ 1/min的流速，注射不同的针对抗HER3/c_MET抗体结合特异性的单克隆小鼠抗体(特异的结合HER3)60秒，所述单克隆小鼠抗体被抗小鼠Fe抗体结合。在HBS缓冲液中稀释所有的动物血清。通过以30 μ 1/min的流速，注射抗HER3/c_MET抗体60秒，分
析结合(联结)。通过用HBS缓冲液洗涤芯片表面180秒，测量解离。使用BIAcore?的BIAevaluat1n软件,用1:1Langmuir拟合模型计算解离常数值(=ka ；kd ；KD)。
[0265]表:通过SPR-分析确定的针对抗HER3/C-MET抗体的HER3结合特异性的各抗独特
型抗体结合的动力学参数。
[0266]
【权利要求】
1.用于体外确定结合搭档的存在和/或量的方法，所述结合搭档能够被多特异性结合物的第一结合特异性特异性地结合，其中在检测结合搭档之前，通过孵育样品和单特异性结合物，耗尽了与多特异性结合物结合的结合搭档，其中单特异性结合物特异性结合多特异性结合物的第二结合特异性。
2.使用免疫测定，免疫学确定样品中的多特异性结合物的结合搭档的存在和/或量的方法，其中在确定结合搭档之前，从样品中耗尽多特异性结合物。
3.用于确定多特异性结合物的结合搭档的存在和/或量的体外方法，其中结合搭档能够被多特异性结合物的第一结合特异性特异性结合，包括步骤: -孵育包含结合搭档和多特异性结合物的样品与单特异性结合物，所述单特异性结合物特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性结合物的第二结合特异性。
4.用于确定样品中的多特异性抗体的抗原的存在和/或量的体外方法，其中待检测的抗原能够被多特异性抗体的第一结合特异性特异性结合，包括步骤: -孵育包含多特异性抗体、结合多特异性抗体的抗原和游离抗原的样品与抗独特型抗体，所述抗独特型抗体特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性抗体的第二结合特异性。
5.根据权利要求3至4的任一项的方法，其特征是还包括以下步骤作为第二步: -在确定游离的结合搭档的存在和/或量之前，从样品中耗尽单特异性结合物-多特异性结合物-复合物。
6.根据权利要求3至5的任一项的方法，其特征是包括以下步骤作为最终步骤: -确定耗尽多特异性结合物的样品中的结合搭档的量。
7.根据权利要求2至6的任一项的方法，其特征是包括以下步骤: -孵育包含结合搭档和多特异性结合物的样品与单特异性结合物，所述单特异性结合物特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性结合物的第二结合特异性， -在确定游离的结合搭档的存在或量之前，从样品中耗尽单特异性结合物-多特异性结合物-复合物，和 -确定耗尽多特异性结合物的样品中的结合搭档的量。
8.根据权利要求1至7的任一项的方法，其特征是结合搭档选自抗原、靶和被分析物。
9.根据权利要求1至8的任一项的方法，其特征是结合搭档是未复合的结合搭档或游离的结合搭档。
10.根据权利要求1至9的任一项的方法，其特征是结合特异性是结合位点或一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。
11.根据权利要求1至10的任一项的方法，其特征是多特异性结合物选自抗体、包含抗体或抗体片段和非抗体多肽的融合多肽、包含抗体或抗体片段和可溶性受体的融合多肽，或包含抗体或抗体片段和肽类结合分子的融合多肽。
12.根据权利要求1至11的任一项的方法，其特征是多特异性结合物是抗体。
13.根据权利要求8至12的任一项的方法，其特征是确定抗原的存在和/或量，包括以下步骤: -孵育耗尽了多特异性抗体的样品与捕获抗体，从而形成捕获抗体-抗原复合物，所述捕获抗体特异性结合抗原，和-关联所形成的捕获抗体-抗原复合物与样品中的抗原的量。
14.根据权利要求8至13的任一项的方法，其特征是确定抗原的量，包括以下步骤: -孵育耗尽了多特异性抗体的样品与捕获抗体，从而形成捕获抗体-抗原复合物，所述捕获抗体特异性结合抗原， -孵育捕获抗体-抗原复合物与示踪抗体，其中捕获抗体和示踪抗体结合抗原上的不重叠表位，和 -关联所形成的捕获抗体-抗原-示踪抗体复合物与样品中的抗原的量。
15.根据权利要求8至14的任一项的方法，其特征是确定抗原的量，包括以下步骤: -孵育耗尽了多特异性抗体的样品与捕获抗体，从而形成捕获抗体-抗原复合物，所述捕获抗体特异性结合抗原， -孵育捕获抗体-抗原复合物与示踪 抗体，其中捕获抗体和示踪抗体结合抗原上的不重叠表位， -孵育捕获抗体-抗原-示踪抗体复合物与包含可检测的标记的检测抗体，其中检测抗体在示踪抗体的可变结构域外的表位上特异性地结合示踪抗体，和 -关联所形成的捕获抗体-抗原-示踪抗体复合物与样品中的抗原的量。
16.根据权利要求11至15的任一项的方法，其特征是抗体是双特异性抗体、或三特异性抗体、或四特异性抗体、或五特异性抗体、或六特异性抗体。
17.根据权利要求11至16的任一项的方法，其特征是抗体是双特异性抗体。
18.根据权利要求11至17的任一项的方法，其特征是抗体是具有第一结合特异性和具有第二结合特异性的双特异性抗体，所述第一结合特异性特异性结合第一抗原或抗原上的第一表位，所述第二结合特异性特异性结合第二抗原或抗原上的第二表位。
19.根据权利要求1至18的任一项的方法，其特征是单特异性结合物是抗独特型抗体。
20.根据权利要求19的方法，其特征是方法包括以下步骤: -孵育包含多特异性抗体、结合多特异性抗体的抗原和游离抗原的样品与抗独特型抗体，从而形成抗独特型抗体-多特异性抗体复合物，所述抗独特型抗体特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性抗体的第二结合特异性，和-从样品中去除抗独特型抗体-多特异性抗体复合物。
21.根据权利要求19至20的任一项的方法，其特征是方法包括以下步骤: -孵育包含抗原和多特异性抗体的样品与抗独特型抗体，从而形成抗独特型抗体-多特异性抗体复合物，所述抗独特型抗体特异性结合不同于第一结合特异性的多特异性抗体的第二结合特异性， -从样品中去除抗独特型抗体-多特异性抗体复合物，和 -确定耗尽了多特异性抗体的样品中的抗原的量。
22.根据权利要求20至21的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体-多特异性抗体复合物是抗独特型抗体-多特异性抗体复合物和抗独特型抗体-多特异性抗体-抗原复合物的混合物。
23.根据权利要求19至22的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体对于多特异性抗体的第二结合特异性具有105l/mol*s或更高的解离常数ka。
24.根据权利要求19至23的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体对于与多特异性抗体的第二结合特异性的结合具有5*10_8mol/l或更低的Kd值。
25.根据权利要求19至24的任一项的方法，其特征是与抗独特型抗体孵育约10分钟至约36小时。
26.根据权利要求1至25的任一项的方法，其特征是调整样品至多特异性抗体浓度为约 2 μ g/ml 至约 15 μ g/ml。
27.根据权利要求1至26的任一项的方法，其特征是调整样品至总抗原浓度为约Ing/ml 至约 250ng/ml。
28.根据权利要求19至27的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体与固相结合或缀合。
29.根据权利要求19至28的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体通过特定的结合对缀合(固定)。
30.根据权利要求29的方法，其特征是结合对(第一组分/第二组分)选自链霉抗生物素或抗生物素蛋白/生物素、抗体/抗原、凝集素/多糖、类固醇/类固醇结合蛋白、激素/激素受体、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G。
31.根据权利要求29至30的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体与生物素缀合，且通过固定的抗生物素蛋白或链霉抗生物素实施固定。
32.根据权利要求19至31的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体是生物素化的，且固相包被了链霉抗生物素。
33.根据权利要求19至31的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体是针对多特异性结合物的生物素化的抗独特型抗体，且通过链霉抗生物素与固相缀合。
34.根据权利要求28至33的任一项的方法，其特征是固相是包被了链霉抗生物素的顺磁珠或包被了链霉抗生物素的琼脂糖珠。
35.根据权利要求19至34的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体是包含至少两种抗独特型抗体的混合物，所述抗独特型抗体在它们与固相缀合的抗体位点上不同。
36.根据权利要求19至35的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体混合物包含通过至少两种不同的氨基与固相缀合的抗独特型抗体。
37.根据权利要求28至36的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体与其缀合搭档的缀合是通过化学结合实施的，所述化学结合经由N-末端和/或ε-氨基(赖氨酸)和/或不同赖氨酸的ε -氨基、药物抗体的氨基酸骨架的羧基_、巯基_、羟基-和/或酚-官能团，和/或药物抗体的碳水化合物结构的糖醇基。
38.根据权利要求28至37的任一项的方法，其特征是抗独特型抗体通过被动吸附与固相缀合。
39.根据权利要求1至38的任一项的方法，其特征是样品包含多特异性抗体、游离抗原和多特异性抗体-抗原复合物，且检测是检测多特异性抗体的游离抗原。
40.特异性结合多特异性抗体的第一结合特异性的抗独特型抗体的用途，用于从样品中耗尽与多特异性抗体的第二结合特异性结合的抗原。
【文档编号】G01N33/543GK104040350SQ201280063032
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年12月18日 优先权日:2011年12月19日
【发明者】K-G·施图本拉赫, U·韦塞尔斯 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司