利用丝网印刷的多重诊断膜传感器的制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用丝网印刷来形成多通道的多重诊断膜传感器的制造方法，更加详细地涉及一种在膜上以丝网印刷方式印刷疏水性油墨来形成多通道，从而可实现多重诊断的膜传感器的制造方法。本发明的膜传感器能够以简单的方法在膜上形成多个通道，从而能够实现传感器的大量生产，并能够确保检测的可靠性。
【专利说明】利用丝网印刷的多重诊断膜传感器的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用丝网印刷来形成多通道的多重诊断膜传感器的制造方法，更详细地涉及一种在膜上以丝网印刷方式印刷疏水性油墨来形成多通道，从而可实现多重诊断的膜传感器的制造方法。
【背景技术】
[0002]条诊传感器从1976年使用妊娠诊断试剂盒开始被广泛利用，至今作为早期诊断多种疾病的技术广泛使用。最广泛利用的条传感器应用利用硝酸纤维素膜的免疫色谱法，具有能够容易大量生产、使用方便、制造成本低的优点。众所周知，一般，诊断生物传感器除了灵敏度和再现性以外，为了实现使用化，以制造成本、生产效率及容易的测定方法等为重要因素。与此同时，通过一次测定来可同时诊断多种疾病的技术的必要性也逐渐受到关注。因此，研究在广泛使用于诊断生物传感器的膜上容易印刷多种图案来制造的方法的情况下，能够实现在包括横向流动分析(LFA, lateral flow assay)的多种诊断生物传感器中可进行多重诊断的条传感器的大量生产。
[0003]近来，在纸或膜上利用蜡、石蜡等来印刷微流体通道等的方式制造传感器的技术研究正在活跃进行中(Diagnostics for the Developing World:MicrofluidicPaper-Based Analytical Devices, Anal.Chem., 2010, 82(I), pp3-10;Inkjet-printedmicrofluidic multianalyte chemical sensing paper,Anal.Chem., 2008, 80, pp6928-6934;FLASH:A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices, LabChip, 2008，8，pp2146_2150;Simple telemedicine for developing regions:Cameraphones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-sitediagnosis, Anal.Chem., 2008, 80, 3699-3707;Fabrication and characterizationof paper-based microfluidics prepared in nitrocellulose membrane by waxprinting, Anal.Chem., 2010, 82, pp329_335)。
[0004]如上所述的微流体通道传感器具有使用简单、成本低、可实现大量生产的优点，但存在随着使用喷墨印刷技术而需要对使用的油墨的组合物进行最优化的难点。
[0005]因此，如果将微流体通道制造技术应用于条传感器来制造多通道的方法容易并简单地实现大量生产，则能够制造以低廉的价格容易进行测定的多通道条传感器。
【发明内容】
[0006]技术问题
[0007]本发明为从这种背景导出的，其目的在于，提供一种通过对膜进行丝网印刷来能够实现大量生产的多重诊断膜传感器的制造方法。
[0008]解决问题的手段
[0009]为了解决上述问题，本发明提供一种多通道膜传感器的制造方法，该多通道膜传感器的制造方法包括在能够使疏水性试样流动的膜上，以丝网印刷(Screen Printing)方式印刷疏水性油墨来形成多通道的步骤。
[0010]一实施例的制造方法，其特征在于，上述膜包含硝酸纤维素、尼龙、聚砜、聚醚砜及聚偏氟乙烯(PVDF, Polyvinylidene fluoride)中的一种以上。
[0011]一实施例的制造方法，其特征在于，上述疏水性油墨使用选自银浆、碳浆、钼浆、陶瓷浆及蜡中的一种以上，包含选自碳原子数I?6的乙醇、二甲基甲酰胺(DMF，Dimethylformamide)、二甲基亚讽(DMSO, Dimethyl sulfoxide)及丙酮中的一种或两种以上的有机溶剂。
[0012]并且，本发明提供一种利用横向流动(lateral flow)的膜传感器，其包括多通道，上述多通道是在膜表面上以丝网印刷方式印刷疏水性油墨而形成的。
[0013]一实施例的膜传感器，其特征在于，在膜上包含样品垫、接合垫及吸收垫。
[0014]一实施例的膜传感器，其特征在于，上述样品垫或吸收垫包含选自纤维素、聚酯、聚丙烯及玻璃纤维中的一种以上。
[0015]一实施例的膜传感器，其特征在于，上述接合垫包含选自纤维素、聚酯、聚丙烯、玻璃纤维、硝酸纤维素、尼龙、聚砜、聚醚砜及聚偏氟乙烯(PVDF, Polyvinylidene fluoride)中的一种以上。
[0016]一实施例的膜传感器，其特征在于，上述信号产生物质为金属纳米粒子、量子点(quantum dot)、纳米粒子、磁性纳米粒子、酶、酶底物、酶反应生成物质、吸光物质、荧光物质或发光物质。
[0017]并且，本发明提供一种在上述膜传感器中注入试样来检测分析对象物质的生物体试样的分析方法。
[0018]一实施例的检测方法，其特征在于，包括在上述膜传感器的多通道之间测定电化学信号的步骤。
[0019]发明的效果
[0020]本发明的膜传感器能够用简单的方法在膜上形成多个通道，由此能够实现传感器的大量生产，并能够确保检测的可靠性。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为示出利用本发明的丝网印刷在膜上形成多通道的过程的图。
[0022]图2为表示根据本发明一实施例的膜传感器的结构的图。
[0023]图3为根据实施例1?实施例3，在经过丝网印刷的膜上注入磷酸盐缓冲(PBS，Phosphate Buffered Saline)溶液的情况下,确认向图案周围流动的现象的照片(实施例1:无乙醇，实施例2:乙醇5重量％，实施例3:乙醇10重量％)。
[0024]图4为表示实施例4中根据C反应蛋白(CRP,C_reactive protin)抗原浓度的感测结果的照片。
[0025]图5为在实施例4中根据不同的浓度检测并比较各个通道的吸光度的图表。
[0026]图6为表示在实施例5的经过丝网印刷的膜传感器中用于测定电化学发光信号的传感器的示意图及照片。
[0027]图7为实施例5中测定基于施加电压的化学发光信号的照片。
[0028]图8为实施例5中根据不同时间测定基于施加电压的电流变化来进行比较的图表。
[0029]附图标记的说明
[0030]10:膜11:样品垫
[0031]12:接合垫13:吸收垫
[0032]14:下部基板
[0033]15:抗-C反应蛋白多克隆抗体
[0034]16:抗-小鼠免疫球蛋白G
[0035]20:疏水性油墨
[0036]30:石蜡油墨
【具体实施方式】[0037]本发明涉及一种多通道膜传感器的制造方法，其特征在于，利用丝网印刷(ScreenPrinting)方法来在膜上形成多通道。
[0038]图1为示出本发明一实施例的多通道膜传感器的工序的图。
[0039]首先，膜10包含执行移送生物体试样的通道作用，并且可确认所需的化学、生物学反应结果的可横向流动的膜形态的所有材质。更加优选的是，使用选自硝酸纤维素、尼龙、聚砜、聚醚砜及聚偏氟乙烯(PVDF, Polyvinylidene fluoride)中的材质的膜,但不局限于此，本发明所属【技术领域】技术人员在液体试样的可横向流动的材质中可进行适当的选择。
[0040]在上述膜上，利用丝网印刷方法来印刷疏水性油墨20。上述丝网印刷可适用为本领域中公知的方法，作为一例，执行上述丝网印刷的印刷机可由形成有构成规定图案的开口部的微小网孔、用于涂敷疏水性油墨的橡胶滚轴(squeegee)以及在上述掩膜的下部支撑膜的台面模块(stage module)构成。经过丝网印刷的油墨以5~10 μ m的厚度涂敷于膜上，使涂敷的油墨通过膜的气孔而部分沉着。
[0041]上述疏水性油墨只要是不与注入试样混合而起到引导试样的流动的通道作用的成分，则其种类不受限制，但是，优选地使用银浆、碳浆、钼浆、陶瓷浆、蜡等，最优选地使用银浆。
[0042]如果通过上述丝网印刷来印刷成所需的形态之后进行干燥，则能够形成可供试样移动的多通道。
[0043]并且，优选的是，上述疏水性油墨还包含有机溶剂，但是，由于膜具有溶解于有机溶剂的性质，因此，在疏水性油墨与适当的有机溶剂一同印刷的情况下，油墨的疏水性性质增加，从而能够防止试样向图案周围扩散的现象。并且，在使用有机溶剂的情况下，经过印刷的油墨通过膜的气孔而渗透的效率增大，由此形成的通道的疏水性性质有可能增大。
[0044]作为上述有机溶剂可使用碳原子数I~6的乙醇、二甲基甲酰胺(DMF，Dimethylformamide)、二甲基亚讽(DMSO, Dimethyl sulfoxide)、丙酮等，但是,优选的是，根据所使用的膜的材质进行适当的调节。并且，上述有机溶剂相对于100重量份的疏水性溶剂使用I~80重量份，更加优选地使用5~50重量份。
[0045]并且，在干燥经过丝网印刷的上述膜时，优选的是，在50~200°C的烘箱内干燥10分钟至3小时。另一方面，如图2所示，本发明的膜传感器可包括作为普通条生物传感器的结构要素的样品垫11、接合垫12、吸收垫13及下部基板14。本发明中，样品垫中投入液状试样，来使该液状试样向反应膜展开，吸收垫起到起到吸收展开到反应膜的试样的作用。上述样品垫或吸收垫只要是能够吸收液状试样的材料，其种类则不受限制，但是，优选地由如纤维素、聚酯、聚丙烯或玻璃纤维等材质形成。
[0046]并且，本发明中，上述接合垫可使用对信号产生物质或者如检测抗体一样与分析对象物质选择性地结合的物质和信号产生物质的接合体进行处理而成的物质。
[0047]上述接合垫中涂敷信号产生物质之后干燥的情况，例如，在上述信号产生物质为酶、酶底物或化学发光物质的情况下，在膜上预先注入或吸附与受体一同，与上述信号产生物质起反应的酶底物或酶等之后，注入试样，从而能够用基于酶反应的信号产生物质的信号来测定分析对象物质。在上述接合垫涂敷选择性地与分析对象物质相结合的物质和信号产生物质的接合体之后干燥的情况下，可用基于受体与分析对象物质的选择性的反应的信号产生物质的信号来测定分析对象物质。
[0048]本发明中，作为上述接合垫，只要是涂敷接合体并干燥之后，在上述接合垫沉浸于液体时，能够使接合体容易从接合垫脱落的物质，则均可使用，只要是在横向流动分析(LFA, lateral flow assay)系统中普遍使用的接合垫,则均可使用，不仅能够使用如纤维素、聚酯、聚丙烯或玻璃纤维等的材质，也均可使用如硝酸纤维素、尼龙、聚砜、聚醚砜或聚偏氟乙烯(PVDF, Polyvinylidene fluoride)等的膜材质。
[0049]另一方面，上述信号产生物质的特征在于，上述信号产生物质为金属纳米粒子、量子点(quantum dot)纳米粒子、磁性纳米粒子、酶、酶底物、酶反应生成物质、吸光物质、荧光物质或发光物质。在上述信号产生物质为金属纳米粒子的情况下，可通过基于受体与分析对象物质的选择性反应引起的金属纳米粒子的颜色变化来检测分析对象物质，在膜上测定与受体选择性地进行结合的分析对象物质和金属纳米粒子的结合体的吸光度、导电率等，从而能够对分析对象物质进行定量分析。如上所述的金属纳米粒子可举例为金纳米粒子、银纳米粒子、铜纳米粒子等，但不局限于此。
[0050]在上述信号产生物质为酶、酶底物(enzyme substrate)或酶反应生成物质的情况下，根据受体与分析对象物质的选择性反应，分析对象物质或受体与上述酶、酶底物或酶反应生成物质进行反应，来引起如氧化还原反应的酶反应，此时，能够通过测定基于上述酶反应的生成物的吸光、荧光、发光等来检测分析对象物质。这些酶可举例为葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶等，但不局限于此，作为酶底物可举例为葡萄糖、过氧化氢等，但不局限于此。
[0051]此外，作为上述信号产生物质可使用本领域中所公知的吸光物质、荧光物质或发光物质，具体的种类可根据本发明所属领域技术人员适当地进行选择。
[0052]本发明中，通过样品垫注入的试样有可能是包含或不包含分析对象物质的任意试样，并意味着以反应膜为介质，可从样品垫向吸收垫流动的流体。具体地表示包含血液、血清或特定分析物质(DNA、蛋白质、化学物质、毒性物质等)的液体形态的试样。
[0053]并且，将如上所述地在印刷疏水性油墨而形成的多通道膜传感器中注入试样，并通过免疫反应等来测定分析对象物质的方法作为本发明的特征。
[0054]在各个上述多通道中分别固定检测抗体等来在各个通道中可进行独立的测定。SP，例如，一般的横向流动分析(LFA, lateral flow assay)条中，不反应的金纳米粒子抗体复合体先经过固定有检测抗体的部分之后，与抗-小鼠免疫球蛋白G (ant1-mouse IgG)相结合来表示对照组(control)信号。结果,在抗原的浓度高的情况下,抗-小鼠免疫球蛋白G (ant1-mouse IgG)区域的结果则显示得较低，但在本发明的传感器中，在各个多通道中独立进行抗原-抗体反应，并且，与固定有检测抗体的通道不同，在对照组通道中不受抗原浓度的影响，从而能够确保更有可靠性的结果。
[0055]并且，利用经过丝网印刷的疏水性油墨的电特性，能够在膜传感器的多通道之间测定电化学信号，从而能够进行试样的分析，更加具体地，如果在电极之间的多通道中注入包含试样的实验溶液之后，在对置的电极之间施加规定的电压或电流，则测定用于反映存在于电极之间的实验溶液的电特性的电流或电阻，由此能够在注入的试样中测定检测物质的浓度。例如，如果与检测物质比较之后使用电阻率较大的实验溶液，因随检测物质的浓度增加而增高的电阻，更低的电流则通过实验溶液而流动。因此，能够通过测定两个电极之间流动的电流来测定检测物质的浓度。
[0056]通过参照附图来说明的优选实施例，将会更加明确地说明上述内容及追加的本发明的实施方式。下面，通过这些实施例更详细地说明本发明，使得本领域的普通技术人员更容易理解并再现。
[0057]但是以下实施例只不过用于例示本发明，并不解释为本发明的范围局限于这些实施例，这对于本领域所属的普通技术人员来说是显而易见的。
[0058]实施例1:借助丝网印刷的多通道膜的制备
[0059]如图1所示，作为疏水性油墨，以形成4个通道的方式，将银浆以5 μ m?10 μ m的厚度丝网印刷于硝酸纤维素膜(密理博公司(Millipore), 180sec Nitrocellulose,4mmX 25mm)上。其次，在常温下干燥15分钟之后，在100°C温度的干燥烘箱中处理I个小时，最终获得多通道膜。
[0060]实施例2?实施例3:使用有机溶剂的丝网印刷
[0061]上述银浆中，将乙醇分别混合成5重量％、10重量％之后，除了对此进行丝网印刷之外，以与上述实施例1相同的方式制备了膜。
[0062]向制备出的上述多通道膜流入包含1% (w/v)的无蛋白酶牛血清白蛋白(BSA，protease free Bovine Serum Albumin,皮特泽拉得公司(Fitzerald))的憐酸盐缓冲(PBS，Phosphate Buffered Saline，玉博公司(Gibco)，美国(USA))溶液，并确认向图案周围扩散的流动现象，其结果见图3。
[0063]如上述图3所示，就印刷添加有乙醇的银浆的图案而言，与未添加的图案相比，向通道周围扩散的溶液大大减少，特别是，以10重量％包含乙醇的情况下，可知，向图案周围扩散的流动现象几乎不存在。一般，硝酸纤维素膜具有溶解于乙醇的性质，因此，如果能够适当地调节乙醇的浓度，因银浆浸湿，则可视为银浆的疏水性性质增加。
[0064]实施例4:利用生物传感器来测定人血清内的C反应蛋白(CRP，C-reactiveprotein)
[0065]4-1.金纳米粒子-抗体接合体合成
[0066]在ImL的金纳米粒子胶体溶液(20nm, BB国际(International),英国(GB))中加入0.1M的硼酸缓冲液(pH8.5) 0.1mL,并加入lmg/mL的抗-C反应蛋白(CRP，C-reactiveprotein)抗体(艾博抗公司(Abeam)) 10 μ L,反应30分钟。上述反应之后，添加将无蛋白酶牛血清白蛋白(BSA, protease free Bovine Serum Albumin,皮特泽拉得公司(Fitzerald))溶解于憐酸盐缓冲溶液(PBS, Phosphate Buffered Saline,玉博公司(Gibco), USA (美国))的0.1mL的溶液，在4°C的温度中反应60分钟。上述反应之后，在10000rpm、4°C的温度下进行20分钟的离心分离，分3次加入溶解于IOmM的磷酸盐缓冲溶液的lmg/mL的无蛋白酶牛血清白蛋白溶液ImL,纯化并回收,从而合成了金纳米粒子_抗体接合体。将合成的金纳米粒子-抗体接合体浓缩成2.5倍之后,在切断成约7mmX4mm的接合垫(融合(fusion) 5,沃特曼(whatman))中注入每10 μ L并进行干燥。
[0067]4-2.膜的制备
[0068]如图2所示，作为疏水性油墨，以形成两个通道的方式，将银浆以10 μ m的厚度丝网印刷于硝酸纤维素膜(密理博公司(Millipore), 180sec Nitrocellulose, 7mmX 25mm)上。
[0069]其次，在常温下干燥15分钟之后，在100°C温度的干燥烘箱中处理I个小时，最终获得了多通道膜。
[0070]使用上述膜和样品垫(玻璃纤维，7mmX 7mm)、吸收垫(玻璃纤维7mmX 10mm)及制备的上述接合垫来构成了如图2的生物传感器。
[0071]分别以lmg/ml的浓度，在上述形成的两个通道中的一侧固定了 I μ L的作为检测抗体的抗-C反应蛋白多克隆抗体(Ant1-CRP, AntiC-reactive protin) 15,在上述形成的两个通道中的另一侧固定了 I μ L的抗-小鼠免疫球蛋白G (ant1-mouse IgG) 16。
[0072]其次，将以O、1、10、100及1000ng/mL的浓度溶解C反应蛋白的人血浆(即为不含有C反应蛋白的血清(CRP free serum)) 50 μ I注入于样品垫，并经过3分钟之后，在各个通道中测定吸光度。
[0073]将上述样品的注入结果照片显示在图4中，图5中比较了在各个通道中测定的吸光度。
[0074]如上述图4及图5所示，可确认到如下情况，就对照组(Control)区域(右侧，固定有抗-小鼠免疫球蛋白G的部分)而言，与C反应蛋白浓度无关地，均显示较高的反应，相反，就测试(Test)区域(左侧，固定有鼠抗-C反应蛋白多克隆抗体的部分)而言，随C反应蛋白浓度的增加，信号也随之增加。
[0075]实施例5:在丝网印刷有银浆的条传感器中利用三联吡啶合钌来测定电化学发光
信号
[0076]5-1.传感器的制造
[0077]利用使用石蜡固体油墨的印刷机来在硝酸纤维素膜(密理博公司(Millipore)，90sec Nitrocellulose, 12mmX 10mm)上印刷1.1mm间距的通道，在10CTC的温度下处理I分钟，来使石蜡渗透至膜。如图6所示，以与实施例1相同的方法，在制备出的上述膜上印刷电极，以使银浆具有500 μ m的丝网的间距，并在常温下干燥3个小时。结束干燥之后，在两个通道之间，利用导电性银涂料(D0TITE D-500，藤仓有限公司(Fujikura Kasei CoLtd))来在各电极表面分别焊接铜线，并且，通过上述铜线来使各个电极与电化学工作站(CompactStat, IviumTechnologies)相连接。
[0078]5-2.电化学发光信号的检测
[0079]将Img的三联吡啶合钌溶解于100 μ I的二甲基亚砜之后，将溶解于磷酸盐缓冲溶液的5M的三丙胺分别在IOmM磷酸盐缓冲溶液中稀释成100倍，并以1:1的体积比混合各个溶液来制备了反应溶液。将制备的20 μ I反应溶液注入于上述制造的传感器的膜的下端部，来使该反应溶液经由通道之间，然后适用160秒1.7V、2.5V、4V，以I秒为单位测定了电流，与此同时测定了化学发光信号。上述化学发光信号是利用LAS3000 (富士胶片(Fujifilm))而测定的。
[0080]图7为通过上述过程来测定化学发光信号的照片，图8为根据不同时间测定基于施加电压的电流变化来进行比较的图表。如上述图7及图8所示，施加电压越高，越能够明确地确认通道之间的化学发光信号和测定电流增加的现象，此现象说明可利用通过本发明制备的银浆图案的电特性来进行测定。
[0081]结果，可确认出，能够通过基于本发明的生物传感器的多重免疫色谱法来容易地测定不同浓度的抗原。并且，可确认出，能够利用经过丝网印刷的浆料的电特性来测定电化学发光信号。
[0082]以上对本
【发明内容】
的特定部分进行了详细的说明，这种具体的技术仅仅是优选的实施方式，而本发明的范围不局限于此，这对于本发明所属【技术领域】的普通技术人员来说是显而易见的。因此，本发明的实质性范围应当根据所附的发明要求保护范围及其等同替代而定义。
【权利要求】
1.一种多通道膜传感器的制造方法，其特征在于，包括在能够使疏水性试样流动的膜上，以丝网印刷的方式印刷疏水性油墨来形成多通道的步骤。
2.根据权利要求1所述的多通道膜传感器的制造方法，其特征在于，上述膜包含硝酸纤维素、尼龙、聚砜、聚醚砜及聚偏氟乙烯中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的多通道膜传感器的制造方法，其特征在于，上述疏水性油墨使用选自银浆、碳浆、钼浆、陶瓷浆及蜡中的一种以上。
4.根据权利要求1所述的多通道膜传感器的制造方法，其特征在于，上述疏水性油墨包含选自碳原子数I?6的乙醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜及丙酮中的一种或两种以上的有机溶剂。
5.一种利用横向流动的膜传感器，其特征在于，包括多通道，上述多通道是在膜的表面上以丝网印刷方式印刷疏水性油墨而形成的。
6.根据权利要求5所述的利用横向流动的膜传感器，其特征在于，在膜上包括样品垫、接合垫及吸收垫。
7.根据权利要求6所述的利用横向流动的膜传感器，其特征在于，上述样品垫或吸收垫包含选自纤维素、聚酯、聚丙烯及玻璃纤维中的一种以上。
8.根据权利要求6所述的利用横向流动的膜传感器，其特征在于，上述接合垫包含选自纤维素、聚酯、聚丙烯、玻璃纤维、硝酸纤维素、尼龙、聚砜、聚醚砜及聚偏氟乙烯中的一种以上。
9.根据权利要求6所述的利用横向流动的膜传感器，其特征在于，上述接合垫是对与信号产生物质或分析对象物质选择性地结合的物质和信号产生物质的接合体进行处理而成的。
10.根据权利要求9所述的利用横向流动的膜传感器，其特征在于，上述信号产生物质为金属纳米粒子、量子点、纳米粒子、磁性纳米粒子、酶、酶底物、酶反应生成物质、吸光物质、突光物质或发光物质。
11.一种生物体试样的分析方法,其特征在于,在选自权利要求5至10中任一项所述的膜传感器中注入试样来测定分析对象物质。
12.根据权利要求11所述的生物体试样的分析方法，其特征在于，包括在上述膜传感器的多通道之间测定电化学信号的步骤。
【文档编号】G01N33/52GK103890583SQ201280049510
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年10月5日 优先权日:2011年10月6日
【发明者】金珉坤, 郑晓庵, 安俊烔, 石昊峻 申请人:认智生物