利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序的利记博彩app

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【专利摘要】提供了在利用使用了共焦显微镜或多光子显微镜的光测量的扫描分子计数法中将光测量时的测量单位时间设定为合适的值以能够可靠地检测发光粒子的信号的大致吊钟状的轮廓且能够避免时序光强度数据的数据量的过度增大的光分析技术。本发明的对样本溶液中的发光粒子的光进行检测的光分析技术一边使显微镜的光检测区域的位置在样本溶液内移动一边生成所检测出的来自光检测区域的光的时序光强度数据，在该数据中逐个检测各个表示来自各个发光粒子的光的信号。根据光检测区域的大小和位置的移动速度来决定来自光检测区域的光的检测中的测量单位时间。
【专利说明】利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光
分析用计算机程序
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种光分析技术，能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测来自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子的光，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统逐个检测来自单个的发光粒子的光并进行各种光分析的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序。此外，在本说明书中，发光的粒子(以下称为“发光粒子”)可以是其自身发光的粒子、或附加了任意的发光标识或发光探针的粒子，从发光粒子发出的光可以是荧光、磷光、化学发光、生物发光、散射光等。
【背景技术】
[0002]由于近年来的光测量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或荧光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光的测量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的装置或方法。例如，在荧光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如参照专利文献 1-3、非专利文献 1-3)中，利用激光共焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测量来自出入样本溶液中的微小区域(被称为显微镜的激光会聚到的焦点区域-共焦区组织)内的荧光分子或被荧光标识的分子(荧光分子等)的荧光强度，根据由测量得到的该荧光强度的自相关函数的值所确定的在微小区域内的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)和滞留分子的个数的平均值，获取荧光分子等的运动的速度或大小、浓度之类的信息，或检测分子的构造或大小的变化、分子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象。另外，在荧光强度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如专利文献 4、非专利文献4)、光子计数直方图(Photon Counting Histogram:PCH。例如专利文献5)中，生成与FCS同样地测量出的出入共焦区组织内的荧光分子等的荧光强度的直方图，使统计性的模型公式拟合该直方图的分布，由此估算荧光分子等的固有的亮度的平均值和滞留在共焦区组织内的分子的个数的平均值，根据这些信息估计分子的构造或大小的变化、结合/离解状态、分散/聚合状态等。另外，除此以外，在专利文献6、7中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统测量出的样本溶液的荧光信号的时间经过来检测荧光性物质的方法。专利文献8提出了一种信号运算处理技术，其用于使用光子计数技术测量来自流通于流式细胞仪的荧光微粒子或固定在基板上的荧光微粒子的微弱光，来检测流体中或基板上的荧光微粒子的存在。
[0003]特别是，根据FCS、FIDA等使用了利用共焦显微镜的光学系统和光子计数技术进行微小区域的荧光测量的技术的方法，进行测量所需要的样本与以前相比可以是极低浓度且极微量(在一次测量中使用的量至多为几十yL左右)，测量时间也大幅缩短(在一次测量中反复多次进行秒级时间的测量。)。因而，期待这些技术特别是在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查的强力工具。
[0004]专利文献1:日本特开2005-098876
[0005]专利文献2:日本特开2008-292371
[0006]专利文献3:日本特开2009-281831
[0007]专利文献4:日本专利第4023523号
[0008]专利文献5:国际公开2008-080417
[0009]专利文献6:日本特开2007-20565
[0010]专利文献7:日本特开2008-116440
[0011]专利文献8:日本特开平4-337446号公报
[0012]非专利文献1:金城政孝，蛋白质核酸酶Vol.44，N0.9，1431-1438页1999年
[0013]非专利文献2:F.J.Meyer-Alms,突光相关谱(Fluorescence CorrelationSpectroscopy), R.Rigler 编,Springer,柏林,2000 年,204-224 页
[0014]非专利文献3:加藤则子及其他4名，遗传医学，Vol.6，N0.2，271-277页
[0015]非专利文献4:卡斯柯(Kask)及其他3名，美国科学学院纪要，1999年，96卷，13756-13761 页(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))

【发明内容】

[0016]发明要解决的问题
[0017]在上述的FCS、FIDA等使用了共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的光学分析技术中，所测量的光是从荧光单分子或多分子发出的光，但在该光的分析中，执行时序地测量出的荧光强度数据的自相关函数的运算或对直方图拟合之类的荧光强度的波动的计算等统计性的处理，并非逐个参照或分析来自各个荧光分子等的光的信号。即，在这些光分析技术中，对来自多个荧光分子等的光的信号统计性地进行处理，针对荧光分子等检测统计平均性的特性。因而，为了在这些光分析技术中得到统计上有意义的结果，需要样本溶液中的作为观测对象的荧光分子等的浓度或数密度在平衡状态下为在一次的秒级长度的测量时间内能够进行统计性处理的个数的荧光分子等出入微小区域内的水平，优选的是在微小区域内始终存在一个左右的荧光分子等的水平。实际上，共焦区组织的体积为IfL左右，因此，在上述的光分析技术中使用的样本溶液中的荧光分子等的浓度典型地是InM左右或其以上，在大幅低于InM时，产生在共焦区组织内不存在荧光分子等的时间而无法得到统计上有意义的分析结果。另一方面，在专利文献6?8所记载的荧光分子等的检测方法中，不包括荧光强度的波动的统计性的运算处理，即使样本溶液中的荧光分子等小于InM也能够检测荧光分子等，但无法定量地计算在溶液中随机运动的荧光分子等的浓度或数密度。
[0018]因此，本申请的 申请人:在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中提出了基于新原理的光分析技术，能够定量地观测作为观测对象的发光粒子的浓度或数密度低于利用FCS、FIDA等包含统计性处理的光分析技术进行处理的水平的样本溶液中的发光粒子的状态或特性。在所述新的光分析技术中，如果清楚地进行描述，则与FCS、FIDA等同样地，在使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的情况下，一边使作为光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”。)的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域包含在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子时检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子一个一个地逐个进行检测来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。根据该新的光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”。)，与FCS、FIDA等光分析技术同样地，进行测量所需要的样本可以是微量的(例如几十μ L左右)，另外，测量时间短，并且与FCS、FIDA等光分析技术的情况相比，能够检测更低的浓度或数密度的发光粒子的存在，并定量地检测其浓度、数密度或其它特性。
[0019]在上述扫描分子计数法中，更具体地说，将与光检测区域的位置在样本溶液内移动的同时逐次测量出的光强度值(或者光子计数值)记录为按时间序列的光强度数据，在该数据上检测表示从发光粒子发出的光的光强度值的增大(表示发光粒子的光的信号)。关于该点，一般来说，在实施扫描分子计数法的光分析装置中，从单个发光粒子释放并到达光检测器的光的强度根据光检测区域中的发光粒子的位置而不同，典型地是，在发光粒子的位置位于光检测区域的大致中心区域时光强度最大(以下将光检测区域内的发光粒子的光强度最大的位置称为“最大强度点”。)，发光粒子的位置越靠近光检测区域的周缘，光强度越是逐渐降低。即，从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布(以下仅称为“光检测区域内的光强度分布”。)具有强度从最大强度点向周缘降低的大致吊钟状的轮廓。因而，如果发光粒子大致直线状地通过光检测区域内，则时序光强度数据上的表不从发光粒子发出的光的光强度值增大的轮廓为与光检测区域内的光强度分布对应的大致吊钟状的轮廓，因此通过判断某光强度值的增大的轮廓是否为针对发光粒子在光检测区域内通过时设想的大致吊钟状的轮廓，能够检测表示从发光粒子发出的光的光强度值的增大、即发光粒子的信号。
[0020]另一方面，在时序光强度数据上出现的发光粒子的信号的轮廓也受时序光强度数据生成时的时间分辨率影响。典型地是，在实施扫描分子计数法的光分析装置中，根据按每个规定的测量单位时间由光检测器接收到的光量来检测光强度。例如，在光的测量通过光子计数进行的情况下，光强度通常用在以亚微秒?毫秒的等级任意设定的每个测量单位时间(BIN TIME)内到达光检测器并被检测出的光子的个数表示。因而，根据每个所述测量单位时间的光量逐次测量光强度值，在生成时序光强度数据的情况下，测量单位时间越短，即，使时间分辨率越高，越能够高精度地获取大致吊钟状的光强度值的增大的轮廓，如果测量单位时间过长，即，使时间分辨率过低，则导致无法得到大致吊钟状的轮廓。也就是说，为了高精度地检测发光粒子的信号，测量单位时间短是理想的，但是测量单位时间越短，时序光强度数据的数据量越大，成本越大。另外，在时序光强度数据上能够得到的发光粒子的信号的轮廓还依赖于光检测区域的移动速度。即，光检测区域的移动速度越高，发光粒子被包含在光检测区域内的时间越短，单个发光粒子的信号出现的时间越短。
[0021]这样，本发明的主要课题在于提供如下一种方法:将扫描分子计数法中的光测量时的测量单位时间设定为合适的值以能够可靠地检测发光粒子的信号的大致吊钟状的轮廓且能够避免时序光强度数据的数据量的过度增大。[0022]用于解决问题的方案
[0023]根据本发明的一个方式，通过光分析装置达成上述课题，该光分析装置使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析装置的特征在于，包括:光检测区域移动部，其使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；光检测部，其按每个测量单位时间检测从光检测区域到来的光量；以及信号处理部，其生成一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边由光检测部按每个测量单位时间检测出的来自光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在按时间序列的光强度数据中逐个检测表示来自各个发光粒子的光的信号，其中，测量单位时间根据光检测区域的大小和位置的移动速度来决定。
[0024]在所述结构中，“在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子”是指在样本溶液中分散或溶解的原子、分子或它们的聚合体等发出光的粒子，如果是不固定在基板等上而在溶液中自由地进行布朗运动的粒子，则可以是任意的粒子。所述发光粒子典型地是荧光性粒子，但也可以是通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等来发出光的粒子。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指这些显微镜中检测光的微小区域，在从物镜提供照明光的情况下，相当于该照明光会聚到的区域(在共焦显微镜中，特别地由物镜和针孔之间的位置关系来确定。在发光粒子没有照明光而发光的情况下，例如是通过化学发光或生物发光来发光的粒子的情况下，在显微镜中不需要照明光。)。另外，典型地是，光检测部通过按每个规定的测量单位时间(ΒΙΝ--ΜΕ)对到来的光子数进行计数的光子计数来检测来自光检测区域的光，在这种情况下，按时间序列的光强度数据为按时间序列的光子计数数据。此外，在本说明书中，在称为“发光粒子的信号”的情况下，只要没有特别限定，是指表示来自发光粒子的光的信号。
[0025]如从上述理解的那样，在作为本发明的基本结构的扫描分子计数法中，首先，一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边逐次进行光的检测。这样，可以期待在样本溶液内移动的光检测区域包含了随机运动的发光粒子时检测到来自发光粒子的光，由此检测一个发光粒子的存在。因而，在逐次检测出的光中逐个检测来自发光粒子的光的信号，由此一个一个地逐个且逐次检测粒子的存在，能够获取与粒子在溶液内的状态有关的各种信息。在所述结构中，如已经记述的那样，在进行光的检测时，光检测部按每个测量单位时间检测从光检测区域到来的光量，将在每个测量单位时间检测出的光量的大小或光强度变换为电信号并发送到信号处理部，构成时序光强度数据。在这种情况下，如果测量单位时间过长，则发光粒子的信号的特征性轮廓消失，如果测量单位时间过短，则数据量庞大。关于该点，发光粒子的信号的轮廓的特征是否在时序光强度数据上消失由出现在时序光强度数据上的发光粒子的信号的长度与测量单位时间的长度之间的关系决定，发光粒子的信号的长度依赖于光检测区域的大小和位置的移动速度。因此，在本发明中，根据光检测区域的大小和位置的移动速度设定测量单位时间的长度以能够捕捉发光粒子的信号的特征性轮廓且抑制数据量。
[0026]关于上述的测量单位时间的设定，更详细地说，为了捕捉发光粒子的信号的特征性轮廓，应该将测量单位时间的长度设定得相对于时序光强度数据上的发光粒子的信号的长度相对较短。光检测区域的大小越大，发光粒子的信号的长度越长，移动速度越高，发光粒子的信号的长度越短，因此结果可以是，光检测区域的大小越大，将测量单位时间设定得越长，移动速度越高，将测量单位时间设定得越短。另外，发光粒子的信号的长度相当于一个发光粒子通过光检测区域时的通过时间，所述通过时间通过[光检测区域的大小]/[光检测区域的移动速度]给出(在此，[光检测区域的大小]是指与光检测区域的行进方向平行的方向的尺寸或直径。)。因而，可以是发光粒子的通过时间越长，将测量单位时间设定得越长。
[0027]另外，关于测量单位时间的设定，更详细地说，为了从时序光强度数据上的发光粒子的信号中捕捉该信号的轮廓的特征，在时间方向上需要至少两个数据点(如果数据点是一个，则仅能够辨别有无信号的存在，信号的轮廓的信息完全消失。)。因而，优选将测量单位时间设定为小于一个发光粒子通过光检测区域时的通过时间的一半。关于该点，作为发光粒子的通过时间，可以使用理论上的估计值。如上述那样，发光粒子的通过时间通过[光检测区域的大小]/[光检测区域的移动速度]给出。在此，光检测区域的移动速度如后面详细记述的那样由光学系统内的反射镜的朝向的变更或样本容器的移动的速度决定，能够比较高精度地估算其值。然而，关于光检测区域的大小，作为光检测区域中的激励光的强度为其中心的强度的Ι/e2的球面体或椭圆球体的外径，使用光的波长和物镜的数值孔径进行估计，但是难以准确地划定激励光的强度实质为O的面区域。因此，作为[光检测区域的大小]的估计值，可以使用激励光的强度为其中心的强度的Ι/e2的球面体或椭圆球体的、与光检测区域的行进方向平行的方向的最大尺寸或最大直径(光检测区域的估计直径)，作为发光粒子的通过时间，可以采用通过[光检测区域的估计直径]/[光检测区域的移动速度]给出的值(估计通过时间)。
[0028]并且，根据后面所示的实施例的实验结果，示出了当在一个发光粒子通过光检测区域的期间包含至少三个数据点、更优选包含四个以上的数据点时，在时序光强度数据上能够更高精度地检测发光粒子的信号。在此，在一个测量单位时间内提供一个数据点。因而，在上述装置中，优选的是，可以将测量单位时间设定成一个发光粒子通过光检测区域时的通过时间与至少三个测量单位时间相重叠。此外，一个发光粒子通过时的通过时间可以是上述的估计通过时间，也可以是预先通过实验得到的时间值。(估计通过时间通常比通过实验得到的通过时间短。)。
[0029]在上述本发明的装置的信号处理部的处理中，如已经记述的那样，可以根据由光检测部检测出的按时间序列的表示光的信号的轮廓，来进行基于逐次的来自光检测部的检测值的信号判断是否一个发光粒子进入了光检测区域的判断。关于该点，在实施方式中，典型地是，可以在检测出具有大于规定阈值的强度的信号时，检测为一个发光粒子进入了光检测区域。更具体地说，如后述的实施方式一栏中说明的那样，通常表示来自发光粒子的光的信号的轮廓在光检测部的按时间序列的检测值、即光强度数据上为具有某种程度以上的强度的吊钟型的脉冲状，噪声的轮廓不是吊钟型的脉冲状、或者其强度小。因此，本发明的装置的信号处理部可以构成为将在按时间序列的光强度数据上具有超过规定阈值的强度的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号。“规定阈值”能够通过实验设定为合适的值。
[0030]并且，本发明的装置的检测对象是来自单个发光粒子的光，因此光强度非常微弱，在一个发光粒子是荧光单分子或多分子等的情况下，发光粒子所发出的光是概率性地释放的，在微小的时间内可能产生信号值的缺失。而且，当产生这样的缺失时，难以确定与一个发光粒子的存在对应的信号。因此，信号处理部可以构成为使按时间序列的光强度数据平滑化，在对数据进行加工以能够忽略微小时间内的信号值的缺失之后，将平滑化后的按时间序列的光强度数据中具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号。
[0031]可以根据发光粒子的特性或者样本溶液中的数密度或浓度适当变更上述本发明的装置中的光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度。从发光粒子检测出的光的方式有可能根据发光粒子的特性或者样本溶液中的数密度或浓度不同而发生变化。特别是当光检测区域的移动速度变快时，从一个发光粒子获得的光量减少，因此优选的是，能够适当地变更光检测区域的移动速度以能够高精度地或高灵敏度地测量来自一个发光粒子的光。
[0032]另外，优选的是，将光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度设定得比作为检测对象的发光粒子的扩散移动速度(由布朗运动所造成的粒子的平均移动速度)高。如上述说明的那样，本发明的装置对光检测区域通过发光粒子的存在位置时从该发光粒子发出的光进行检测，来逐个检测发光粒子。然而，发光粒子由于在溶液中进行布朗运动而随机地移动，在多次出入光检测区域的情况下，导致从一个发光粒子多次检测到(表示发光粒子的存在的)信号，难以使检测出的信号与一个发光粒子的存在对应起来。因此，如上述那样，将光检测区域的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度高，由此能够使一个发光粒子对应一个(表示发光粒子的存在的)信号。此外，扩散移动速度因发光粒子的不同而变化，因此，如上所述，优选的是本发明的装置构成为能够根据发光粒子的特性(特别是扩散常数)适当地变更光检测区域的移动速度。
[0033]可以通过任意的方式进行样本溶液内的光检测区域的位置的移动。例如可以使用在激光扫描型光学显微镜中所采用的检电镜(Galvano-miiror)等变更显微镜的光学系统的光路来变更光检测区域的位置，或者使样本溶液的位置移动(例如移动显微镜的台等)来移动光检测区域在样本溶液内的位置。可以任意地设定光检测区域的位置的移动轨迹，例如能够从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。特别是在变更显微镜的光学系统的光路来变更光检测区域的位置的情况下，光检测区域的移动迅速，并且在样本溶液中实质上不发生机械振动、流体力学作用，因此作为检测对象的发光粒子不会受到力学作用的影响而能够在稳定的状态下进行光的测量，在这点上是有利的。
[0034]在上述的本发明的一个实施方式中，可以对信号的个数进行计数来对包含在光检测区域中的发光粒子的个数进行计数(粒子的计数)。在这种情况下，通过将检测出的发光粒子的个数和光检测区域的位置的移动量组合，能够获得与样本溶液中的被同定的发光粒子的数密度或浓度有关的信息。具体地说，例如可以计算多个样本溶液的数密度或浓度之比，或者计算相对于作为浓度或数密度的基准的标准样本溶液的相对的数密度或浓度之t匕，或者使用相对于作为浓度或数密度的基准的标准样本溶液的相对的数密度或浓度之比来决定绝对的数密度值或浓度值。或者，如果通过任意的方法、例如以规定的速度移动光检测区域的位置等而能够确定出光检测区域的位置的移动轨迹的总体积，则能够具体估算发光粒子的数密度或浓度。
[0035]通过通用的计算机也能够实现在上述本发明的装置中一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边进行光检测来逐个检测来自各个发光粒子的信号且考虑光检测区域的大小和位置的移动速度来设定光检测的测量单位时间的光分析技术的处理。因而，根据本发明的另一个方式，提供一种光分析用计算机程序，用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该计算机程序的特征在于，使计算机执行以下步骤:使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；在样本溶液内的光检测区域的位置的移动过程中按根据光检测区域的大小和位置的移动速度决定的每个测量单位时间检测从光检测区域到来的光量，生成按时间序列的光强度数据；以及逐个检测按时间序列的光强度数据中的各个表示来自各个发光粒子的光的信号。此外，典型地是，在检测来自光检测区域的光并生成按时间序列的光强度数据的步骤中，通过对在每个测量单位时间(BIN TIME)内到来的光子数进行计数的光子计数来检测来自光检测区域的光，在这种情况下，按时间序列的光强度数据是按时间序列的光子计数数据。
[0036]在所述结构中，更详细地说，可以是，光检测区域的大小越大，将测量单位时间设定得越长，移动速度越高，将测量单位时间设定得越短，或者发光粒子的通过时间越长，将测量单位时间设定得越长。另外，优选的是，测量单位时间小于一个发光粒子通过光检测区域时的估计通过时间的一半，更为优选的是，可以将测量单位时间设定为一个发光粒子通过光检测区域时的通过时间与至少三个测量单位时间相重叠。
[0037]另外，在上述的计算机程序中也同样，可以根据按时间序列的信号的轮廓来进行表示来自各个发光粒子的光的信号的逐个检测。在实施方式中，典型地是，可以在检测出具有大于规定阈值的强度的信号时，检测为一个发光粒子进入了光检测区域。具体地说，可以将光强度数据上具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号，优选的是可以使按时间序列的光强度数据平滑化，将平滑化后的按时间序列的光强度数据上具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号。
[0038]并且，可以根据发光粒子的特性、样本溶液中的数密度或浓度适当变更样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度，优选的是，将样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定得比作为检测对象的发光粒子的扩散移动速度高。可以通过任意的方式进行样本溶液内的光检测区域的位置的移动，优选的是，可以变更显微镜的光学系统的光路或使样本溶液的位置移动来变更光检测区域的位置。可以任意地设定光检测区域的位置的移动轨迹，例如能够从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。
[0039]并且，在上述的计算机程序中也同样，可以包括以下步骤:对逐个检测出的来自发光粒子的信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置的移动过程中检测出的发光粒子的个数进行计数；和/或根据检测出的发光粒子的个数来确定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
[0040]根据上述本发明的装置或计算机程序，实现一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边进行各个发光粒子的光的检测且考虑光检测区域的大小和位置的移动速度来设定光检测的测量单位时间的新的光分析方法。这样，根据本发明，还提供一种光分析方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析方法的特征在于，包括以下过程:使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边按每个测量单位时间检测从光检测区域到来的光量，生成按时间序列的光强度数据；以及逐个检测按时间序列的光强度数据中的各个表来自各个发光粒子的光的信号，其中，根据光检测区域的大小和位置的移动速度来决定测量单位时间。
[0041]在所述方法中也同样，典型地是，在检测来自光检测区域的光并生成按时间序列的光强度数据的过程中，通过对在每个测量单位时间(BIN TIME)内到来的光子数进行计数的光子计数来检测来自光检测区域的光，在这种情况下，按时间序列的光强度数据是按时间序列的光子计数数据。而且，更详细地说，可以是，光检测区域的大小越大，将测量单位时间设定得越长，移动速度越高，将测量单位时间设定得越短，或者发光粒子的通过时间越长，将测量单位时间设定得越长。另外，优选的是，测量单位时间小于一个发光粒子通过光检测区域时的估计通过时间的一半，更为优选的是，可以将测量单位时间设定为一个发光粒子通过光检测区域时的通过时间与至少三个测量单位时间相重叠。
[0042]并且，在上述方法中也同样，可以根据按时间序列的信号的轮廓来进行表示来自各个发光粒子的光的信号的逐个检测。在实施方式中，典型地是，可以在检测出具有大于规定阈值的强度的信号时，检测为一个发光粒子进入了光检测区域。具体地说，可以将光强度数据上具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号，优选的是可以使按时间序列的光强度数据平滑化，将平滑化后的按时间序列的光强度数据中具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号。
[0043]另外，可以根据发光粒子的特性、样本溶液中的数密度或浓度适当变更样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度，优选的是，将样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定得比作为检测对象的发光粒子的扩散移动速度高。可以通过任意的方式进行样本溶液内的光检测区域的位置的移动，优选的是，可以变更显微镜的光学系统的光路或使样本溶液的位置移动来变更光检测区域的位置。可以任意地设定光检测区域的位置的移动轨迹，例如能够从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。
[0044]并且，在上述的方法中也同样，可以包括以下过程:对逐个检测出的来自发光粒子的信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置的移动过程中检测出的发光粒子的个数进行计数；和/或根据检测出的发光粒子的个数来确定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
[0045]上述本发明的光分析技术典型地用于分析或解析蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的生物学对象物在溶液中的状态的用途，但是也可以用于分析或解析非生物学粒子(例如原子、分子、胶束(micelles)、金属胶体等)在溶液中的状态，应该理解为这种情况也属于本发明的范围。
[0046]发明的效果
[0047]这样，根据本发明，根据光检测区域的大小和位置的移动速度来设定光检测时的测量单位时间以能够捕捉光强度数据上的发光粒子的信号的特征性轮廓且能够抑制数据量。根据所述结构，在检测发光粒子的信号的基础上，能够避免无用地提高数据的时间分辨率而致使数据量增加，从而节约成本。另外，在尝试节省数据量时，也能够掌握更可靠地捕捉发光粒子的信号的轮廓特征的界限而设定测量单位时间，能够维持发光粒子的信号与噪声的分离精度。并且，能够在维持发光粒子的信号与噪声的分离精度的同时节省数据量，因此能够降低发光粒子的信号的检测处理中的信号处理的负荷。[0048]通过本发明的以下优选实施方式的说明可清楚本发明的其它目的和优点。
【专利附图】

【附图说明】
[0049]图1的(A)是执行本发明的扫描分子计数法的光分析装置的内部结构的示意图。图1的(B)是共焦区组织(共焦显微镜的观察区域)的示意图。图1的(C)是变更反射镜7的朝向使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。图1的(D)是移动微板的水平方向位置来使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。
[0050]图2的(A)、(B)分别是说明应用本发明的扫描分子计数法中的光检测原理的示意图以及所测量的光强度的时间变化的示意图。图2的(C)是说明来自发光粒子的光的强度变化与测量单位时间的关系的图。图2的(D)是光检测区域的示意图，示意性地示出了发光粒子的通过时间根据通过位置的不同而不同。
[0051]图3是以流程图的形式表示依照本发明执行的扫描分子计数法的处理步骤的图。
[0052]图4的(A)、(B)分别是表示在发光粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时以及在通过以比发光粒子的扩散移动速度快的速度使样本溶液内的光检测区域的位置移动而发光粒子横穿光检测区域时的粒子的运动方式的模型图。图4的(C)是说明用于依照扫描分子计数法根据所测量的时序光强度数据(光子计数的时间变化)检测发光粒子的存在的处理步骤中的检测信号的信号处理过程的例子的图。
[0053]图5示出了所测量的光子计数数据的实测例子(直方图表)、对数据进行平滑处理而得到的曲线(虚线)以及在脉冲存在区域拟合的高斯函数(实线)。在图中，附加为“噪声”的信号作为由噪声或异物造成的信号而被忽略。
[0054]图6示出了被检测为发光粒子信号的脉冲信号所包含的数据点的个数的分布。
(A)是将BINTIME设定为20 μ s的情况，⑶是将BIN TIME设定为30 μ s的情况。
[0055]图7是在以往的计算荧光强度的波动的光分析技术中得到的光子计数(光强度)的时间变化的例子，(A)是样本内的粒子的浓度为能够提供足够的测量精度的程度的情况，
(B)是样本内的粒子的浓度相比于(A)的情况大幅降低的情况。
[0056]附图标记说明
[0057]1:光分析装置(共焦显微镜)；2:光源；3:单模光纤(single-mode opticalfiber) ；4:准直透镜；5:分色镜；6、7、11:反射镜；8:物镜；9:微板；10:皿(样本溶液容器)；12:聚光镜(condenser lens) ；13:针孔；14:屏蔽滤波器；14a:分色镜或偏振分束器；15:多模光纤(mult1-mode optical fiber) ；16:光检测器；17:反射镜偏转器；17a:台位置变更装置；18:计算机。
【具体实施方式】
[0058]下面，详细说明本发明的优选实施方式。
[0059]光分析装置的结构
[0060]实现本发明的光分析技术的光分析装置可以是如下的装置:在基本结构中，如图1的(A)示意性地例示那样，组合能够执行FCS、FIDA等的共焦显微镜的光学系统和光检测器而成。参照该图，光分析装置I由光学系统2?17以及用于控制光学系统的各部分的动作并且获取并解析数据的计算机18构成。光分析装置I的光学系统可以与普通的共焦显微镜的光学系统相同，在此，使从光源2发射并在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的出射端成为以由固有的NA决定的角度发散的光而被发射，通过准直器4成为平行光，被分色镜5、反射镜6、7反射，入射到物镜8。典型地是在物镜8的上方配置有微板9，该微板9排列有注入了 I μ L?几十μ L的样本溶液的样本容器或皿10，从物镜8射出的激光在样本容器或皿10内的样本溶液中聚焦，形成光强度强的区域(激励区域)。在样本溶液中分散或溶解有作为观测对象物的发光粒子、典型地是荧光性粒子或附加有荧光色素等发光标识的粒子，当所述发光粒子进入到激励区域时，在其间发光粒子被激励而释放出光。所释放的光(Em)通过物镜8、分色镜5，被反射镜11反射而在聚光镜12聚光，通过针孔13，透过屏蔽滤波器14 (在此，只选择特定波长频带的光成分。)，被导入到多模光纤15，到达光检测器16，在被变换为按时间序列的电信号之后输入到计算机18，以后面说明的方式进行用于光分析的处理。此外，如本领域技术人员所了解的那样，针孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置，由此仅从如图1的(B)示意性地表示的激光的焦点区域、即激励区域内发出的光通过针孔13，来自激励区域以外的光被遮断。图1的(B)所例示的激光的焦点区域通常是具有IfL?IOfL左右的有效体积的本光分析装置中的光检测区域(典型地是光强度以区域中心为顶点的高斯型分布。有效体积是以光强度为中心光强度的Ι/e2的面为边界的大致椭圆球体的体积。)，被称为共焦区组织。另外，在本发明中，检测来自一个发光粒子的光、例如来自一个荧光色素分子的微弱光，因此作为光检测器16，优选的是使用能够在光子计数中使用的超高灵敏度的光检测器。在光的检测是通过光子计数进行的情况下，以在规定时间内按每个测量单位时间(BIN TIME)逐次测量来到光检测器的光子的个数的方式执行光强度的测量。因而，在这种情况下，按时间序列的光强度的数据是按时间序列的光子计数数据。另外，可以在显微镜的台(未图示)设置用于移动微板9的水平方向位置以变更要观察的皿10的台位置变更装置17a。可以由计算机18控制台位置变更装置17a的动作。根据所述结构，在存在多个检体的情况下也能够达成迅速的测量。
[0061]并且，在上述的光分析装置的光学系统中，设置有用于通过光检测区域扫描样本溶液内的、即用于使焦点区域即光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构。作为所述的用于使光检测区域的位置移动的机构，例如图1的(C)示意性地例示的那样，可以采用变更反射镜7的朝向的反射镜偏转器17 (移动光检测区域的绝对位置的方式)。所述反射镜偏转器17可以与在通常的激光扫描型显微镜中装备的检电镜装置相同。或者，作为其它的方式，如图1的(D)所例示的那样，也可以使台位置变更装置17a进行动作以移动注入了样本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置来使样本溶液内的光检测区域的相对位置移动(使样本溶液的绝对位置移动的方式)。无论在哪种方式的情况下，都在计算机18的控制下，与光检测器16的光检测协调地驱动反射镜偏转器17或台位置变更装置17a以达成所期望的光检测区域的位置的移动图案。可以从圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合中任意地选择光检测区域的位置的移动轨迹(可以设为在计算机18中的程序中能够选择各种移动图案。)。此外，虽然没有图示，但也可以通过使物镜8或台上下移动来使光检测区域的位置在上下方向上移动。
[0062]在作为观测对象物的发光粒子通过多光子吸收而发光的情况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在这种情况下，只在激励光的焦点区域(光检测区域)释放光，因此可以去除针孔13。另外，在作为观测对象物的发光粒子不通过激励光而通过化学发光、生物发光现象发光的情况下，可以省略用于生成激励光的光学系统2?5。在发光粒子通过磷光或散射而发光的情况下，能够直接使用上述的共焦显微镜的光学系统。并且，在光分析装置I中，可以如图示那样设置多个激励光源2，可以设为能够根据发光粒子的激励波长而适当地选择激励光的波长。同样地，也可以具备多个光检测器16,在样本中包含有波长不同的多种发光粒子的情况下，可以设为能够根据其波长分别检测来自它们的光。并且，关于光的检测，可以使用向规定的方向偏振的光作为激励光，选择与激励光的偏振方向垂直的方向的成分作为检测光。在这种情况下，在激励光光路中插入偏振片(未图示)，在检测光光路中插入偏振分束器14a。根据所述结构，能够大幅地降低检测光中的背景光。
[0063]本发明的光分析技术的原理
[0064]如“
【发明内容】
” 一栏所记载的那样，如果清楚地进行描述，则在本发明的光分析技术中，在扫描分子计数法中，设定光检测处理的测量单位时间(光子计数的BIN TIME)使得在时序光强度数据上发光粒子的信号的大致吊钟状的轮廓的特征不会消失而能够高精度地检测发光粒子的信号，并且不会使数据量过大。下面，说明本发明的扫描分子计数法和测量单位时间的设定的原理。
[0065]1.扫描分子计数法的原理
[0066]FCS、FIDA等光谱分析技术与现有的生物化学的分析技术相比，其优点在于所需要的样本量极少且能够迅速地执行检查。然而，在FCS、FIDA等光谱分析技术中，在原理上，根据荧光强度的波动来估算发光粒子的浓度、特性，因此为了得到高精度的测量结果，要求如图11的(A)示意性地描绘的那样样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度为在荧光强度的测量过程中在光检测区域CV内始终存在一个左右的发光粒子的水平，如该图的右侧所示那样在测量时间中始终检测到有意义的光强度(光子计数)。如果发光粒子的浓度或数密度低于此水平，则例如图11的(B)所描绘的那样，在发光粒子为只是偶尔进入到光检测区域CV内的水平的情况下，如该图的右侧所例示的那样，只在测量时间的一部分出现有意义的光强度的信号(光子计数)，难以估算高精度的光强度的波动。另外，与在测量中在光检测区域内始终存在一个左右的发光粒子的水平相比发光粒子的浓度大幅降低的情况下，在光强度的波动的运算中容易受到背景的影响，为了得到足够进行运算的量的有意义的光强度数据而测量时间变长。
[0067]因此，本申请的 申请人:在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于新原理的“扫描分子计数法”，即使发光粒子的浓度低于如上所述的在FCS、FIDA等光谱分析技术中要求的水平的情况下，也能够检测发光粒子的数密度或浓度等特性。
[0068]作为在扫描分子计数法中执行的处理，如果清楚地描述，则驱动用于使光检测区域的位置移动的机构(反射镜偏转器17)来变更光路，或者移动注入了样本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置，来如图2的(A)示意性地描述的那样，一边使光检测区域CV的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域CV扫描样本溶液内，一边执行光检测。这样，例如在光检测区域CV移动的期间(图中为时间t0?t2)，在通过存在一个发光粒子的区域时(tl)，从发光粒子释放出光，如在图2的(B)中所描绘的那样，在按时间序列的光强度数据上出现有意义的光强度(Em)的脉冲状的信号。这样，执行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，一个一个地检测其间出现的如图2的(B)所例示的脉冲状的信号(有意义的光强度)，由此逐个检测发光粒子并对其个数进行计数，从而能够获取在所测量的区域内存在的发光粒子的个数、或者与浓度或数密度有关的信息。在所述的扫描分子计数法的原理中，不进行如荧光强度的波动的计算那样的统计性的运算处理，而是一个一个地检测发光粒子，因此即使在要观测的粒子的浓度低至通过FCS、FIDA等无法以足够的精度进行分析的程度的样本溶液中，也能够获取与粒子的浓度或数密度有关的信息。
[0069]2.测量单位时间设定的原理
[0070]在通过上述的扫描分子计数法由光检测器16经时获取到的光强度的数据(时序光强度数据)中，除了来自发光粒子的光的脉冲状的信号以外，还混入了由光检测器的热噪声、背景光等引起的噪声。因此，在基于时序光强度数据检测发光粒子的信号时，典型地是，参照在时序光强度数据中发现的脉冲状的信号的形状特征、例如峰值强度、宽度相对于高斯函数等吊钟型函数的形状的近似程度(拟合高斯函数时的相关系数)。而且，将具有针对发光粒子的脉冲信号设想的范围的形状特征的脉冲信号辨别为发光粒子的信号，将除此以外的脉冲信号辨别为噪声信号。
[0071]另外，在如上述那样的扫描分子计数法中的逐次执行的光测量中，光强度值是按每个规定的测量单位时间由光检测器接收到的光量。在光的测量通过光子计数进行的情况下，光强度用在以亚微秒~毫秒的等级任意设定的每个测量单位时间(BIN TIME)内到达光检测器并被检测出的光子的个数表示。因而，时序光强度数据实际上是将表示每个测量单位时间的光量或光子数的数据点按时间序列排列而得到的，因此在此处出现的发光粒子的信号的轮廓根据测量单位时间或BIN TIME的长度而变化。即，测量单位时间或BIN TIME的长度越长，发光粒子的脉 冲信号的形状特征越消失而难以高精度地执行发光粒子的信号与噪声信号之间的辨别。这样，为了进行高精度的发光粒子的信号与噪声信号之间的辨别，只要使测量单位时间或BIN TIME的长度与发光粒子的信号的长度相比足够短以能够捕捉发光粒子的信号的形状特征即可。然而，测量单位时间或BIN TIME的长度越短，数据点数越多，数据量越庞大，会导致数据处理负荷、成本的增大。
[0072]因此，在本发明中，将光测量时的测量单位时间或BIN --ΜΕ的长度设定成能够根据发光粒子的信号的形状特征执行发光粒子的信号与噪声信号之间的辨别且不会使数据点数无用地增大。图2的(C)示出了发光粒子的脉冲信号的轮廓Ik和长度Tp与测量单位时间△ τ的关系。参照该图，首先，在测量单位时间比发光粒子的脉冲信号的长度Tp长的情况下，即
[0073][i]Tp < Δ τ I
[0074]的情况下，针对发光粒子的脉冲信号的轮廓Ik，数据点Dp仅为一点。在这种情况下，发光粒子的脉冲信号的轮廓的大致吊钟状的特征消失，信息仅为强度值的大小，因此根据发光粒子的脉冲信号的形状特征检测发光粒子的脉冲信号是非常难的。另外，在测量单位时间为
[0075][ii]Tp > Δ τ 2 ^ 1/2Τρ
[0076]时，针对发光粒子的脉冲信号的轮廓Ik，数据点Dp为两点，但是在这种情况下，在数据点Dp的值中大致吊钟状的特征、即值沿着时间方向按照小、大、小的顺序变化的特征消失，因此也难以根据发光粒子的脉冲信号的形状特征来检测发光粒子的脉冲信号。另一方面，在测量单位时间比发光粒子的脉冲信号的长度Tp的1/2还短的情况下，即在测量单位时间为[0077][iii] l/2Tp > Δ τ 3 ≥1/3Τρ、
[0078][?ν] 1/3Τρ > Δ τ 4 ≥ 1/4Τρ、
[0079][V] 1/4Τρ > Δ τ 5 ≥ 1/5Τρ、
[0080]…以下相同。
[0081]时，数据点Dp至少为三点，保存值沿着时间方向按照小、大、小的顺序变化的大致吊钟状的特征，能够根据发光粒子的脉冲信号的形状特征检测发光粒子的脉冲信号。
[0082]实际上，根据后面说明的实施例1中的实验结果，在被检测为发光粒子的信号的脉冲信号中，在各信号的产生期间内包含至少三点以上的数据点Dp。这样，基于上述的考察和实施例1的实验结果，只要将测量单位时间的长度设定为在发光粒子的脉冲信号的产生时间内包含三点以上的数据点Dp即可。在此，发光粒子的脉冲信号的产生时间相当于发光粒子通过光检测区域内的时间。另外，一个数据点对应一个测量单位时间。因而，结果是只要将测量单位时间的长度设定为一个发光粒子通过光检测区域时的通过时间与至少三个测量单位时间相重叠即可。此外，对于所述条件，应该理解发光粒子的通过时间也可以不是三个测量单位时间的和以上。在上述条件中，重要的是在发光粒子的通过时间内存在三个以上的数据点，因此只要满足该条件，三个测量单位时间之和也可以超过发光粒子的通过时间，这种情况也属于本发明的范围。并且，根据后面说明的实施例1中的实验结果，在发光粒子的脉冲信号的产生时间内包含四点以上的数据点Dp的情况下能够更高精度地进行检测。因而，可以将测量单位时间的长度设定为在一个发光粒子通过光检测区域时的通过时间内包含四点以上的数据点Dp。(即，可以将测量单位时间的长度设定为一个发光粒子通过光检测区域时的通过时间与至少四个测量单位时间相重叠。)。
[0083]可以根据光检测区域的大小和光检测区域的移动速度来进行测量单位时间或BINTIME的具体设定。如“
【发明内容】
”一栏所记载的那样，在理论上，作为适当的测量单位时间或BIN --ΜΕ的基准的发光粒子的信号的长度、即一个发光粒子通过光检测区域时的通过时间通过下式给出，
[0084][光检测区域的大小]/[光检测区域的移动速度]…(I)
[0085]因此可以参照所述理论值适当地决定测量单位时间或BIN --ΜΕ。如从上述的式(I)理解的那样，光检测区域的大小越大，发光粒子的通过时间越长，光检测区域的移动速度越高，发光粒子的通过时间越短，因此可以与其相应地增加和减少测量单位时间或BINTIME0
[0086]此外，关于上述的式(I)，能够根据光检测区域的轨迹和周期高精度且唯一地估算光检测区域的移动速度，但是光检测区域的大小需要是发光粒子在光检测区域内的轨迹的距离，即是与光检测区域的移动方向(扫描方向)平行的方向上的长度，根据光检测区域内的发光粒子的通过位置而不同。如图2的(D)所示那样，光检测区域是球体或椭圆体，因此与横穿球体或椭圆体的距离相当的式(I)中的[光检测区域的大小]根据光检测区域的与扫描方向垂直的方向上的位置而不同。例如，在图2的(D)中，发光粒子α、β、Y的通过距离依次变短。另外，还难以严格地定义光检测区域的边界。即，在以激励光的聚光状态(以及针孔的直径)划定光检测区域时，在理论上不容易高精度地确定激励光强度(或检测光强度)实质为O的边界。因此，作为光检测区域的边界，可以采用光检测区域内的光强度为中心强度的Ι/e2的球面或椭圆面CVn。而且，光检测区域的光强度为中心强度的Ι/e2的球面或椭圆面的直径2Wo大致通过下式给出，
[0087]2ffo = 1.22.λ /(D/2f)…(2)
[0088](在此，λ是激励波长，D是入射光束直径，f是物镜的焦距。)。因而，可以将使用通过式(2)计算出的值作为光检测区域的大小的估计值而根据式(I)计算出的值作为一个发光粒子通过光检测区域时的通过时间(即，发光粒子的脉冲信号的长度Tp)的估计值(估计通过时间)进行参照，来决定测量单位时间或BIN --ΜΕ。在根据估计通过时间决定测量单位时间或BIN TIME时，如已经记述的那样，一个发光粒子通过光检测区域时的通过时间应该包含至少三个数据点，因此可以将测量单位时间或BIN --ΜΕ设定为例如小于估计通过时间的一半，优选的是1/3左右。或者，也可以将测量单位时间或BIN --ΜΕ决定成在估计通过时间内包含至少三个数据点。另外，考虑到发光粒子的通过位置越靠近光检测区域的周缘则通过时间越短，从而为了更可靠地检测通过光检测区域的周缘的发光粒子的信号，可以参考估计通过时间，将测量单位时间或BIN --ΜΕ设定为与估计通过时间的1/3相比充分短的时间、例如其1/6左右的时间等使得在通过光检测区域的周缘的发光粒子的通过时间内包含至少三个数据点。当然，一个发光粒子通过光检测区域时的通过时间也能够预先通过实验来决定，因此也可以决定测量单位时间或BIN --ΜΕ使得在通过实验获得的发光粒子的通过时间内包含至少三个数据点。
[0089]扫描分子计数法的处理操作过程
[0090]在依照使用了图1的(A)所例示的光分析装置I的本发明的扫描分子计数法的实施方式中，具体地说 ，执行以下的处理，(1)包含发光粒子的样本溶液的调制，(2)样本溶液的光强度的测量处理以及(3)测量出的光强度的分析处理。图3示出了以流程图的形式表示的本实施方式中的处理。
[0091](1)样本溶液的调制
[0092]作为本发明的光分析技术的观测对象物的粒子，如果是溶解的分子等在样本溶液中分散并在溶液中随机运动的粒子，则可以是任意的，例如可以是蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞、或金属胶体、其它非生物学分子等。在作为观测对象物的粒子不是发光的粒子的情况下，使用以任意的方式对作为观测对象物的粒子附加了发光标识(荧光分子、磷光分子、化学、生物发光分子)的粒子。样本溶液典型地是水溶液，但是不限定于此，可以是有机溶剂及其它任意的液体。
[0093](2)样本溶液的光强度的测量(图3-步骤100)
[0094]本实施方式的利用扫描分子计数法的光分析中的光强度的测量除了在测量过程中驱动反射镜偏转器17或台位置变更装置17a来进行光检测区域的位置在样本溶液内的移动(样本溶液内的扫描)以外，可以通过与FCS或FIDA中的光强度的测量过程相同的方式执行。在操作处理中，典型地是，在向微板9的皿10注入样本溶液并载置在显微镜的台上后，在使用者向计算机18输入开始测量的指示时，计算机18依照存储在存储装置(未图示)中的程序(使光检测区域的位置在样本溶液内移动的过程和在光检测区域的位置的移动过程中检测来自光检测区域的光并生成按时间序列的光强度数据的过程)，开始样本溶液内的光检测区域中的激励光的照射以及光强度的测量。在所述测量中，在依照计算机18的程序的处理动作的控制下，反射镜偏转器17或台位置变更装置17a驱动反射镜7 (检电镜)或显微镜的台上的微板9，来执行皿10内光检测区域的位置的移动，与此同时地，光检测器16将逐次检测出的光变换为电信号并发送到计算机18，在计算机18中，通过任意的方式，根据所发送的信号生成按时间序列的光强度数据并保存。此外，典型地是，光检测器16是能够检测单光子的到来的超高灵敏度光检测器，因此在通过光子计数进行光的检测的情况下，时序光强度数据可以是按时间序列的光子计数数据。如上述那样适当地设定光子计数中的BIN TIME使得在估计通过时间或通过实验得到的粒子的通过时间内包含至少三个数据点。
[0095]光强度的测量中的光检测区域的位置的移动速度可以是任意地、例如通过实验或为了符合分析的目的而设定的规定的速度。在根据检测出的发光粒子的个数获取与其数密度或浓度有关的信息的情况下，需要光检测区域通过的区域的大小或体积，因此以掌握移动距离的方式执行光检测区域的位置的移动。此外，由于测量中的经过时间与光检测区域的位置的移动距离具有比例关系更容易解释测量结果，因此优选的是移动速度基本上是固定速度，但是不限定于此。
[0096]另外，关于光检测区域的位置的移动速度，为了定量地高精度地执行基于测量出的按时间序列的光强度数据的发光粒子的逐个检测、或者发光粒子的个数的计数，而优选将所述移动速度设定为比发光粒子的随机运动、即布朗运动所引起的移动速度快的值。发明的光分析技术的观测对象粒子是在溶液中分散或溶解并自由且随机运动的粒子，因此由于布朗运动，位置随着时间而移动。因而，在光检测区域的位置的移动速度比粒子的布朗运动所引起的移动慢的情况下，如图4的(A)示意性地描绘的那样，粒子在区域内随机地移动，由此光强度随机地变化(如已经提及的那样，光检测区域的激励光强度以区域的中心为顶点向外方降低。)，难以确定与各个发光粒子对应的有意义的光强度的变化。因此，优选的是将光检测区域的位置的移动速度设定得比粒子的因布朗运动引起的平均移动速度(扩散移动速度)快，使得如图4的(B)所描绘的那样粒子大致直线地横穿光检测区域，由此在按时间序列的光强度数据中，如图4的(C)最上部所例示的那样与各个发光粒子对应的光强度的变化的轮廓大致一致(在发光粒子大致直线地通过光检测区域的情况下，光强度的变化的轮廓与激励光强度分布大致相同。)，而能够容易地确定各个发光粒子与光强度之间的对应。
[0097]具体地说，具有扩散系数D的发光粒子由于布朗运动而通过半径Wo的光检测区域(共焦区组织)时所需要的时间根据以下的平均平方位移的关系式，
[0098](2Wo)2 = 6D.At...(3)
[0099]成为
[0100]At = (2Wo)2/6D…⑷，
[0101]因此，发光粒子因布朗运动而移动的速度(扩散移动速度)Vdif大致为
[0102]Vdif = 2ffo/ At = 3D/Wo…(5)。
[0103]因此，光检测区域的位置的移动速度可以参照所述Vdif设定为与其相比充分快的值。例如在预想观测对象粒子的扩散系数是D=2.0X IO^1V/s左右的情况下，在设Wo为
0.62μπι左右时，Vdif为1.0X 10_3m/s，因此，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为其10倍以上的15mm/s等。此外，在观测对象粒子的扩散系数未知的情况下，可以设定各种光检测区域的位置的移动速度，反复执行用于找到使光强度的变化的轮廓为预想的轮廓(典型地是与激励光强度分布大致相同)的条件的预备实验，来决定适合的光检测区域的位置的移动速度。
[0104](3)光强度的分析
[0105]当通过上述处理得到时序光强度数据时，在计算机18中，通过依照存储在存储装置中的程序的处理，执行发光粒子的信号的检测、发光粒子的计数、浓度计算等各种分析。
[0106](i)发光粒子的信号的逐个检测(步骤110~160)
[0107]当生成时序光强度数据时，执行在所述光强度数据上逐个检测发光粒子的信号的处理。如已经提及的那样，在一个发光粒子通过光检测区域时的轨迹如图4的(B)所示那样是大致直线状的情况下，与该粒子对应的信号中的、在光强度数据上的光强度的变化具有反映由光学系统决定的光检测区域内的光强度分布的大致吊钟状的轮廓。因而，在扫描分子计数法中，基本上可以在光强度数据上超过适当设定的阈值Ith的光强度值所持续的时间宽度△ τ处于规定的范围时，判断为具有该光强度的轮廓的信号与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测。而且，光强度不超过阈值Ith、或者时间宽度Λ τ不在规定的范围内的信号被判断为噪声或异物的信号。另外，在能够将光检测区域的光强度分布假定为高斯分布，即
[0108]I = A.eXp (_2t2/a2)...(6)时，
[0109]在使式(6)拟合有意义的光强度的轮廓(能够明确地判断为不是背景的轮廓)而计算出的强度A和宽度a处于规定的范围内时，可以将该光强度的轮廓判断为与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测。(强度A和宽度a处于规定的范围外的信号被判断为噪声或异物的信号，在其后的分析等中可以忽略。)
[0110]在光强度数据上的信号的检测处理的一个例子中，首先，对光强度数据(图4的
(C)、最上部“检测结果(未处理)”)`进行平滑(平滑化)处理(图3-步骤110、图4的(C)的中上部“平滑”)。发光粒子所发出的光是概率性地释放的，在微小的时间内可能产生数据值的缺失，因此通过所述平滑处理，能够忽略如上所述的数据值的缺失。例如可以通过移动平均法进行平滑处理。此外，可以根据获取光强度数据时的光检测区域的位置的移动速度(扫描速度)、ΒΙΝ--ΜΕ，适当地设定执行平滑处理时的参数、例如在移动平均法中进行一次平均的数据个数、移动平均的次数等。
[0111]接着，在平滑处理后的时序光强度数据中，为了检测有意义的脉冲状的信号(以下称为“脉冲信号”)所存在的时间区域(脉冲存在区域)，对平滑处理后的光强度数据的时间计算一次微分值(步骤120)。光强度数据的时间微分值如图4的(C)的中下部“时间微分”所例示的那样，在信号值变化的时刻值的变化大，因此通过参照所述时间微分值，能够有利地决定有意义的信号的起点和终点。
[0112]然后，在光强度数据上逐次检测有意义的脉冲信号(步骤130~160)。具体地说，首先在光强度数据的时间微分值数据上，参照时间微分值逐次搜索并决定一个脉冲信号的起点和终点，确定脉冲存在区域(步骤130)。当确定了一个脉冲存在区域时，针对该脉冲存在区域中的平滑后的光强度数据进行吊钟型函数的拟合(图4的(C)的下部“吊钟型函数拟合”)，计算吊钟型函数的脉冲的峰值(最大值)的强度Ipeak、脉冲宽度(半峰全宽)Wpeak、拟合时的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。此外，拟合的吊钟型函数典型地是高斯函数，但也可以是洛仑兹型函数。而且，判断计算出的吊钟型函数的参数是否处于对针对一个发光粒子通过光检测区域时检测出的脉冲信号所描绘的吊钟型轮廓的参数所设想的范围内，即脉冲的峰值强度、脉冲宽度、相关系数是否分别处于规定范围内等(步骤150)。这样，如图5的左边所示那样，将被判断为计算出的吊钟型函数的参数处于针对与一个发光粒子对应的信号设想的范围内的信号判断为是与一个发光粒子对应的信号，由此，检测出一个发光粒子。另一方面，如图5的右边所示那样，计算出的吊钟型函数的参数不在设想的范围内的脉冲信号作为噪声而被忽略。此外，可以在检测发光粒子的信号的同时执行信号数的计数、即发光粒子的计数。
[0113]可以在光强度数据的整个区域中反复执行上述步骤130~150的处理中的脉冲信号的搜索和判断(步骤160)。此外，根据光强度数据逐个检测发光粒子的信号的处理不限于上述的过程，可以通过任意的方法执行。
[0114](iii)发光粒子浓度的确定
[0115]在对检测出的发光粒子的信号的个数进行计数来确定了发光粒子的个数的情况下，如果通过任意的方法能够估算光检测区域所通过的区域的总体积，则根据其体积值和发光粒子的个数能够决定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度(步骤170)。
[0116]光检测区域所通过的区域的总体积可以根据激励光或检测光的波长、透镜的数值孔径、光学系统的调整状态在理论上进行估算，但是也可以根据通过实验、例如针对发光粒子的浓度已知的溶液(对照溶液)以与要检查的样本溶液的测量相同的条件进行上述所说明的光强度的测量、发光粒子的检测以及计数而检测出的发光粒子的个数和对照溶液的发光粒子的浓度来决定。具体地说，例如当针对发光粒子的浓度C的对照溶液，将对照溶液的发光粒子的检测数设为N时，光检测区域所通过的区域的总体积Vt通过下式给出。
[0117]Vt = N/C— (7) ο
[0118]另外，可以准备发光粒子的浓度不同的多个溶液作为对照溶液，针对多个溶液分别执行测量，采用计算出的Vt的平均值作为光检测区域所通过的区域的总体积Vt。而且，当给出Vt时，发光粒子的计数`结果为η的样本溶液的发光粒子的浓度c通过下式给出。
[0119]c = n/Vt …⑶。
[0120]此外，可以不依据上述的方法而通过任意的方法、例如通过利用FCS、FIDA等给出光检测区域的体积、光检测区域所通过的区域的总体积。另外，在本实施方式的光分析装置中，可以针对所设想的光检测区域的移动图案，将针对各种标准的发光粒子的浓度C与发光粒子的个数N之间的关系(式(7))的信息预先存储到计算机18的存储装置中，在装置的使用者实施光分析时能够适当地利用所存储的关系的信息。
[0121]为了验证上述说明的本发明的有效性，如下那样进行了实验。此外，应该理解为以下的实施例用于例示本发明的有效性，而并不是限定本发明的范围。
[0122]实施例1
[0123]在扫描分子计数法中对光检测处理中的测量单位时间进行各种变更来验证测量单位时间针对发光粒子信号的检测的影响。
[0124]作为样本溶液，调制出在磷酸缓冲液(包含0.l%PluronicF-127)中作为发光粒子包含IOpM的荧光色素ATT0633 (ATTO-TEC)的溶液。在光的测量中，作为光分析装置，利用具备共焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测量装置MF20(奥林巴斯株式会社)，依照在上述的“(2)样本溶液的光强度的测量”中所说明的方式，针对上述样本溶液获取了时序光强度数据(光子计数数据)。此时，激励光使用633nm的激光，利用带通滤波器测量660nm-710nm的波长频带的光并生成时序光子计数数据。将激励光的激光功率设为200 μ W。将样本溶液中的光检测区域的位置的移动速度设为15mm/s JfBIN --ΜΕ设为lys，进行了 I秒钟的测量。
[0125]在光测量后的数据处理中，首先，对于所获取到的时序光子计数数据，以BIN TIME分别为10μ s、20l.! s、30l.! s、50l.! sUOOy s的方式重新构成时序光子计数数据(例如，BINTIME为10 μ s的重构数据是在BIN TIME Slys的数据点处将10点的光子数相加而生成I点的数据点。)。接着，针对重新构成的各个时序光子计数数据进行发光粒子的信号的逐个检测和信号数的计数。发光粒子的信号的检测依照“(i)发光粒子的信号的逐个检测”以及图3的步骤110~160所记载的要点，对时序光子计数数据实施平滑处理，在平滑后的数据中决定脉冲信号的起点和终点，之后通过最小二乘法使高斯函数拟合各脉冲信号，确定(高斯函数中的)峰值强度、脉冲宽度(半峰全宽)、相关系数。然后，只抽出满足下述的条件的脉冲信号作为发光粒子的信号，
[0126]20 μ s< 脉冲宽度〈400 μ S
[0127]峰值强度>1 [pc/ΙΟ μ s]...(A)
[0128]相关系数>0.90
[0129]对其信号数进行计数。
[0130]表1示出了在重新构成的各个时序光子计数数据中被检测为发光粒子信号的信号数和重构数据的数据量。
[0131][表1]
【权利要求】
1.一种光分析装置，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析装置的特征在于，包括: 光检测区域移动部，其使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 光检测部，其按每个测量单位时间检测来自上述光检测区域的光量；以及 信号处理部，其生成一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边由上述光检测部按每个上述测量单位时间检测出的来自上述光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在上述按时间序列的光强度数据中逐个检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号， 其中，上述测量单位时间根据上述光检测区域的大小和位置的移动速度来决定。
2.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 上述光检测区域的大小越大，上述测量单位时间被设定得越长，上述移动速度越高，上述测量单位时间被设定得越短。
3.根据权利要求1或2所述的光分析装置，其特征在于， 上述测量单位时间小于一个发光粒子通过上述光检测区域时的估计通过时间的一半。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述测量单位时间被设定成一个发光粒子通过上述光检测区域时的通过时间与至少三个上述测量单位时间相重叠。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的光分析装置，其特征在于，` 上述信号处理部对逐个检测出的表示来自上述发光粒子的光的信号的个数进行计数来对在上述光检测区域的位置的移动过程中检测出的上述发光粒子的个数进行计数。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述光检测区域移动部使上述光检测区域的位置以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述光检测区域移动部通过变更上述光学系统的光路来使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动。
8.根据权利要求1至7中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部在检测出具有大于规定阈值的强度的表不光的信号时，检测出一个发光粒子进入了上述光检测区域。
9.根据权利要求1至8中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部使上述按时间序列的光强度数据平滑化，将平滑化后的上述按时间序列的光强度数据中具有超过上述规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个上述发光粒子的光的信号。
10.根据权利要求1至9中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部根据检测出的上述发光粒子的个数来确定上述样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
11.一种光分析方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析方法的特征在于，包括以下过程: 使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动；一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边按每个测量单位时间检测来自上述光检测区域的光量，生成按时间序列的光强度数据；以及 逐个检测上述按时间序列的光强度数据中的各个表示来自各个发光粒子的光的信号， 其中，根据上述光检测区域的大小和位置的移动速度来决定上述测量单位时间。
12.根据权利要求11所述的光分析方法，其特征在于， 上述光检测区域的大小越大，将上述测量单位时间设定得越长，上述移动速度越高，将上述测量单位时间设定得越短。
13.根据权利要求11或12所述的光分析方法，其特征在于， 上述测量单位时间小于一个发光粒子通过上述光检测区域时的估计通过时间的一半。
14.根据权利要求11至13中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 将上述测量单位时间设定成一个发光粒子通过上述光检测区域时的通过时间与至少三个上述测量单位时间相重叠。
15.根据权利要求11至14中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 还包括以下过程:对逐个检测出的表示来自上述发光粒子的光的信号的个数进行计数来对在上述光检测区域的位置的移动过程中检测出的上述发光粒子的个数进行计数。
16.根据权利要求11至15中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 在使上述光检测区域的位置移动的过程中，使上述光检测区域的位置以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。
17.根据权利要求11至16中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 在使上述光检测区域的位置移动的过程中，通过变更上述光学系统的光路来使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动。
18.根据权利要求11至17中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 在逐个检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号的过程中，在检测出具有大于规定阈值的强度的表示光的信号时，检测出一个发光粒子进入了上述光检测区域。
19.根据权利要求11至18中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 在逐个检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号的过程中，使上述按时间序列的光强度数据平滑化，将平滑化后的上述按时间序列的光强度数据中具有超过上述规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个上述发光粒子的光的信号。
20.根据权利要求11至17中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 还包括以下过程:根据检测出的上述发光粒子的个数来确定上述样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
21.一种光分析用计算机程序，用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析用计算机程序的特征在于，使计算机执行以下步骤: 使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 在上述样本溶液内的上述光检测区域的位置的移动过程中，按根据上述光检测区域的大小和位置的移动速度而决定的每个测量单位时间，检测来自上述光检测区域的光量，生成按时间序列的光强度数据；以及 逐个检测上述按时间序列的光强度数据中的各个表示来自各个发光粒子的光的信号。
22.根据权利要求21所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 上述光检测区域的大小越大，将上述测量单位时间设定得越长，上述移动速度越高，将上述测量单位时间设定得越短。
23.根据权利要求21或22所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 上述测量单位时间小于一个发光粒子通过上述光检测区域时的估计通过时间的一半。
24.根据权利要求21至23中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 将上述测量单位时间设定成一个发光粒子通过上述光检测区域时的通过时间与至少三个上述测量单位时间相重叠。
25.根据权利要求21至24中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 还使计算机执行以下步骤:对逐个检测出的表示来自上述发光粒子的光的信号的个数进行计数来对在上述光检测区域的位置的移动过程中检测出的上述发光粒子的个数进行计数。
26.根据权利要求21至25中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 在使上述光检测区域的位置移动的步骤中，使上述光检测区域的位置以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。
27.根据权利要求21至26中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 在使上述光检测区域的位置移动的步骤中，通过变更上述光学系统的光路来使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动。
28.根据权利要求21至27中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 在逐个检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号的上述步骤中，在检测出具有大于规定阈值的强度的表示光的信号时，检测出一个发光粒子进入了上述光检测区域。
29.根据权利要求21至28中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 在逐个检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号的上述步骤中，使上述按时间序列的光强度数据平滑化，将平滑化后的上述按时间序列的光强度数据中具有超过上述规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个上述发光粒子的光的信号。
30.根据权利要求21至29中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 还使计算机执行以下步骤:根据检测出的上述发光粒子的个数来确定上述样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
【文档编号】G01N21/64GK103765197SQ201280042499
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年7月3日 优先权日:2011年8月30日
【发明者】中田秀孝, 田边哲也 申请人:奥林巴斯株式会社