调节t细胞和识别、获得、以及用于治疗基于免疫的紊乱的方法

调节t细胞和识别、获得、以及用于治疗基于免疫的紊乱的方法
【专利摘要】本申请说明书公开了：调节T细胞，包括调节T细胞的组合物，识别、分离、富集、获得、和/或扩展调节T细胞或其子集种群的方法，包括可用于进行这种方法的组分的试剂盒，以及治疗个体中基于免疫的紊乱的方法，所述治疗是将调节T细胞或者包含这种调节T细胞的组合物给药于需要其的个体。
【专利说明】调节T细胞和识别、获得、以及用于治疗基于免疫的紊乱的方法
发明人:卡洛斯.A.加西亚桑塔纳【背景技术】
[0001]T细胞或者T淋巴细胞属于一组被称为淋巴细胞的白细胞，并且在细胞调节免疫中起着重要作用。它们可以通过在其细胞表面上存在的被称为T细胞受体(TCR)的特殊受体，而被区别于另一个淋巴细胞类型比如非胸腺依赖性细胞(B细胞)。已经发现数个不同的T细胞子集，每个子集都具有独特的功能，包括T辅助细胞(TH细胞)、细胞毒性T细胞(Tc细胞、或CTLs)、包括中心储存T细胞(TCM细胞)和效应物记忆T细胞(TEM细胞)在内的记忆T细胞(TM细胞)、天然杀伤细胞(NKT细胞)、gammadeltaT细胞U δ T细胞)、以及调节T细胞(Treg细胞)。
[0002]调节T细胞，亦称为抑制T细胞，是一个特殊的T细胞亚群，具有抑制其他细胞的免疫反应的作用。例如，Treg细胞在免疫反应期间在抑制受T细胞调节的免疫性中、并且在抑制自身反应性T细胞中扮演着主要角色，所述自身反应性T细胞逃避了在胸腺中阴性筛选的工序。这种情况下，Ireg细胞提供了重要的“自检”，以抑制过度的免疫原反应，因此是对于保持免疫系统体内平衡和自身抗原耐受性很关键。
[0003]两个主要类别的TMg细胞是自然产生的TMg细胞和适应性TMg细胞(adaptiveTregcells) 0自然产生的Treg细胞(亦称⑶4+⑶25+FOXP3+Treg细胞)出现在胸腺中，并且已经被与在同时具有髓细胞样(CDllc + )树状细胞和浆细胞样(CD123+)树状细胞的生长中的T细胞之间的相互作用联系上，这些树状细胞已经用TSLP激活。适应性TMg细胞(包括Trl细胞、Th2细胞、Th3细胞、以及Thl7细胞)似乎来自于正常免疫反应期间的外周组织，.并且似乎可促进TMg细胞发展和功能。
[0004]适应性TMg细胞具有许多自然产生的TMg细胞的属性，但可能在决定性的细胞表面生物标志物和功能属性方面有差异。例如，已经描述了 Trl细胞和Th3细胞可分别产生IL-10和TGFii。这些结果导致产生了新颖的免疫疗法，作为在小鼠体内分离、富集、以及扩展该细胞子集的能力，导致新颖的在免疫学疾病中的治疗性介入。
[0005]自然产生的T,eg细胞鉴别为自体耐受性的重要成分已经打开了免疫学和控制物免疫耐受性的基本过程研究中的主要领域。调节T细胞具有独特和稳固的治疗轮廓。该细胞需要受特异性T细胞受体(TCR)调节的活化来扩大调节活性，但它们的效应物功能好象是非特异性的，通过细胞-细胞接触与抑制性细胞因子生产的组合可调节局部炎症反应。许多研究已经显示了在自身免疫疾病、移植、以及移植物抗宿主疾病(graft, vs.-hostdiseases)中自然产生的TMg细胞在抑制病理学免疫反应中的有效影响。然而，在人类中自然产生的TMg细胞的研究和应用的主要障碍一直是缺乏特定的细胞表面生物标志物，用来限定T咒g细胞，并且将T,eg细胞与T细胞的其它子集例如TH细胞、Tc细胞、TCM细胞、TEM细胞相分离，以及用来区分不同的TMg细胞亚群。
[0006]在研究中使用许多不同的方法来识别、分离、富集、或利用Ireg细胞。最广泛使用的用于自然产生的T,eg细胞的标志物是分化簇4(CD4)、分化簇25(CD25)、叉头/翼-螺旋转录因子盒p3(FoxP3)、与细胞毒性T淋巴细胞相关的抗原4(CTLA-4)、与糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族有关的基因(GITR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)、以及分化簇127 (⑶127)。不幸的是，累积的证据建议，上述所列标志物并不是严格地Ireg细胞特异性的。例如，⑶25和⑶4表面标志物(⑶4+CD25+细胞)的高表达最初被用于识别自然产生的T,eg细胞。然而，在Th细胞、以及TM细胞亚群上也表达⑶4。在免疫激活设定中比如在对病原体的免疫反应期间，在非调节T细胞上也表达⑶25。这样，按照⑶4和⑶25表达来定义，Terg细胞包括大约5.10%的成熟TH细胞。FoxP3的细胞表达的额外测定使得可以进行更多的自然产生的T,eg细胞(⑶4+CD25+FOXP3+细胞)的专一性分析。然而，FoxP3在被激活的Tem细胞中也被瞬时表达，并且人们已经很好地记录了大多数人类⑶4+和⑶8+T细胞在激活时可瞬时表达FoxP3，包括⑶4+CD25ffi/_T细胞、Th细胞、Tc细胞、以及记忆T细胞。另外，FoxP3是细胞核标志物，需要在染色之前的细胞膜透化。这种情况下，该生物标志物的使用排除了后续加工步骤，比如分离、筛选、富集、或者扩展能生存的自然产生的TMg细胞用于功能研究或者用于免疫疗法。
[0007]已经建议加入⑶127可以用于区分人类身上自然产生的Treg细胞(其显示出⑶127 ffi/_表达模式)和TH细胞(其显示出⑶127+表达模式)。然而，最近报道说在激活时大多数的⑶4+T细胞可下调⑶127。另外，⑶127损失是T卵泡辅助细胞(--Η细胞)的特征要素，其有助用于在人类扁桃体上的B细胞。CTLA-4是T细胞激活的负调控子，其在激活2-3天后在所有的⑶4+和⑶8+T细胞上被上调。类似地，在TEM细胞中在激活时可诱导GITR和LAG-3的表达。因此，所有目前使用的Treg细胞生物标志物(CD25、CTLA_4、GITR、⑶127、LAG-3、GARP和FoxP3)表现为一般的T细胞激活标志物。这种情况下，这些生物标志物并不表现为TMg细胞特异性的，因此其用于将自然产生的TMg细胞与其他的T细胞子集比如被激活的TH细胞区别开来是不可靠的。因此，在当前的生物标志物研究中很可能有许多自然的和适应性的调节T细胞被错过，让人怀疑与在特定的自身免疫设定中的不足或者缺陷有关的结论。
[0008]因此有必要开发改进的用于识别、分离、富集、以及扩展免疫抑制性调节T细胞种群的方法、以及用于调整个体中免疫反应的方法。另外，有必要开发包含免疫抑制性调节T细胞种群的组合物、以及这种混合物用于调整个体中免疫反应的用途。最后，有必要开发包含生物标志物和/或对进行上述方法有用的其它成分的试剂盒。

【发明内容】

[0009]本发明公开涉及如下发现:分化簇6(CD6)在一般来讲识别免疫抑制性调节T细胞中、以及在当与另一种生物标志物结合使用时识别不同的免疫抑制性调节T细胞亚群中，是尤其有用的生物标志物。
[0010]因此，本申请说明书的一些方面公开了一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测CD6生物标志物的细胞表达水平，其中包含CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。在一个方面，一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，所述至少两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物；其中包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。在另一个方面，一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平,所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；其中包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
[0011]在另一个方面，一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:使包含T细胞种群的样品与⑶6生物标志物配体相接触；筛选T细胞种群，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；并且其中包含⑶6 ?卜表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。在另一个方面，一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触，，其中所述至少两种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物；并且其中包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。在又一个方面，一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触,其中所述至少三种不同生物标志物配体包括⑶4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物和⑶6生物标志物；并且其中包含⑶4+⑶25+⑶6ffi/-表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
[0012]样品可以包含从血液获得的T细胞，比如从周围血液单核细胞(PBMC)、淋巴、胸腺、骨髓、或任何所关注的特定组织/脏器样品分离出来，所述组织脏器样品包括、但不限于胰腺、眼睛、心脏、肝脏、神经、肠、皮肤、肌肉、软骨、韧带、滑液、和/或关节。可以使用的其他生物标志物包括:⑶127生物标志物、分化簇49d (⑶49d)生物标志物、分化簇38 (⑶38)生物标志物、分化簇45RA (⑶45RA)生物标志物、人类白细胞抗原血清型DR (HLA-DR)生物标志物、FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、GITR生物标志物、LAG-3生物标志物、胞外核苷酸酶(⑶39)生物标志物、Ikaros家族锌指(zinc-finger)核内蛋白成员(Helios)生物标志物、孤儿受体FcRL3 (FcRL3)生物标志物、细胞因子受体7 (CCR7或者⑶197)生物标志物、细胞因子受体4(CCR4或者⑶194)生物标志物、细胞因子受体8 (CCR8或者CDwl98)、分化簇⑶62L(⑶62L)生物标志物、可诱导的T细胞共刺激物(ICOS或者CDw198)生物标志物、分化簇103 (⑶103)生物标志物、程序死亡-1(PD-1)生物标志物、肿瘤坏死因子受体超家族0X40成员(⑶134)生物标志物、糖蛋白.A重复特优种(GARP)生物标志物、分化簇45RB (⑶45RB)生物标志物、分化簇45R0 (⑶45R0)生物标志物、分化簇95 (⑶95)生物标志物、分化簇122 (⑶122)生物标志物、分化簇147 (⑶147)生物标志物、分化簇8 (⑶8)生物标志物、或它们的任何组合。这些附加的生物标志物的使用在识别免疫抑制性调节T细胞亚群中尤其有用。这些被公开的生物标志物可以是抗体或者配体，并且可以被标记或者未被标记。如果被标记，生物标志物可以用如下物质标记:突光基团、量子点(quantum dot)、磷光基团(phosphore)、化学发光化合物、生物发光化合物、显色化合物、同位素化合物比如镧系元素、放射性同位素、酶、生物素或者亲和素分子、或任何对于检测被生物标志物结合的细胞有用的其他标记物。在本文中公开了识别步骤，包括样品和有用的生物标志物。识别步骤可以使用被标记的生物标志物，使用流式细胞仪、细胞分类器、磁粉/磁珠、补体溶解(complement lysis)、细胞淘选(cell panning)或者其它为本领域的普通技术人员所熟知的用于分离或者富集细胞的方法。在另一个方面，本文公开的方法具有的附带条件是:用于筛选样品的生物标志物不包括FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、或者FoxP3生物标志物和CTLA-4生物标志物两者。在此公开的方法可以进一步包括分离或者富集被识别的免疫抑制性调节T细胞种群。在此公开的方法可以进一步包括扩展被识别的、分离或者富集的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0013]本申请说明书的其它方面公开了一种获得免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测在此公开的CD6生物标志物的细胞表达水平；以及分离包含CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。在一个方面，一种获得免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，所述至少两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物以及分离包含⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。在另一个方面，一种获得免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；以及分离包含⑶4+⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
[0014]在另一个方面，一种获得免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:使包含T细胞种群的样品与⑶6生物标志物配体相接触；筛选T细胞种群，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；以及分离包含⑶表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。在另一个方面，一种获得免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少两种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物；以及分离包含⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。在又一个方面，一种获得免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括⑶4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体、以及⑶6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；以及分离包含⑶4+CD25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
[0015]在本文中公开了识别步骤，包括样品和有用的生物标志物。分离步骤可以使用被标记的生物标志物，使用流式细胞仪、细胞分类器、磁粉/磁珠、或者其它为本领域的普通技术人员所熟知的用于分离细胞的方法。通过利用多个可区别的、用于检测共同决定因素的生物标志物，识别和分离可以以任何次序进行或者同时进行。在另一个方面，本文公开的方法具有的附带条件是:用于筛选和/或分离样品的生物标志物不包括FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、或者FoxP3生物标志物和CTLA-4生物标志物两者。在此公开的方法可以进一步包括富集或者扩展被分离的免疫抑制性调节T细胞亚群。
[0016]本申请说明书的其它方面公开了一种获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测在此公开的CD6生物标志物的细胞表达水平；分离在此公开的包含⑶表达模式的T细胞亚群；以及使包含⑶6ffi/-表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。在一个方面，一种获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括下述步骤:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，所述至少两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物；分离包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及使包含⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。在另一个方面，一种获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括下述步骤:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，所述至少三种不同生物标志物包括CD4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；分离包含⑶4+CD25+⑶6 ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及使包含⑶4+⑶25+⑶6ffil_表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0017]在另一个方面，一种获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括下述步骤:使包含T细胞种群的样品与CD6生物标志物配体相接触；筛选T细胞种群，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；分离包含⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及使包含CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。在另一个方面，一种获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括下述步骤:使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少两种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物；分离包含⑶25+⑶6ffil/表达模式的T细胞亚群；以及使包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。在又一个方面，一种获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括下述步骤:使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触,其中所述至少三种不同生物标志物配体包括⑶4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体、以及⑶6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；分离包含⑶4+CD25+⑶6 ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及使包含⑶4+⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0018]在本文中公开了识别步骤，包括样品和有用的生物标志物；以及分离步骤，包括被标记的生物标志物和方法。刺激性组合物包含抗原特异性的TCR/CD3活化剂，并且可以进一步包含一种或多种附加的试剂，所述附加的试剂包括共同刺激性试剂、第二调节T细胞刺激性试剂、或者T细胞残存物或培养试剂。可选地，具有预期表达模式的T细胞亚群可能按照在本文中公开的方法首先被富集或扩展，然后被分离。
[0019]本申请说明书的其它方面公开了一种调整个体中免疫反应的方法，该方法包括:获得生物样品，该生物样品包含个体兼容的T细胞种群；筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；分离包含⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及将具有CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。在一个方面，一种调整个体中免疫反应的方法，该方法包括:获得生物样品，该生物样品包含个体兼容的T细胞种群；筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，所述至少两种不同生物标志物包括CD25生物标志物和CD6生物标志物；分离包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及将具有⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。在另一个方面，一种调整个体中免疫反应的方法，该方法包括:获得生物样品，该生物样品包含个体兼容的T细胞种群；筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；分离包含⑶4+CD25+⑶6低_卜表达模式的T细胞亚群；以及将具有⑶4+⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。
[0020]在另一个方面，一种调整个体中免疫反应的方法，该方法包括:获得生物样品，该生物样品包含个体兼容的T细胞种群；使包含T细胞种群的样品与⑶6生物标志物配体相接触；筛选T细胞种群，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；以及分离包含⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及将具有⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。在另一个方面，一种调整个体中免疫反应的方法，该方法包括:获得生物样品，该生物样品包含个体兼容的T细胞种群；使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少两种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少两种不同生物标志物包括CD25生物标志物和CD6生物标志物；以及分离包含⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及将具有⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。在又一个方面，一种调整个体中免疫反应的方法，该方法包括:获得生物样品，该生物样品包含个体兼容的T细胞种群；使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括⑶4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体、以及⑶6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；分离包含⑶4+CD25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及将具有⑶4+⑶25+CD6 表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。
[0021]在本文中公开了识别步骤，包括样品和有用的生物标志物；以及分离步骤，包括被标记的生物标志物和方法。公开的方法可以进一步包括:在将T细胞亚群给药于个体体内之前，富集或者扩展在本文中公开的具有预期表达模式的T细胞亚群。可选地，在筛选在本文中公开的样品之前并且/或者在分离在本文中公开的具有预期表达模式的T细胞亚群之前，在生物样品中的个体种群兼容的的T细胞可能被富集或者扩展。
[0022]本申请说明书的其它方面公开了一种试剂盒，其包含对进行在此公开的任何一种方法有用的成分。在一个方面，用于识别和/或分离或者富集免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒包含CD6生物标志物配体。在另一个方面，用于识别、分离和/或富集免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒包含至少两种不同生物标志物配体，其中所述至少两种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体。在另一个方面,用于识另O、分离和/或富集免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒包含至少三种不同生物标志物配体，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括⑶4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体。这类被公开的试剂盒可以进一步包括⑶127生物标志物配体、⑶49d生物标志物配体、⑶38生物标志物配体、⑶45RA生物标志物配体、HLA-DR生物标志物配体、FoxP3生物标志物配体、CTLA-4生物标志物配体、GITR生物标志物配体、LAG-3生物标志物配体、⑶39生物标志物配体、Helios生物标志物配体、FcRL3生物标志物配体、CCR7生物标志物配体、CCR4生物标志物配体、CCR8生物标志物配体、⑶62L生物标志物配体、ICOS生物标志物配体、⑶103生物标志物配体、PD-1生物标志物配体、⑶134生物标志物配体、GARP生物标志物配体、⑶45RB生物标志物配体、⑶45R0生物标志物配体、⑶95生物标志物配体、⑶122生物标志物配体、⑶147生物标志物配体、⑶8生物标志物配体、或它们的任何组合物。这些被公开的生物标志物可以是抗体或者配体，并且可以被标记或者未被标记。如果被标记，生物标志物配体可以用如下物质标记:突光基团、量子点(quantum dot)、磷光基团(phosphore)、化学发光化合物、生物发光化合物、显色化合物、同位素化合物比如镧系元素、放射性同位素、酶、生物素或者亲和素分子、或任何对于检测被生物标志物结合的细胞有用的其他标记物。如果未做标记,则试剂盒可以进一步包括标记物和其他对生物标志物配体进行标记有用的试剂。在另一个方面，用于扩展免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒包含在本文中公开的刺激性组合物。这类试剂盒可以进一步包含在本文中公开的CD6生物标志物配体或者至少三种不同生物标志物配体。公开的试剂盒可以进一步包含阳性和/或阴性对照。另外，公开的试剂盒可以进一步包含用于说明通过使用试剂盒的内容物来识别、分离、富集、和/或扩展免疫抑制性调节T细胞种群的说明书。
[0023]本申请说明书的一些其它方面公开了一种组合物，其包含通过在本文中公开的用于获得免疫抑制性调节T细胞种群的方法而获得的免疫抑制性调节T细胞种群。在一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群通过包含下述步骤的方法而获得:按照在本文中公开的方法筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平，并且分离包含CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。在另一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群通过包含下述步骤的方法而获得:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，所述至少两种不同生物标志物包括CD25生物标志物和⑶6生物标志物；以及分离包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。在另一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群通过包含下述步骤的方法而获得:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平,所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；以及分离包含⑶4+⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
[0024]在另一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群通过包含下述步骤的方法而获得:使包含T细胞种群的样品与⑶6生物标志物配体相接触；筛选T细胞种群，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；以及分离包含⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。在另一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群通过包含下述步骤的方法而获得:使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少两种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少两种不同生物标志物包括eD25生物标志物和⑶6生物标志物；以及分离包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。在又一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群通过包含下述步骤的方法而获得:使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括⑶4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体、以及⑶6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；分离包含⑶4+⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
[0025]在本文中公开了识别步骤，包括样品和有用的生物标志物。识别步骤可以使用被标记的生物标志物，使用流式细胞仪、细胞分类器、磁粉/磁珠、补体溶解、细胞淘选或者其它为本领域的普通技术人员所熟知的用于分离细胞的方法。通过利用多个可区别的、用于检测共同决定因素的生物标志物，识别和分离可以以任何次序进行或者同时进行。在此公开的方法可以进一步包括富集或者扩展被识别的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0026]本申请说明书的其它一些方面公开了一种组合物用于治疗免疫反应的用途，该组合物包含在本文中公开的免疫抑制性调节T细胞种群。免疫反应可以是自身免疫反应。
[0027]本申请说明书的其它一些方面公开了一种在个体中富集免疫抑制性调节T细胞的方法，该方法包括将a -CD6抗体给药于个体，其中给药提供的是不宜操作的包含CD6S/+表达模式的T细胞、而不是包含CD6ffi/_表达模式的τ细胞，从而在个体中富集免疫抑制性调节T细胞种群。
[0028]本申请说明书的其它方面公开了一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集的方法。在一个方面，该方法可以包括下述步骤:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、⑶6生物标志物、以及一种附加的生物标志物的细胞表达水平，所述一种附加的生物标志物是FoxP3生物标志物、⑶45RA生物标志物、CCR4生物标志物、CD39生物标志物、或HLA-Dr生物标志物；其中免疫抑制性调节T细胞的四个不同的成熟子集的检测是以下述方式为基础的:i)⑶4+⑶25+⑶6ffi/TD45RA+表达模式与CCR4ffi表达模式、⑶39<￡表达模式、或达模式相结合；ii)⑶4+⑶25+⑶6ffi/TD45RA+表达模式与CCR4-表达模式、⑶39-表达模式、或HLA_Dr_表达模式相结合；iii)CD4+CD25 * /+CD6低表达模式与CCR4高/+表达模式、CD45RA-表达模式、CD39高/+表达模式、或HLA-Drffi/_表达模式相结合；以及iV)⑶4+CD25+⑶6+表达模式与CR4s/_表达模式、⑶45RA_表达模式、⑶39 ?卜表达模式、或HLA-Dr ?卜表达模式相结合。在另一个方面，该方法可以包括下述步骤:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测CD4生物标志物、CD25生物标志物、⑶127生物标志物、以及一种附加的生物标志物的细胞表达水平，所述一种附加的生物标志物是FoxP3生物标志物、⑶45RA生物标志物、CCR4生物标志物、⑶39生物标志物、或HLA-Dr生物标志物；其中免疫抑制性调节T细胞的四个不同的成熟子集的检测是以下述方式为基础的:i)⑶4+⑶25+CD127? /TD45RA+表达模式与CCR4<￡表达模式、⑶39<￡表达模式、或HLA-Dr <￡表达模式相结合；ii)CD4+CD25+CD127ffi/XD45RA+表达模式与CCRf表达模式、CD39-表达模式、或HLA-Dr-表达模式相结合；iii) CD4+CD25 */+CD127ffi卜表达模式与CCR4*/+表达模式、⑶45RA-表达模式、⑶39*/+表达模式、或HLA-Drffi A表达模式相结合；以及iv)CD4+CD25+CD127+表达模式与CR4*/+表达模式、CD45RA-表达模式、CD39ffi/-表达模式、或HLA-Drffi/_表达模式相结合。免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集包括、但不限于、天然的或者休眠的免疫抑制性调节T细胞种群子集、未成熟的或者记忆性的免疫抑制性调节T细胞种群子集、成熟的或者效应性的免疫抑制性调节T细胞种群子集、以及末端区别的免疫抑制性调节T细胞种群子集。
【专利附图】

【附图说明】
[0029]图1A显示了分析⑶4+淋巴细胞⑶4/FoxP3和⑶25/FoxP3表达的点阵图(dotplots)；图1B显示了分别与在⑶4+F0XP3-和⑶4+⑶25+F0XP3-细胞种群上相比时在CD4+F0XP3+和⑶25+F0XP3+细胞种群上的CD6低表达或者阴性表达的重叠图(overlayplot)。
[0030]图2A显示了分析⑶4+淋巴细胞的点阵图；图2B显示了分析⑶4+淋巴细胞在下述三个不同的⑶4+细胞子集上的⑶6/⑶25表达和FoxP3表达的点阵图:⑶25+⑶6低〃、CD25XD6 低 A 和 CD25TD6+。
[0031]图3显示了分析淋巴细胞在下述三个不同的淋巴细胞子集上的⑶6/⑶25表达和FoxP3 表达的点阵图:CD25+CD6低广、CD25TD6ffi/_ 和 CD25TD6+。
[0032]图4A显示了分析PBMC在⑶和⑶6+细胞种群中的FoxP3表达的点阵图；图48显示了在总的PBMC、PBMC CD6 ?卜和PBMC CD6+细胞种群中F0XP3+细胞表达百分比的图。
[0033]图5Α显示了分析淋巴细胞在下述⑶4+细胞子集上的⑶25/⑶4表达、⑶25/⑶6表达、以及⑶25/⑶127表达、以及FoxP3表达的点`阵图:⑶25+、⑶25+⑶6低/-、以及⑶25+⑶127低卜。图5B显示了分析⑶4+CD25+淋巴细胞在下述⑶4+⑶25 +细胞子集上的⑶6和⑶127表达、以及FoxP3表达的点阵图:CD6ffi/XD127ffi/lPCD6+CD127+。图5C显示了在由不同的标志物组合限定的不同nTMg种群中FoxP3表达的图。柱形图显示了由从9个不同的健康供体的周围血液中分离的PBMC获得的平均值+SD。与在⑶4+⑶25SXD6-1；eg和⑶127_I；eg种群中相t匕，在CD6ffi/_CD127ffi/_细胞中观察到明显较高的F0XP3+富集(p < 0.009、U-Mann-Whitney测试)。
[0034]图6A 显示了采用 CD4 + CD25 + CD6低 A 细胞(CD6_nTreg)和 CD4 + CD25 + CD127低/-细胞(⑶127-nTMg)分类方案的分类前和分类后细胞纯度的代表性结果的点阵图。图6B显示了 Ireg抑制测定，该测定显示，包含⑶4+⑶25+CD6ffi/_表达模式的细胞在用α )-⑶3单克隆抗体和α -⑶28单克隆抗体刺激的⑶8+Τ细胞增殖上具有显著的? < 0.99)剂量-反应抑制作用。显示了前体频率(precursor frequency,pf)百分比抑制(％抑制=pf样品/pf增殖对照xlOO)。由⑶4+CD25+⑶中4个样品计算出平均值和SD，并且作为在⑶4+⑶25+CD127ffi^nTreg测定实验中所研究的9个样品的阳性对照。
[0035]图7显示了分析⑶6ffi/T0XP3+淋巴细胞FoxP3/⑶45RA表达的点阵图。
[0036]图8 显示了分析 CD4+CD25+CD6ffi/-淋巴细胞 FoxP3、CTLA-4, CD45RA、或 HLA-Dr 表达的点阵图。[0037]图9A 显示了分析 CD4+CD25+、CD25+/CD6 低/-、以及 CD25+CD127 低淋巴细胞的 GARP和⑶39表达、或者⑶45RA和CCR4表达的点阵图。图9B显示了分析⑶4+⑶25+、⑶25+/⑶6
以及CD25+CD127低淋巴细胞的CD4和FoxP3表达、HLA-Dr和FoxP3表达的点阵图。图9C 显示了在 CD4+CD25+、CD25+/CD6低/_、以及 CD25+CD127ffi/_ 细胞种群中 FoxP3、HLA-Dr、或CTLA-4表达的图。柱形图显示了由5个健康的对照样品获得的平均值+SD。
[0038]图1OA显示了分析CD4+CD25+CD6低/-CD127低A淋巴细胞的CD45RA和CCR4表达、并且识别下述3个细胞种群子集的点阵图:CD45RA+CCR4_(天然的/休眠的，N/R)、CD45RA+/CCR4低(未成熟/记忆性、I/Me)、CD45RA-/CCR4 * (成熟/效应物、Ma/E);图1OB显示了分析N/R、I/Me、以及Ma/E种群子集的HLA-Dr和⑶39表达的点阵图，箭头显示标志物表达的方向；图1OC显示了分析CD4+CD25*CD6+CD127+淋巴细胞的CD45RA和CCR4表达、并且识别细胞种群子集CCR4*⑶39—HLA-Dr-(末端区别，TD)的点阵图；图1OD显示了分析TD种群子集的HLA-Dr和C39表达的点阵图；图1OE显示了在N/R、I/Me、Ma/E、以及TD种群子集中⑶25、⑶39、HLA-Dr和⑶62L表达的含量的图；图1OF显示了分析由⑶45RA/CCR4双变量分析限定的N/R、I/Me、以及Ma/E种群子集、并且显示了大多数HLA-DR+细胞共表达CCR4和⑶39的点阵图，所述双变量分析组合了在⑶6'Tms中与nTMg与相关的标志物的反向门控(back, gating)和三维分析；图1OG显示了在HLA-DRTD45RA+(2.3±0.3)、HLA-DR-CD45RiT(3.2±0.3)、以及 HLA-DR+CD45RiT(5.04±0.7)中 FoxP3 表达的图；图1OH显示了分析⑶4+⑶25*⑶67XDl27^nIreg种群的⑶45RA和GARP表达、并且识别下述3个细胞种群子集的点阵图:CD45RA+GARP-(Popl)、CD45RiTGARPlPop2)和 CD45RiTGARP+(Pop3)，箭头显示了标志物表达的方向；图101显示了分析⑶4+CD25*⑶6+⑶127 + nl；eg种群⑶45RA和GARP表达的点阵图。 【具体实施方式】
本申请说明书涉及的发现是，在识别样品中的免疫抑制性调节T细胞中，CD6是尤其有用的生物标志物。本申请说明书公开了在人类T细胞的表面细胞膜中CD6的低表达或者阴性表达的检测增加了自然产生的调节T细胞的定义。该CD6ffi/_检测允许发展识别、分离、富集、和/或扩展免疫抑制性调节T细胞种群的改进方法。另外，分离、富集和/或扩展CD6免疫抑制性调节T细胞的能力使得细胞治疗的发展能够用于治疗基于免疫的紊乱。
[0039]本申请说明书的一些方面部分地公开了识别免疫抑制性调节T细胞种群的方法。在一种实施方式中，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平，其中包含CD6ffiA表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0040]在另一个实施方式中，在此公开的方法包括:使包含T细胞种群的样品与⑶6生物标志物配体相接触；筛选T细胞种群，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；其中包含CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0041]在另一个实施方式中，在此公开的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，所述至少两种不同生物标志物包括CD25生物标志物和⑶6生物标志物；其中检测包含⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群可识别样品中的免疫抑制性调节T细胞种群。[0042]在又一个实施方式中，在此公开的方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少两种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体和CD6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少两种不同生物标志物包括CD25生物标志物和CD6生物标志物；并且其中检测包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群可识别样品中的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0043]在另一个实施方式中，在此公开的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，所述至少两种不同生物标志物包括CD6生物标志物和⑶127生物标志物；其中检测包含⑶6ffi/_CD127ffi/_表达模式的T细胞亚群可识别样品中的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0044]在再一个实施方式中，在此公开的方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少两种不同生物标志物配体包括CD6生物标志物配体和⑶127生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少两种不同生物标志物包括CD6生物标志物和CD127生物标志物；并且其中检测包含⑶6ffi/TD127ffiA表达模式的T细胞亚群可识别样品中的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0045]在另一个实施方式中，在此公开的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；其中检测包含⑶4+⑶25+CD6 ffi/_表达模式的T细胞亚群可识别样品中的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0046]在另一个实施方式中，在此公开的方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括CD4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体、以及⑶6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括CD4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；并且其中检测包含⑶4+⑶25+⑶6 ffi/_表达模式的T细胞亚群可识别样品中的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0047]在另一个实施方式中，在此公开的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，所述至少三种不同生物标志物包括CD4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶127生物标志物；其中检测包含ra25+ra6ffi/TD127ffi/-表达模式的T细胞亚群可识别样品中的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0048]在另一个实施方式中，在此公开的方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括CD25生物标志物配体、⑶6生物标志物配体、以及⑶127生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括CD25生物标志物、⑶6生物标志物、以及⑶127生物标志物；并且其中检测包含⑶25+CD6ffi/_CD127ffiA表达模式的T细胞亚群可识别样品中的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0049]在此使用的术语“样品”或者“生物样品”是指从哺乳动物、优选人类中取出的组织或者体液，并且其含有调节T细胞。样品可以是血液和/或血液组分，包括周围血液样品比如周围血液单核细胞(PBMC)样品或者血液、骨髓细胞样品。样品还可以包括任何所关注的特定组织/器官样品，包括、但不限于:淋巴、胸腺、胰腺、眼睛、心脏、肝脏、神经、肠、皮肤、肌肉、软骨、韧带、滑液、和/或关节。样品可以取自任何个体，包括具有细胞的健康个体或者个体、受不期望有的免疫反应折磨的组织、和/或器官。例如，样品可以取自具有过敏、移植物抗宿主(graft vs host)疾病、细胞或者器官移植体、或自身免疫病或者紊乱的个体。用于获得这些样品的方法为免疫学和医学领域技术人员所熟知。这些方法包括:使用常规程序抽取和加工血液和血液组分，或者使用标准的医学技术从骨髓或者其它组织或者器官获得活组织检查。
[0050]在此使用的术语“生物标志物”是指在淋巴细胞上被表达、或者在不同的淋巴细胞子集上被差异表达的表位、抗原或者受体。一些生物标志物的表达是对特定的B细胞或T细胞系中的细胞或者成熟路径是特异性的，并且其它生物标志物的表达可根据相同细胞的激活状态、位置、或分化而变化。生物标志物可以是细胞表面生物标志物或者细胞内生物标志物。在一种实施方式中，在本文公开的方法中使用的生物标志物全部是细胞表面生物标志物。在另一个实施方式中，在本文公开的方法中使用的生物标志物全部是细胞内生物标志物。在又一个实施方式中，在本文公开的方法中使用的生物标志物同时包括细胞表面生物标志物和细胞内生物标志物。生物标志物的例子包括、但不限于:⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、⑶6生物标志物、⑶127生物标志物、⑶49d生物标志物、⑶38生物标志物、⑶45RA生物标志物、HLA-DR生物标志物、FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、GITR生物标志物、LAG-3生物标志物、⑶39生物标志物、Helios生物标志物、FcRL3生物标志物、CCR7生物标志物、CCR4生物标志物、CCR8生物标志物、CD 134生物标志物、GARP生物标志物、⑶45RB生物标志物、⑶45R0生物标志物、⑶95生物标志物、⑶122生物标志物、⑶147生物标志物和CD8生物标志物。可用于实施本文中公开的方法、包括本文中公开的试剂盒的生物标志物在本【技术领域】是己知的。
[0051]在一种实施方式中，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测下述生物标志物的细胞表达水平:⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、⑶6生物标志物、⑶127生物标志物、⑶49d生物标志物、⑶38生物标志物、⑶45RA生物标志物、HLA-DR生物标志物、FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、GITR生物标志物、LAG-3生物标志物、⑶39生物标志物、Helios生物标志物、FcRL3生物标志物、CCR7生物标志物、CCR4生物标志物、CCR8生物标志物、⑶62L生物标志物、ICOS生物标志物、⑶103生物标志物、PD-1生物标志物、⑶134生物标志物、GARP生物标志物、⑶45RB生物标志物、⑶45R0生物标志物、⑶95生物标志物、CD122生物标志物、CD8生物标志物、或者它们的任何组合物。在该实施方式的一个方面，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测CD6生物标志物的细胞表达水平。在该实施方式的另一个方面，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶25生物标志物和⑶6生物标志物的细胞表达水平。在该实施方式的另一个方面,在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测CD6生物标志物和CD127生物标志物的细胞表达水平。在该实施方式的又一个方面，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物的细胞表达水平。在该实施方式的另一个方面，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶25生物标志物、⑶6生物标志物、以及⑶127生物标志物的细胞表达水平。在该实施方式的另一个方面，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、⑶6生物标志物、以及⑶127生物标志物的细胞表达水平。
[0052]在另一个实施方式中，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，所述两种不同生物标志物包括:CD4生物标志物、⑶25生物标志物、⑶6生物标志物、⑶127生物标志物、⑶49d生物标志物、⑶38生物标志物、⑶45RA生物标志物、HLA-DR生物标志物、FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、GITR生物标志物、LAG-3生物标志物、⑶39生物标志物、Helios生物标志物、FcRL3生物标志物、CCR7生物标志物、CCR4生物标志物、CCR8生物标志物、⑶62L生物标志物、ICOS生物标志物、⑶103生物标志物、PD-1生物标志物、⑶134生物标志物、GARP生物标志物、⑶45RB生物标志物、CD45R0生物标志物、⑶95生物标志物、⑶147生物标志物、⑶122生物标志物、CD8生物标志物、或者它们的任何组合物。在该实施方式的一个方面，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，所述两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物。在该实施方式的另一个方面，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平,所述两种不同生物标志物包括⑶6生物标志物和⑶127生物标志物。
[0053]在另一个实施方式中，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，所述三种不同生物标志物包括:CD4生物标志物、⑶25生物标志物、⑶6生物标志物、⑶127生物标志物、⑶49d生物标志物、⑶38生物标志物、⑶45RA生物标志物、HLA-DR生物标志物、FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、GITR生物标志物、LAG-3生物标志物、⑶39生物标志物、Helios生物标志物、FcRL3生物标志物、CCR7生物标志物、CCR4生物标志物、CCR8生物标志物、⑶62L生物标志物、ICOS生物标志物、⑶103生物标志物、PD-1生物标志物、⑶134生物标志物、GARP生物标志物、⑶45RB生物标志物、⑶45R0生物标志物、⑶95生物标志物、⑶122生物标志物、⑶147生物标志物、CD8生物标志物、或者它们的任何组合物。在该实施方式的一个方面，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，所述三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物。在该实施方式的另一个方面，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平,所述三种不同生物标志物包括⑶25生物标志物、⑶6生物标志物、以及⑶127生物标志物。
[0054]在另一个实施方式中，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，所述两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物、以及一种或多种下述附加的生物标志物:⑶4生物标志物、⑶127生物标志物、⑶49d生物标志物、⑶38生物标志物、⑶45RA生物标志物、HLA-DR生物标志物、FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、GITR生物标志物、LAG-3生物标志物、⑶39生物标志物、Helios生物标志物、FcRL3生物标志物、CCR7生物标志物、CCR4生物标志物、CCR8生物标志物、⑶62L生物标志物、ICOS生物标志物、⑶103生物标志物、PD-生物标志物、⑶134生物标志物、GARP生物标志物、⑶45RB生物标志物、⑶45R0生物标志物、⑶95生物标志物、⑶122生物标志物、⑶147生物标志物、⑶8生物标志物、或者它们的任何组合物。
[0055]在另一个实施方式中，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，所述三种不同生物标志物包括CD4生物标志物、⑶25生物标志物和⑶6生物标志物、以及一种或多种下述附加的生物标志物:⑶127生物标志物、⑶49d生物标志物、⑶38生物标志物、⑶45RA生物标志物、HLA-DR生物标志物、FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、GITR生物标志物、LAG-3生物标志物、⑶39生物标志物、Helios生物标志物、FcRL3生物标志物、CCR7生物标志物、CCR4生物标志物、CCR8生物标志物、⑶62L生物标志物、ICOS生物标志物、⑶103生物标志物、PD.1生物标志物、⑶134生物标志物、GARP生物标志物、⑶45RB生物标志物、⑶45R0生物标志物、⑶95生物标志物、⑶122生物标志物、⑶147生物标志物、⑶8生物标志物、或者它们的任何组合物。
[0056]在另一个实施方式中，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，所述三种不同生物标志物包括CD25生物标志物、⑶6生物标志物和⑶127生物标志物、以及一种或多种下述附加的生物标志物:⑶4生物标志物、⑶49d生物标志物、⑶38生物标志物、⑶45RA生物标志物、HLA-DR生物标志物、FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、GITR生物标志物、LAG-3生物标志物、⑶39生物标志物、Helios生物标志物、FcRL3生物标志物、CCR7生物标志物、CCR4生物标志物、CCR8生物标志物、⑶62L生物标志物、ICOS生物标志物、⑶103生物标志物、PD-1生物标志物、⑶134生物标志物、GARP生物标志物、⑶45RB生物标志物、⑶45R0生物标志物、⑶95生物标志物、⑶122生物标志物、⑶147生物标志物、⑶8生物标志物、或者它们的任何组合物。
[0057]在另一个实施方式中，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，附带条件是:用于筛选样品的至少两种不同生物标志物不包括FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、或者FoxP3生物标志物和CTLA-4生物标志物两者。在该实施方式的一个方面，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，所述两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物，附带条件是:用于筛选样品的至少两种不同生物标志物不包括FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、或者FoxP3生物标志物和CTLA-4生物标志物两者。在该实施方式的另一个方面，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，所述两种不同生物标志物包括⑶6生物标志物和CD127生物标志物，附带条件是:用于筛选样品的至少两种不同生物标志物不包括FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、或者FoxP3生物标志物和CTLA-4生物标志物两者。在该实施方式的另一个方面，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，所述两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶127生物标志物，附带条件是:用于筛选样品的至少两种不同生物标志物不包括FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、或者FoxP3生物标志物和CTLA-4生物标志物两者。在该实施方式的又一个方面，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，所述两种不同生物标志物包括CD4生物标志物和⑶25生物标志物，附带条件是:用于筛选样品的至少两种不同生物标志物不包括FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、或者FoxP3生物标志物和CTLA-4生物标志物两者。
[0058]在另一个实施方式中，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，附带条件是:用于筛选样品的至少三种不同生物标志物不包括FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、或者FoxP3生物标志物和CTLA-4生物标志物两者。在该实施方式的一个方面，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，所述三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物，附带条件是:用于筛选样品的至少三种不同生物标志物不包括FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、或者FoxP3生物标志物和CTLA-4生物标志物两者。在该实施方式的另一个方面，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，所述三种不同生物标志物包括⑶25生物标志物、⑶6生物标志物、以及⑶127生物标志物，附带条件是:用于筛选样品的至少三种不同生物标志物不包括FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、或者FoxP3生物标志物和CTLA-4生物标志物两者。在该实施方式的另一个方面，在此公开的方法包括筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，所述三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶127生物标志物，附带条件是:用于筛选样品的至少三种不同生物标志物不包括FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、或者FoxP3生物标志物和CTLA-4生物标志物两者。
[0059]在此使用的术语“生物标志物配体”是指一种分子，该分子可以特异性地结合在淋巴细胞上被表达、或者在不同的淋巴细胞子集上被差异表达的表位、抗原或者受体。生物标志物配体包括抗体。这里使用的术语“抗体”是指免疫系统响应于特定抗原而产生的分子，所述分子可特异性地结合该抗原，并且包括自然产生的抗体和非自然产生的抗体。例如，抗体可能是多克隆抗体、单克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体、重组抗体、人源化抗体或者灵长类化(primatized)抗体、嵌合抗体、双功能抗体、与细胞相关的抗体比如Ig受体、线性抗体(linear antibody)、双链抗体(diabody)、或单链抗体(minibody),只要该片段显示出所述预期生物活性、以及上述抗体的单链衍生物。抗体可以是包含VH和VL结构域、以及轻链恒区结构域(CL)和重链恒区结构域、CHU CH2和CH3的全长免疫球蛋白分子，或者比如是全长免疫球蛋白分子的免疫活性片段例如Fab片段、F(ab' ) 2片段、Fe片段、Fd片段、Fv片段。抗体可能来源于任何脊椎动物种类(例如，人、山羊、马、驴、鼠科、大鼠、兔、或者鸡)，并且可能是任何类型(例如，IgG, IgE, IgM, IgD,以及IgA)、种类(例如，IgA, IgD,IgE、IgG、以及IgM)或者亚类(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)。对于自然产生的抗体、非自然产生的抗体、以及它们的抗原化合物结合性片段的结构的一般公开，参见，例如，Pluckthun in The Pharmacology ofMonoc1nalAntibodies ν01.113,Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag,纽约，第 269-315 页(1994) ;Borrabeck 的 Antibodv Engineering,第二版(牛津大学出版社，1995)，在此将每个出版物的全部内容并入本文以作为参考。
[0060]生物标志物配体的例子包括α -⑶4单克隆抗体、α -⑶25单克隆抗体、α -⑶6单克隆抗体、α -CD127单克隆抗体、a -CD49d单克隆抗体、a -CD38单克隆抗体、a -CD45RA单克隆抗体、a -HLA-Dr单克隆抗体、a -FoxP3单克隆抗体、a -CTLA-4单克隆抗体、a -GITR单克隆抗体、a -LAG-3单克隆抗体、a -CD39单克隆抗体、a -Helios单克隆抗体、a -FcRL3单克隆抗体、a -CCR7单克隆抗体、a -CCR4单克隆抗体、a -CCR8单克隆抗体、a -CD62L单克隆抗体、a -1COS单克隆抗体、a -CD103单克隆抗体、a -PD-1单克隆抗体、α -CD134单克隆抗体、a -GARP单克隆抗体、α -⑶45RB单克隆抗体、α -⑶45R0单克隆抗体、α -⑶95单克隆抗体、α -⑶122单克隆抗体、α -⑶147单克隆抗体和α -⑶8单克隆抗体。这些单克隆抗体在市场上可买到，并且为本领域的普通技术人员所熟知。参见，例如，BDBiosciences (圣胡塞市，加州)、eBiosciences (圣地亚哥市,加州)。
[0061]在另一个实施方式中，⑶6生物标志物配体是⑶166 (ALCAM)配体或者任何⑶6共同刺激性信号。
[0062]生物标志物配体可以被标记或者未被标记。如果被标记，生物标志物配体可以以共价方式或非共价方式附接如下物质:荧光基团、量子点、磷光基团、化学发光化合物、生物发光化合物、显色化合物、同位素化合物比如镧系元素、放射性同位素、酶、生物素或者亲和素分子、或任何对于检测被生物标志物结合的细胞有用的其他标记物。将标记物附接于抗体的方法已为本领域的技术人员所熟知。特别优选的标记物是这样的标记物:其通过连接物被附接于生物标志物配体，所述连接物可以容易地被裂解或者分离、或者通过与预定的酶接触而在生理条件下经受水解。生物标志物配体可以在与样品接触之前或之后、或者在与生物标志物接触之前或之后被标记。生物标志物配体还可以通过与标记后的抗体接触而被标记，所述标记后的抗体可结合于生物标志物配体。生物标志物配体还可以与磁粉比如顺磁纳米颗粒(Miltenyi Biotec,德国)偶联。
[0063]包含本文中公开的T细胞种群的样品与生物标志物配体相接触。使样品与生物标志物配体相接触按如下方式进行:可促进生物标志物配体与它的同源生物标志物特异性结合。典型地，该方法在生理条件下进行。例如，当生物标志物配体是抗体时，抗体与样品的接触是在如下条件下进行:可导致抗体与它的对应生物标志物相结合，从而得到抗体/生物标志物复合物。
[0064]筛选包含本文中公开的T细胞种群的样品，以便检测生物标志物的细胞表达水平。筛选被标记的生物标志物可以使用以如下技术为基础的检测方法:荧光、生物发光、化学发光、光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学、磁性、或者为本领域的普通技术人员所熟知的其它物理学手段。筛选未被标记的生物标志物可以使用基于下述技术的检测方法:尺寸、体积、密度、不透明度、或者为本领域的普通技术人员所熟知的其它物理学手段。
[0065]在一种实施方式中，通过使用细胞分类器，完成筛选包含T细胞种群的样品，以便检测生物标志物的细胞表达水平。细胞分类器为本领域技术人员所熟知，并且通常能够复杂的细胞混合物分离成单细胞类型组分。典型地，待分类的细胞作为从小喷口发射的载液细小射流被导入。在离开喷嘴不久之后，水动力集中的液体流穿过一个或多个紧密聚焦的光束(通常为激光)的收敛部分。许多检测器瞄准液流穿过光束的点:一个检测器与光束成一直线(正向散射(Forward Scatter或者FSC))，并且有几个检测器与其相垂直(侧向散射(Side Scatter或者SSC))，并且有一个或多个荧光检测器。每个穿过光束的0.2 μ M到150 μ M悬浮粒子可散射光线，并且在颗粒中发现的或者附着到颗粒上的荧光化合物可以被激发成波长比光源更长的发射光。这种散射光和荧光的组合被检测器收集到，并且在每个检测器(一个检测器用于每个荧光发射峰)中分析其光亮度波动，然后可能衍生出多种类型的信息，所述信息涉及每个单个颗粒的物理结构和化学结构。通过流式细胞仪产生的数据可以在单维中作图，生产直方图；或者在二维点阵图中、甚至在三维空间中作图。在这些图上的区域可以以突光强度为基础，通过产生一系列子集提取(subset extraction)而被依序分离，术语称作“门控”。市场上的一些流式细胞仪已经消除了对荧光的需要，并且仅仅使用光散射用于测定。其他流式细胞仪可形成每个细胞的荧光、漫射光、以及透射光图像。[0066]在该实施方式的一个方面，筛选包含T细胞种群的样品以便检测细胞表达水平生物标志物是通过使用被荧光标记的生物标志物配体由流式细胞仪完成的。流式细胞仪分类是一种特殊类型的流式细胞技术。它提供了一种用于将多相的生物制品细胞混合物分类进入两个以上容器的方法，每次一个细胞，该方法以每个细胞的特定光散射特征和荧光特征为基础。它是个有用的科学仪器，因为它可提供快速的、客观的和定量的来自个体细胞的荧光信号记录、以及特别关注的细胞的物理分离。流式细胞术分类器可以容易地在大于每秒200，000个事件的速度下分析细胞。然而，一般来讲，流体载体的物理学、以及在液滴当中分配细胞的统计将分类速率限制为每秒大约50，000个细胞。速度和可靠分离的这种组合使得个体细胞被分离或者富集，用于其它用途。
[0067]在另一个实施方式中，筛选包含T细胞种群的样品以便检测生物标志物的细胞表达水平是通过使用被磁性标记的生物标志物配体由磁性激活的细胞分类(MACS)完成的。MACS使得细胞通过与涂有用于特定生物标志物的生物标志物配体的磁性纳米颗粒一起温育而被分离。磁性纳米颗粒可以包含由氧化铁和多糖涂层组成的超顺磁纳米颗粒。磁性纳米颗粒优选小到足以保留在胶悬体中，这允许快速地、有效率地结合于细胞表面生物标志物。在该实施方式的一个方面,磁性纳米颗粒直径为大约Inm为至大约lOOnm，比如，直径大约为25nm、50nm、75nm、或lOOnh。在该实施方式的其他方面，磁性纳米颗粒体积为有代表性的哺乳动物细胞的大约百万分之一、例如为有代表性的哺乳动物细胞的大约百万分之五、或者大约百万分之十。磁性纳米颗粒优选不抑制流式细胞技术，是可生物降解的，并且对细胞功能的影响可以忽略。抗体偶联于磁性纳米颗粒可以是直接的或者间接的，通过第二抗体偶联于配体比如荧光基团、量子点、磷光基团、化学发光化合物、生物发光化合物、显色化合物、同位素化合物(比如镧系元素、放射性同位素)、酶、生物素或者亲和素分子、或者任何对检测被生物标志物结合的细胞有用的其他标记物。
[0068]在另一个实施方式中，筛选包含T细胞种群的样品以便检测生物标志物的细胞表达水平是通过固相附接完成的。在一个方面，筛选包含T细胞种群的样品以便检测生物标志物的细胞表达水平是通过使用本文中公开的生物标志物配体由淘选亲和色谱法或者固相亲和色谱法完成的。在一个方面，筛选包含T细胞种群的样品以便检测生物标志物的细胞表达水平是通过使用本文中公开的被磁性标记的生物标志物配体由固相磁珠完成的。参见，例如，美国专利申请公开2005/0186207，通过引用将其全部内容结合于本文。
[0069]在另一个实施方式中，筛选包含T细胞种群的样品以便检测生物标志物的细胞表达水平是通过补体细胞溶解(complement cell lysis)完成的。补体细胞溶解被用于清除不希望有的由抗体识别的细胞种群，并且是基于特定类型的抗体固定并激活细胞表面上称为“补体系统”的酶分子级联的作用。最终的反应导致在细胞膜上打开物理孔穴，并且通过渗透性产生细胞溶解。典型地，细胞在4°C下与抗体孵育30分钟，并且加入补体酶源，并在37°C下孵育。最后，用等渗缓冲液洗涤细胞备用。
[0070]以一种或多种生物标志物的特征表达模式为基础来识别免疫抑制性调节T细胞种群。一般来讲，按照本领域的普通技术人员已知的方法，以可容易辨别的染色强度差异为基础，根据生物标志物表达水平来识别这些细胞。典型地，生物标志物的表达被分为高(生物标志物?)、+ (生物标志物+)、低(生物标志物)和-(生物标志物_)。
[0071]当使用生物标志物配体进行筛选时，细胞强烈地或者明亮地染色被称为生物标志物+，并且是细胞显示出生物标志物表达高水平的象征。例如，⑶4S/+、⑶25s/ +、⑶6S/+、CD127 高/+、CD49d 高/+、CD38 高/+、CD45RA 高/+、HLA_DR 高/+、FoxP3 高/+、CTLA_4 高/+、GITR 高/+、LAG_3*/+、CD39 Helios FcRL3 */+、CCR7 */+、CCR4高/+、CCR8 高/+、CD62Ls +、ICOS s/+、CD 103高/+、PD.1*/+、CD134*/+、GARP*/+、CD45RB*/+、CD45R0 */+、CD95 高/+、CD122 */+、CD147 */+和CD8?/+是指当使用分别针对下述生物标志物的被标记的生物标志物配体进行筛选时细胞强烈地或者明亮地染色:⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、⑶6生物标志物、⑶127生物标志物、⑶49d生物标志物、⑶38生物标志物、⑶45RA生物标志物、HLA-DR生物标志物、FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、GITR生物标志物、LAG-3生物标志物、⑶39生物标志物、Helios生物标志物、FcRL3生物标志物、CCR7生物标志物、CCR4生物标志物、CCR8生物标志物、⑶62L生物标志物、ICOS生物标志物、⑶103生物标志物、PD-1生物标志物、⑶134生物标志物、GARP生物标志物、⑶45RB生物标志物、⑶45R0生物标志物、⑶95生物标志物、⑶122生物标志物、⑶147生物标志物、⑶8生物标志物。
[0072]当使用生物标志物配体进行筛选时，细胞轻微地、不清楚地或者根本没染色被称为生物标志物并且是细胞显示出生物标志物表达高水平的象征。例如，⑶4?^、⑶25 ?卜、CD6ffi/' CD127ffi/' CD49d低a、CD38ffi/' CD45RAffi/_、HLA—DR低/-、FoxP3ffi/\ CTLA-4GITR低卜、LAG—3 低卜、CD39低Helios低卜、FcRL3低h、CCR7低h、CCR4低h、CCR8 低卜、CD62L低卜、ICOS ffi/\CD103ffi/\ PD-1 ffi/\CD134ffi/\ GARP ffi/\CD45RBffi/\CD45R0ffi/\CD95ffi/\CD122?
和⑶8ffi/_是指当使用分别针对下述生物标志物的被标记的生物标志物配体进行筛选时细胞轻微地、不清楚地、或者根本未染色:⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、⑶6生物标志物、⑶127生物标志物、⑶49d生物标志物、⑶38生物标志物、⑶45RA生物标志物、HLA-DR生物标志物、FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、GITR生物标志物、LAG-3生物标志物、CD39生物标志 物、Helios生物标志物、FCRL3生物标志物、CCR7生物标志物、CCR4生物标志物、CCR8生物标志物、⑶62L生物标志物、ICOS生物标志物、⑶103生物标志物、PD-1生物标志物、⑶134生物标志物、GARP生物标志物、⑶45RB生物标志物、⑶45R0生物标志物、⑶95生物标志物、⑶122生物标志物、⑶147生物标志物、⑶8生物标志物。
[0073]可以设置用于将细胞指定为生物标志物胃细胞的截止标准(cut off)，就观察到的所有细胞的荧光强度分布而言，荧光强度的顶部或10%的那些细胞被指定为生物标志物?细胞。在该实施方式的一个方面，⑶4s细胞、⑶25s细胞、⑶6 s细胞、⑶127高细胞、CD49d高细胞、CD38高细胞、CD45RA高细胞、HLA-DR高细胞、FoxP3高细胞、CTLA-4高细胞、GITR高细胞、LAG-3高细胞、CD39高细胞、Helios高细胞、FcRL3高细胞、CCR7高细胞、CCR4高细胞、CCR8高细胞、CD62L高细胞、ICOS高细胞、CD103高细胞、PD.1高细胞、CD134高细胞、GARP高细胞、⑶45RB?细胞、⑶45R0?细胞、⑶95?细胞、⑶122?细胞、⑶147?细胞、和/或⑶8胃细胞与筛选的所有细胞观察到的荧光强度相比显示出90%以上、93%以上、95%以上、97%以上、或98%以上荧光强度。
[0074]可以设置用于将细胞指定为生物标志物+细胞的截止标准(cut off)，就观察到的所有细胞的荧光强度分布而言，荧光强度的顶部10%、20%、30%、40%或50%的那些细胞被指定为生物标志物+细胞。在该实施方式的一个方面，⑶4+细胞、⑶25+细胞、⑶6+细胞、CD 127+ 细胞、CD49d+ 细胞、CD38+ 细胞、CD45RA+ 细胞、HLA-DR+ 细胞、FoxP3+ 细胞、CTLA-4+ 细胞、GITR+ 细胞、LAG-3+ 细胞、CD39+ 细胞、Helios+ 细胞、FcRL3+ 细胞、CCR7+ 细胞、CCR4+ 细胞、CCR8+细胞、CD62L+细胞、ICOS+细胞、CD103+细胞、PD- 细胞、CD134+细胞、GARP+细胞、⑶45RB+细胞、⑶45R0+细胞、⑶95+细胞、⑶122+细胞、⑶147+细胞、和/或⑶8+细胞与筛选的所有细胞观察到的荧光强度相比显示出10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、或50%以上荧光强度。
[0075]可以设置用于将细胞指定为生物标志物<￡细胞的截止标准(cut off)，就观察到的所有细胞的荧光强度分布而言，低于荧光强度的10%的那些细胞被指定为生物标志物ffi/_细胞。在该实施方式的一个方面，CD4ffi细胞、0025<￡细胞、CD6?细胞、CD127低细胞、CD49d?细胞、CD38低细胞、CD45RA低细胞、HLA-DR低细胞、FoxP3低细胞、CTLA-4低细胞、GITR低细胞、LAG-3低细胞、CD39低细胞、Helios低细胞、FcRL3低细胞、CCR7低细胞、CCR4 细胞、CCR8 细胞、CD62Lffi细胞、ICOSffi细胞、CD103 细胞、PD-1细胞、0)134<￡细胞、GARP低细胞、CD45RBP低细胞、CD45R0P低细胞、CD95P低细胞、CD122低细胞、CD147低细胞、和/或⑶Sffi细胞与筛选的所有细胞观察到的荧光强度相比显示出50%以下、40%以下、30%以下、20%以下或10%以下荧光强度。
[0076]可以设置用于将细胞指定为生物标志物-细胞的截止标准，就观察到的所有细胞的荧光强度分布而言，低于荧光强度的或2%的那些细胞被指定为生物标志物-细胞。在该实施方式的一个方面，⑶4_细胞、⑶25_细胞、⑶6_细胞、⑶127_细胞、CD49cf 细胞、CD38-细胞、CD45RA-细胞、HLA-DIT 细胞、FoxP3_ 细胞、CTLA-4^ 细胞、GITR-细胞、LAG-3-细胞、CD39-细胞、Helios—细胞、FcRL3-细胞、CCR7-细胞、CCRf 细胞、CCR8-细胞、CD62L-细胞、I⑶S-细胞、CD103-细胞、PD- 细胞、CD134-细胞、GARP^细胞、CD45RB-细胞、CD45R0_细胞、CD95_细胞、CD122_细胞、CD147-细胞和/或CD8_细胞与筛选的所有细胞观察到的荧光强度相比显示出10%以下、7%以下、5%以下、3%以下或2%以下荧光强度。
[0077]细胞还可以通过获得所有细胞的生物标志物染色的频率分布、并且产生符合较高染色种群和较低染色种群的种群曲线而进行区别。以各个种群分布的统计分析为基础，个体细胞然后被分配到它们很可能属于其中的种群。在一种实施方式中，生物标志物ffi/_细胞显示出与生物标志物+细胞相比低一倍、低两倍、或者低三倍的荧光强度。在该实施方式的一个方面，CD4低A细胞、CD25低A细胞、CD6低A细胞、CD127ffi/_细胞、CD49dffi/_细胞、CD38低A细胞、CD45RA低A细胞、HLA-DR低厂细胞、FoxP3低广细胞、CTLA-4低厂细胞、GITR低h细胞、LAG-3低A细胞、CD39低A细胞、Helios低细胞、FcRL3低细胞、CCR7低细胞、CCR4低A细胞、CCR8低^细胞、CD62L低A细胞、ICOS低广细胞、CD103低细胞、PD-1低广细胞、CD134低A细胞、GARP低A细胞、CD45RB低A细胞、CD45R0低细胞、CD95低厂细胞、CD122低厂细胞、⑶147ffi/_细胞和⑶细胞分别显示出比下述细胞低一倍、低两倍、或者低三倍的荧光强度:⑶4+细胞、⑶25+细胞、⑶6+细胞、⑶127+细胞、⑶49d+细胞、⑶38+细胞、⑶45RA+细胞、HLA-DR+ 细胞、FoxP3+ 细胞、CTLA-4+ 细胞、GITR+ 细胞、LAG-3+ 细胞、CD39+ 细胞、Helios+ 细胞、FcRL3+ 细胞、CCR7+ 细胞、CCR4+ 田胞、CCR8+ 细胞、CD62L+ 细胞、ICOS+ 细胞、CD 103+ 细胞、PD-1+ 细胞、CD134+ 细胞、GARP+ 细胞、CD45RB+ 细胞、CD45R0+ 细胞、CD95+ 细胞、CD122+ 细胞、⑶147+细胞和⑶8+细胞。
[0078]在一种实施方式中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶表达模式的T细胞为基础被识别。在该实施方式的一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含CD25+CD6 ?A表达模式的T细胞为基础被识别。在该实施方式的另一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含^6<￡/工0127<￡/-表达模式的T细胞为基础被识别。在该实施方式的又一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶6ffi/XD38ffi/_表达模式的T细胞为基础被识别。在该实施方式的又一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶64ffi/TD49ffi/-表达模式的T细胞为基础被识别。
[0079]在该实施方式的另一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶4+⑶25+⑶6 ?A表达模式的T细胞为基础被识别。在该实施方式的另一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶25+CD6ffiA表达模式的T细胞为基础被识别。在该实施方式的又一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶6A表达模式的T细胞为基础被识别。在该实施方式的又一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶6ffi/_CD127ffi7TDSSffiI表达模式的T细胞为基础被识别。
[0080]在该实施方式的其他方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含下述表达模式的T细胞为基础被识别:CD4+CD25+CD6ffi/XD127ffi/_表达模式、CD4+CD25+CD6低^0)49(1低表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-CD38 低 A 表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-CD45RA低表达模式、CD25+CD6 低/-⑶ 127 ffi /-0)49(1 低卜表达模式、CD25+CD6 ? /-CD127 ? /-CD38 ? 卜表达模式、或者 CD6 ? 7XD127低ACD49CI低7XD38低卜表达模式。
[0081]在该实施方式的其他方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含下述表达模式的T细胞为基础被识别:CD4+CD25+CD6 ? 7^HLA-Dr+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 ? 7^HLA-Dr ? 卜表达模式、CD4+CD25+CD6 ? 7ΤοχΡ3+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 ? 7ΤοχΡ3 ? 卜表达模式、CD4+CD25+CD6ffi/XTLA-4+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 低yXTLAIffiA 表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-GITR+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-GITR低卜表达模式、CD4+CD25+CD6 ffi/XAG-3+ 表达模式、CD4+CD25+CD6? 7XAG-Sffi^ 表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-CD39+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-CD39 低表达模式、CD4+CD25+CD6 低7TfeIios+ 表达模式、CD4+CD25+CD6低yTfeliosffiA 表达模式、Q)4+CD25+CD6低 AFCRL3+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 低 7TcRL3 低表达模式、CD4+CD25+CD6 低 7XCR7+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 ? 7XCR7 低表达模式、CD4+CD25+CD6 ? 7XCR4+ 表达模式、CD4+CD25+CD6ffi/-CCR4?/-表达模式、CD4+CD25+CD6? yTCRS+ 表达模式、CD4+CD25+CD6? yTCRS 低/_ 表达模式、CD4+CD25+CD6 低 ACD62L+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-CD62L低表达模式、CD4+CD25 + CD6低勹COS+表达模式、CD4+CD25+CD6低/-1C0S低A表达模式、CD4+CD25+CD6低yXDlOS+表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-0)103 低 A 表达模式、CD4+CD25+CD6 低^PD-1-1表达模式、CD4+CD25+CD6 低7TD.1 低 A 表达模式、CD4+CD25+CD6低/-CD134+表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-CD134低表达模式、CD4+CD25+CD6 ? /_GARP+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 ? /_GARP 低表达模式、CD4+CD25+CD6 低ACD45RB+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 ffi/XD45RBffi/_ 表达模式、CD4+CD25+CD6ffi/XD45R0+ 表达模式、CD4+CD25+CD6ffi/TD45R0 低表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-CD95+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 低,0)95 ? 卜表达模式、CD4+CD25+CD6 ? 7XD122+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 ? 7XD122 〃 表达模式、CD4+CD25+CD6 ? 7XD147 ? h 表达模式、CD4+CD25+CD6 ? 7XD8+ 表达模式、或 CD4+CD25+CD6 ? ^0)8ffiA表达模式。
[0082]在另一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶和一种或多种下述附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被识别:CD4+表达模式、CD25+表达模式、CD127ffi/-表达模式、CD49d低表达模式、CD38ffi/-表达模式、CD45RA低表达模式、HLA-Dr+表达模式、HLA-Drffi —表达模式、FoxP3+表达模式、FoxP3ffi/-表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA 4低/-表达模式、GITR+表达模式、GITRffi表达模式、LAG-3+表达模式、LAG-3低表达模式、CD39+表达模式、CD39ffi/-表达模式、Helios+表达模式、Heliosffi/_表达模式、FcRL3+表达模式、FcRL3ffi/-表达模式、CCR7+表达模式、CCR7ffi/_表达模式、CCR4+表达模式、CCR4低^表达模式、CCR8+表达模式、CCR8ffi/-表达模式、⑶62L+表达模式、⑶62Lffi/-表达模式、ICOS+表达模式、IC0Sffi/_表达模式、CD103+表达模式、CD103ffi/_表达模式、PD-f表达模式、表达模式、CD 134+表达模式、CD134ffi/-表达模式、GARP+表达模式、GARPffi/_表达模式、CD45RB+表达模式、CD45RB ?卜表达模式、CD45R0+表达模式、CD45R0 ?卜表达模式、CD95+表达模式、⑶95ffi/_表达模式、⑶122+表达模式、⑶122 —表达模式、⑶147+表达模式、⑶147?卜表达模式、⑶8+表达模式、或⑶8 ? h表达模式。 [0083]在又一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶25+CD6ffi/_和一种或多种下述附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被识别:CD4+表达模式、CD 127 表达模式、CD49dffi/-表达模式、CD38ffi/-表达模式、CD45RAffi/-表达模式、HLA-Dr+表达模式、HLA-Dr?卜表达模式、FoxP3+表达模式、FoxP3 ?卜表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4 ? h表达模式、GITR+表达模式、GITRffi表达模式、LAG-3+表达模式、LAG_3ffi/-表达模式、⑶39+表达模式、CD39ffi/-表达模式、Helios+表达模式、Heliosffi/_表达模式、FcRL3+表达模式、FcRL3?卜表达模式、CCR7+表达模式、CCR7ffi/-表达模式、CCR4+表达模式、CCR4ffi/_表达模式、CCR8+表达模式、CCR8ffi/_表达模式、CD62L+表达模式、CD62Lffi/_表达模式、ICOS+表达模式、ICOS低A表达模式、CD103+表达模式、CD103ffi/_表达模式、PD-F表达模式、PD-1ffi^表达模式、CD134+表达模式、CD134ffi/-表达模式、GARP+表达模式、GARPff1-表达模式、CD45RB+表达模式、⑶45RBffi/-表达模式、⑶45R0+表达模式、⑶45R0ffi/-表达模式、⑶95+表达模式、⑶95低A表达模式、⑶122+表达模式、⑶122低A表达模式、Cd14/表达模式、⑶147低表达模式、⑶8+表达模式、或⑶8 ?卜表达模式。
[0084]在再一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶6—和一种或多种下述附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被识别:CD4+表达模式、CD25+表达模式、CD49dffi/-表达模式、CD38 表达模式、CD45RAffi/-表达模式、HLA-Dr+表达模式、HLA-Dr?卜表达模式、FoxP3+表达模式、FoxP3 ?卜表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4 ? h表达模式、GITR+表达模式、GITRffi表达模式、LAG-3+表达模式、LAG_3ffi/-表达模式、⑶39+表达模式、CD39ffi/-表达模式、Helios+表达模式、Heliosffi/_表达模式、FcRL3+表达模式、FcRL3?卜表达模式、CCR7+表达模式、CCR7ffi/-表达模式、CCR4+表达模式、CCR4ffi/_表达模式、CCR8+表达模式、CCR8ffi/_表达模式、CD62L+表达模式、CD62Lffi/_表达模式、ICOS+表达模式、ICOS低A表达模式、CD103+表达模式、CD103ffi/_表达模式、PD-F表达模式、PD-1ffi^表达模式、CD 134 +表达模式、CD134ffi/-表达模式、GARP+表达模式、GARPffi/_表达模式、CD45RB+表达模式、⑶45RBffi/-表达模式、⑶45R0+表达模式、⑶45R0ffi/-表达模式、⑶95+表达模式、⑶95低卜表达模式、⑶122+表达模式、⑶122ffi/_表达模式、⑶147+表达模式、⑶147ffi/_表达模式、⑶8+表达模式、或⑶8 ?卜表达模式。
[0085]在另一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶4+⑶25+CD6ffi/_和一种或多种下述附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被识别:⑶127ffi/_表达模式、⑶49d低卜表达模式、CD38 ?卜表达模式、CD45RA低卜表达模式、HLA-Dr+表达模式、HLA-Dr ?卜表达模式、FoxP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA_4ffi/_表达模式、GITR+表达模式、GITRffi —表达模式、LAG-3+表达模式、LAG_3ffi/-表达模式、⑶39+表达模式、⑶39低A表达模式、Helios+表达模式、Heliosffi —表达模式、FcRL3+表达模式、FcRL3低表达模式、CCR7+表达模式、CCR7ffi/-表达模式、CCR4+表达模式、CCR4ffi/_表达模式、CCR8+表达模式、CCR8ffi/_表达模式、CD62L+表达模式、CD62Lffi/_表达模式、ICOS+表达模式、ICOSffi表达模式、CD103+表达模式、CD103ffi/_表达模式、PD-1+表达模式、PD-1 ffi/_表达模式、CD134+表达模式、CD 134 —表达模式、GARP+表达模式、GARP ?卜表达模式、CD45RB+表达模式、CD45RB?卜表达模式、⑶45R0+表达模式、⑶45R0 ?卜表达模式、⑶95+表达模式、⑶95 ?卜表达模式、⑶122+表达模式、⑶147+表达模式、⑶147ffi/_表达模式、⑶8+表达模式、或⑶8ffi/_表达模式。
[0086]在另一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶6—表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被识别，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式不是F0XP3 +表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4 ?7表达模式、或者它们的任何组合。
[0087]在另一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶25+CD6ffi/_表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被识别，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式不是F0XP3+表达模式、FoxP3 ?卜表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4
表达模式、或者它们的任何组合。
[0088]在另一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶6表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被识别，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式不是F0XP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4 ? h表达模式、或者它们的任何组合。
[0089]在另一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶25+CD127ffi/_表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被识别，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式不是F0XP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4 ? h表达模式、或者它们的任何组合。
[0090]在另一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶4+⑶25+⑶6—表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被识别，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式不是F0XP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4 ? h表达模式、或者它们的任何组合。
[0091]在另一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶4+⑶25+CD127ffi/_表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被识别，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式不是F0XP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4 ? h表达模式、或者它们的任何组合。
[0092]在另一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含^25+006<￡/工0127<￡/_表达模式和一种或多种 附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被识别，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式不是F0XP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4ffi/_表达模式、或者它们的任何组合。
[0093]在另一个实施方式中，两种以上不同的免疫抑制性调节T细胞种群以包含CD6ffi7表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被识别，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式是F0XP3+表达模式或FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式或CTLA-4ffi/-表达模式、⑶45RA+表达模式或⑶45RAffi/-表达模式、HLA-Dr+表达模式或HLA-Dr ?卜表达模式、或者它们的任何组合。
[0094]在另一个实施方式中，两种以上不同的免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶25+CD6ffi/_表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被识别，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式是F0XP3+表达模式或FoXP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式或CTLA-4ffi/-表达模式、CD45RA+表达模式或CD45RAffi/-表达模式、HLA-Dr+表达模式或HLA-Dr ffiA表达模式、或者它们的任何组合。
[0095]在另一个实施方式中，两种以上不同的免疫抑制性调节T细胞种群以包含CD6ffi/TD127ffi/-表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的τ细胞为基础被识别，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式是F0XP3+表达模式或FoXP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式或CTLA-4ffi/-表达模式、CD45RA+表达模式或CD45RAffi/-表达模式、HLA-Dr+表达模式或HLA-Dr ffiA表达模式、或者它们的任何组合。
[0096]在另一个实施方式中，两种以上不同的免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被识另O，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式是F0XP3+表达模式或FoXP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式或CTLA-4ffi/-表达模式、CD45RA+表达模式或CD45RAffi/-表达模式、HLA-Dr+表达模式或HLA-Dr ffiA表达模式、或者它们的任何组合。
[0097]在另一个实施方式中，两种以上不同的免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶25+CD6ffi—表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被识别，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式是F0XP3+表达模式或FoXP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式或CTLA-4ffi/-表达模式、⑶45RA+表达模式或⑶45RAffi/-表达模式、HLA-Dr+表达模式或HLA-Drffi A表达模式、或者它们的任何组合。
[0098]在另一个实施方式中，两种以上不同的免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_CD127ffi/_表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被识别，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式是F0XP3+表达模式或FoXP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式或CTLA-4ffi/-表达模式、⑶45RA+表达模式或⑶45RAffi/-表达模式、HLA-Dr+表达模式或HLA-Drffi A表达模式、或者它们的任何组合。
[0099]本申请说明书的一些方面部分地公开了获得免疫抑制性调节T细胞种群的方法。在一种实施方式中，本文中公开的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测CD6生物标志物的细胞表达水平；以及分离包含⑶表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
[0100]在另一个实施方式中，本文中公开的方法包括:使包含T细胞种群的样品与⑶6生物标志物配体相接触；筛选T细胞种群，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；以及分离包含CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
[0101]在又一个实施方式中，本文中公开的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，其中至少两种不同生物标志物包括CD25生物标志物和⑶6生物标志物；以及分离包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。[0102]在又一个实施方式中，本文中公开的方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少两种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体；筛选T细胞种群；以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少两种不同生物标志物包括CD25生物标志物和CD6生物标志物；以及分离包含⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
[0103]在再一个实施方式中，本文中公开的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，其中至少两种不同生物标志物包括CD6生物标志物和⑶127生物标志物；以及分离包含⑶6ffi/TD127ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
[0104]在再一个实施方式中，本文中公开的方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少两种不同生物标志物配体包括⑶6生物标志物配体和⑶127生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少两种不同生物标志物包括CD6生物标志物和CD127生物标志物；以及分离包含⑶6ffi/TD127ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
[0105]在另一个实施方式中，本文中公开的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，其中所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；以及分离包含⑶4+⑶25+CD6 ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
[0106]在另一个实施方式中，本文中公开的方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括CD4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体、以及⑶6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括CD4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；以及分离包含⑶4+⑶25+CD6 ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。在另一个实施方式中，本文中公开的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，其中所述至少三种不同生物标志物包括⑶25生物标志物、⑶6生物标志物、以及⑶127生物标志物；以及分离包含⑶25+⑶6ffi/-⑶127 ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
[0107]在另一个实施方式中，本文中公开的方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体、⑶6生物标志物配体、以及⑶127生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括CD25生物标志物、⑶6生物标志物、以及⑶127生物标志物；以及分离包含⑶25+CD6 ffi7^cD127?7表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
[0108]筛选步骤和接触步骤在本文中已有描述。
[0109]以一种或多种生物标志物的特征表达模式为基础来分离或富集免疫抑制性调节T细胞种群。对于在此公开的筛选步骤，按照本领域的普通技术人员已知的方法，以可容易辨别的染色强度差异为基础，根据生物标志物表达水平来分离或者富集这些细胞。典型地，生物标志物表达模式的表达被分为高(生物标志物s)、+(生物标志物+)、低(生物标志物ffi)和-(生物标志物_)。
[0110]免疫抑制性调节T细胞种群可以实质上包含含有预期生物标志物表达模式的细胞。这里使用的术语“实质上”，当用于指代含有预期生物标志物表达模式的细胞种群时，是指这样的细胞种群:其种群中细胞总数的至少80%含有预期生物标志物表达模式。在该实施方式的一个方面，含有预期生物标志物表达模式的免疫抑制性调节T细胞种群占该种群中细胞总数的例如至少83%、至少85%、至少88%、或者至少90%、至少93%、至少95%、至少98%、或者至少99%。在该实施方式的其他方面，含有预期生物标志物表达模式的免疫抑制性调节T细胞种群与样品中T细胞来源种群相比，例如占至少2倍、至少4倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、或者至少100倍。
[0111]通过使用所关注的细胞的阳性筛选或者阴性筛选，可以分离或者富集免疫抑制性调节T细胞种群。另外，通过同时使用所关注的细胞的阳性筛选和阴性筛选，可以分离或者富集免疫抑制性调节T细胞种群。这里使用的术语“阳性筛选”是指以在特定的细胞上生物标志物高表达或者阳性表达为基础，从混合物或者初始细胞种群中筛选特定的细胞。这里使用的术语“阴性筛选”是指以在特定的细胞上生物标志物低表达或者阴性表达为基础，从混合物或者初始细胞种群中筛选特定的细胞。可以通过例如流式细胞术分类机、MACS、固相附接、淘选、以及色谱法来检测用于细胞的阳性或者阴性筛选的生物标志物。在细胞上两种以上生物标志物的免疫筛选可以在一个或多个步骤中进行，其中每个步骤用于阳性地或者阴性地筛选一种或多种生物标志物。当使用流式细胞术分类机在一个步骤中进行两种以上生物标志物的免疫选择时，两种以上不同的生物标志物可以用不同的荧光基团进行标记。
[0112]在该实施方式的一些方面，与细胞种群来源中的细胞总数相比，含有预期生物标志物表达模式的免疫抑制性调节T细胞种群富集了例如至少20%至少30%、至少40%、至少50%、或至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%。在该实施方式的其他方面，与细胞种群来源中的细胞总数相比，含有预期生物标志物表达模式的免疫抑制性调节T细胞种群富集了例如至少两倍、至少四倍、至少八倍、至少十倍、至少20倍、至少50倍、或至少100倍。
[0113]在该实施方式的其他方面，含有预期生物标志物表达模式的免疫抑制性调节T细胞种群被富集到占样品中的细胞总数的例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%。在该实施方式的其他方面，含有预期生物标志物表达模式的免疫抑制性调节T细胞种群被富集到占样品中细胞总数的例如大约80 %至大约85 %、大约80 %至大约90 %、大约80%至大约95%、大约80%至大约98%、大约80%至大约100%、大约85%至大约90 %、大约85 %至大约95 %、大约85 %大约98 %、大约85 %至大约100 %、大约90 %至大约95 %、大约90 %至大约98 %、或者大约90 %至大约100 %。
[0114]在该实施方式的其他方面，含有预期生物标志物表达模式的免疫抑制性调节T细胞亚群被分离到占样品中的细胞总数的例如至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、或至少98%。在该实施方式的其他方面，含有预期生物标志物表达模式的免疫抑制性调节T细胞亚群被分离到占样品中细胞总数的例如大约80 %至大约85 %、大约80 %至大约90 %、大约80%至大约95%、大约80%至大约98%、大约80%至大约100%、大约85%至大约90 %、大约85 %至大约95 %、大约85 %大约98 %、大约85 %至大约100 %、大约90 %至大约95 %、大约90 %至大约98 %、或者大约90 %至大约100 %。
[0115]在另一个方面，含有预期生物标志物表达模式的免疫抑制性调节T细胞种群通过阴性选择方案被分离，所述阴性选择方案减少了样品的细胞中的CD6+细胞。在另一个方面，含有预期生物标志物表达模式的免疫抑制性调节T细胞种群通过阴性选择方案被富集，所述阴性选择方案减少了样品的细胞中的CD6+细胞。
[0116]以一种或多种生物标志物的特征表达模式为基础得到免疫抑制性调节T细胞种群。通过使用检测方法，可以分离或者富集含有预期生物标志物表达模式的细胞，所述检测方法基于下述技术:荧光、生物发光、化学发光、光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化合物、磁性、尺寸、体积、密度、不透明度、或者其它为本领域的普通技术人员所熟知的物理学手段。
[0117]在一种实施方式中，通过使用本文中公开的细胞分类器，完成包含预期生物标志物表达模式的T细胞亚群的分离。在该实施方式的一个方面，通过使用本文中公开的流式细胞术分类器，完成包含预期生物标志物表达模式的T细胞亚群的分离。在另一个实施方式中，通过使用本文中公开的MACS，完成包含预期生物标志物表达模式的T细胞亚群的分离。生物标志物表达模式可以被用于本文中公开的所关注的细胞的阳性筛选或者阴性筛选。可以通过例如流式细胞术分类机、MACS、淘选、以及色谱法来检测用于细胞的阳性或者阴性筛选的生物标志物表达模式。丨
[0118]在本文中已公开了用于指定细胞为生物标志物S细胞、生物标志物+细胞、生物标志物细胞、或者生物标志物-细胞的截止值。细胞还可以通过获得所有细胞的生物标志物染色的频率分布、并 且产生符合在此公开的较高染色种群和较低染色种群的种群曲线而进行区别。
[0119]在一种实施方式中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶表达模式的T细胞为基础被分离或者富集。在该实施方式的一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含CD25+CD6ffi/_表达模式的T细胞为基础被分离或者富集。在该实施方式的另一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶6A表达模式的T细胞为基础被分离或者富集。在该实施方式的又一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶6A表达模式的T细胞为基础被分离或者富集。在该实施方式的又一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶6ffi/XD49ffi/_表达模式的T细胞为基础被分离或者富集。
[0120]在该实施方式的另一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶4+⑶25+⑶6 ?A表达模式的T细胞为基础被分离或者富集。在该实施方式的另一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含^25+006<￡/工0127<￡/-表达模式的T细胞为基础被分离或者富集。在该实施方式的又一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含ra6ffi/TD127ffi/TD49d ffi/_表达模式的T细胞为基础被分离或者富集。在该实施方式的又一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶6A表达模式的T细胞为基础被分离或者富集。
[0121]在该实施方式的其他方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含下述表达模式的T细胞为基础被分离或者富集:CD4+CD25 + CD6ffi/XD127ffiA表达模式、CD4+CD25+CD6 ffi/XD49d低卜表达模式、CD4+CD25+CD6 ? 7XD38 ?卜表达模式、CD4+CD25+CD6 ? /-CD45RA ?卜表达模式、CD25+CD6 ? 7XD127? 7Χ049(1? 卜表达模式、CD25+CD6 ? ^CD127 〃CD38 ? 卜表达模式、或者 CD6低/-CD127? 7Χ049(1低7XD38低卜表达模式。
[0122]在该实施方式的其他方面，免疫抑制性调节T细胞种群以包含下述表达模式的T细胞为基础被分离或者富集:CD4+CD25+CD6ffi^HLA-Dr+表达模式、CD4+CD25+CD6ffi^HLA-Dr低 A 表达模式、CD4+CD25+CD6 ? 7ΤοχΡ3+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 ? 7ΤοχΡ3 低表达模式、CD4+CD25+CD6 ? 7XTLA-4+ 表达模式、CD4+CD25 + CD6 ? ^CTLA-4 低表达模式、CD4+CD25+CD6低/-GITR+ 表达模式、CD4+CD25+CD6低/-GITR低表达模式、CD4+ CD25+CD6低/-LAG-3+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 低 ^LAG-3 低 A 表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-CD39+表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-CD39低 A 表达模式、0)4+0)25+0)6低/1161108+ 表达模式、CD4+CD25+CD6低yTfeliosffiA 表达模式、CD4+CD25+CD6 ? 7TcRL3+ 表达模式、CD4- + CD25+CD6 ? 7TcRL3 ? 卜表达模式、CD4+CD25+CD6低/-CCR7+ 表达模式、CD4+CD25+CD6?表达模式、CD4+CD25+CD6ffi/TCR4+ 表达模式、CD4+CD25 + CD6 ? 7XCR4 低表达模式、CD4+CD25+CD6 ? 7XCR8+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 低7XCR8 表达模式、CD4+CD25+CD6ffi/TD62L+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-CD62L低表达模式、CD4+CD25+CD6 低勹COS+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 低 ^ICOSffi表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-0)103+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 ? /-0)103 低表达模式、CD4+CD25+CD6 ? 7TD-1+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 低^PD-1 低 A 表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-CD134+表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-⑶134低/-表达模式、CD4+CD25+CD6低/-GARP+表达模式、CD4+CD25+CD6低/-GARP低表达模式、CD4+CD25+CD6ffi/TD45RB+ 表达模式、CD4+CD25+CD6ffi/TD45RBffi/_ 表达模式、CD4+CD25+CD6 低LCD45R0+ 表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-0)451?0低/-表达模式、CD4+CD25+CD6ffi/XD95+ 表达模式、CD4+CD25+CD6ffi/TD95ffi/_ 表达模式、CD4+CD25+CD6ffi/TD122+表达模式、CD4+CD25+CD6 低/-CD122低 A 表达模式、CD4+CD25+CD6低表达模式、CD4+CD25+CD6低/-CD8+ 表达模式、或 CD4+CD25+CD6 ? 7XD8 ? /-表达模式。
[0123]在另一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶表达模式和一种或多种下述附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被分离或者富集:⑶4+表达模式、CD25+表达模式、CD127ffi/-表达模式、CD49dffi/-表达模式、CD38ffi/-表达模式、CD45RA低/-表达模式、HLA-Dr+表达模式、HLA-Drffi —表达模式、FoxP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4ffi/-表达模式、GITR+表达模式、GITRffi 〃表达模式、LAG-3+表达模式、LAG-3ffi/_表达模式、CD39+表达模式、CD39ffi/_表达模式、HeIios+表达模式、HeIios低表达模式、FcRL3+表达模式、FcRL3ffi/_表达模式、CCR7+表达模式、CCR7ffi/_表达模式、CCR4+表达模式、CCR4ffi/-表达模式、CCR8+表达模式、CCR8ffi/_表达模式、CD62L+表达模式、CD62Lffi/_表达模式、ICOS+表达模式、IC0Sffi/_表达模式、CD103+表达模式、CD103ffi/_表达模式、PD-1 +表达模式、PD-1 ffi/_表达模式、CD 134+表达模式、CD134ffi/_表达模式、GARP+表达模式、GARPffi^表达模式、CD45RB+表达模式、CD45RBffi〃表达模式、CD45R0+表达模式、CD45R0低表达模式、⑶95+表达模式、⑶95ffi/-表达模式、⑶122+表达模式、⑶122? —表达模式、⑶147+表达模式、⑶147ffi/_表达模式、⑶8+表达模式、或⑶表达模式。
[0124]在又一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶25+CD6ffi/_表达模式和一种或多种下述附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被分离或者富集:⑶4+表达模式、CD127ffi/-表达模式、CD49d低表达模式、CD38ffi/-表达模式、CD45RA低表达模式、HLA-Dr+表达模式、HLA-Drffi —表达模式、FoxP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4ffi/-表达模式、GITR+表达模式、GITRffi表达模式、LAG-3+表达模式、LAG-3低A表达模式、CD39+表达模式、CD39ffi/-表达模式、HeIios+表达模式、Helios表达模式、FcRL3+表达模式、FcRL3 ?卜表达模式、CCR7+表达模式、CCR7 ?卜表达模式、CCR4+表达模式、CCR4ffi/-表达模式、CCR8+表达模式、CCR8ffi/-表达模式、CD62L+表达模式、CD62Lffi/-表达模式、ICOS+表达模式、ICOSffi —表达模式、CD103+表达模式、CD103ffi/-表达模式、PD. 表达模式、表达模式、CD 134+表达模式、CD134ffi/-表达模式、GARP+表达模式、GARPffi/_表达模式、⑶45RB+表达模式、⑶45RBffi/-表达模式、⑶45R0+表达模式、⑶45R0ffi/-表达模式、⑶95+表达模式、⑶95ffi/_表达模式、⑶122+表达模式、⑶122 ffi/_表达模式、⑶147+表达模式、⑶147ffi/_表达模式、⑶8+表达模式、或⑶8ffi/_表达模式。
[0125]在再一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶6—表达模式和一种或多种下述附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被分离或者富集:CD4+表达模式、⑶25+表达模式、⑶49dffi/-表达模式、⑶38ffi/-表达模式、⑶45RAffi/-表达模式、HLA-Dr+表达模式、HLA-Drffi —表达模式、FoxP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4ffi/-表达模式、GITR+表达模式、GITRffi表达模式、LAG-3+表达模式、LAG-3ffi/-表达模式、CD39+表达模式、CD39ffi/-表达模式、HeIios+表达模式、HeIiosffi表达模式、FcRL3+表达模式、FcRL3 ?卜表达模式、CCR7+表达模式、CCR7 ?卜表达模式、CCR4 +表达模式、CCR4 ?丨-表达模式、CCR8+表达模式、CCR8 ?卜表达模式、CD62L+表达模式、CD62L ?卜表达模式、ICOS+表达模式、ICOS 表达模式、CD103+表达模式、CD103ffi/-表达模式、PD- 表达模式、TO-1ffi/-表达模式、CD 134+表达模式、CD134ffi/-表达模式、GARP+表达模式、GARPffi/_表达模式、CD45RB+表达模式、CD45RBffi/-表达模式、CD45R0+表达模式、CD45R0ffi/-表达模式、⑶95+表达模式、⑶95ffi/_表达模式、⑶122+表达模式、⑶122 &表达模式、⑶147+表达模式、⑶147 ?卜表达模式、⑶8+表达模式、或⑶8 ? h表达模式。
[0126]在另一个实施方式中中，免疫抑制性调节T细胞种群以包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式和一种或多种下述附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被分离或者富集:CD127ffi/-表达模式、CD49d低表达模式、CD38ffi/-表达模式、CD45RA低表达模式、HLA-Dr+表达模式、HLA-Drffi —表达模式、FoxP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4低A表达模式、GITR+表达模式、GITRffi表达模式、LAG-3+表达模式、LAG-3低表达模式、CD39+表达模式、CD39ffi/-表达模式、Helios+表达模式、Heliosffi/_表达模式、FcRL3+表达模式、FcRL3 ?卜表达模式、CCR7+表达模式、CCR7 ?卜表达模式、CCR4+表达模式、CCR4 ?卜表达模式、CCR8+表达模式、CCR8 ?卜表达模式、CD62L+表达模式、CD62L?卜表达模式、ICOS+表达模式、IC0Sffi/_表达模式、⑶103+表达模式、⑶103ffi/_表达模式、PD-1+表达模式、PD-1低^表达模式、CD134+表达模式、CD134ffi/_表达模式、GARP+表达模式、GARPffi/_表达模式、CD45RB+表达模式、CD45RB ?卜表达模式、CD45R0+表达模式、CD45R0 ?卜表达模式、CD95+表达模式、⑶95ffi/_表达模式、⑶122+表达模式、⑶122ffi/_表达模式、⑶147+表达模式、⑶147?卜表达模式、⑶8+表达模式、或⑶8 ? h表达模式。
[0127]在另一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞群以包含⑶6ffi/_表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被分离或者富集，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式不是FoxP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4 ?卜表达模式、或者它们的任何组合。
[0128]在另一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞群以包含⑶25+CD6ffi/_表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被分离或者富集，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式不是FoxP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4 ?卜表达模式、或者它们的任何组合。
[0129]在再一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞群以包含⑶6—表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被分离或者富集，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式不是FoxP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4 ?卜表达模式、或者它们的任何组合。
[0130]在另一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞群以包含⑶25+CD127ffi/_表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被分离或者富集，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式不是FoxP3+表达模式、FoxP3ffi/-表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4ffi/_表达模式、或者它们的任何组合。
[0131 ] 在另一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞群以包含⑶4+CD25+CD6ffi/_表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被分离或者富集，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式不是FoxP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4 ? h表达模式、或者它们的任何组合。
[0132]在另一个实施方式中，免疫抑制性调节T细胞群以包含⑶4+⑶25+CD127ffi/_表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被分离或者富集，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式不是FoxP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4?7-表达模式、或者它们的任何组合。
[0133]在另一个实施方 式中，免疫抑制性调节T细胞群以包含^25+006<￡/工0127<￡/_表达模式和一种或多种附加的生物标志物表达模式的T细胞为基础被分离或者富集，附带条件是:所述附加的生物标志物表达模式不是FoxP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA-4?7-表达模式、或者它们的任何组合。
[0134]本申请说明书的一些方面部分地公开了获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群的方法。在一种实施方式中，本文中公开的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；以及分离包含⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及扩展包含⑶表达模式的T细胞亚群，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0135]在另一个实施方式中，本文中公开的方法包括:使包含T细胞种群的样品与⑶6生物标志物配体相接触；筛选T细胞种群，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；以及分离包含⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及使包含⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0136]在又一个实施方式中，本文中公开的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，其中所述至少两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物；以及分离包含⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及使包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0137]在又一个实施方式中，本文中的方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触,其中所述至少两种不同生物标志物配体包括CD25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少两种不同生物标志物包括CD25生物标志物和CD6生物标志物；分离包含⑶25 +⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及使包含⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0138]在再一个实施方式中，本文中公开的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，其中所述至少两种不同生物标志物包括⑶6生物标志物和⑶127生物标志物；以及分离包含⑶6ffi/TD127ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及使包含⑶6ffi/_CD127ffi/_表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0139]在再一个实施方式中，本文中的方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触,其中所述至少两种不同生物标志物配体包括CD6生物标志物配体和⑶127生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少两种不同生物标志物包括⑶6生物标志物和⑶127生物标志物；分离包含⑶6ffi/_CD127ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及使包含⑶6—表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0140]在另一个实施方式中，本文中公开的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，其中所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；以及分离包含⑶4+⑶25+CD6 ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及使包含包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0141]在另一个实施方式中，本文中公开的方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括CD4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体、以及⑶6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括CD4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；分离包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及使包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0142]在另一个实施方式中，本文中公开的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，其中所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；以及分离包含⑶25+CD6ffi/_CD127ffiA表达模式的T细胞亚群；以及使包含⑶25+⑶6—表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0143]在另一个实施方式中，本文中公开的方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体、⑶6生物标志物配体、以及⑶127生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括CD25生物标志物、⑶6生物标志物、以及⑶127生物标志物；分离包含⑶25+⑶6—表达模式的T细胞亚群；以及使包含⑶25+⑶6Sl_CD 127表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
[0144]筛选步骤、接触步骤、以及分离步骤在本文中已有描述。[0145]扩展包含预期生物标志物表达模式的T细胞亚群可以通过使用标准的培养步骤使T细胞亚群与刺激性组合物相接触而完成。刺激性组合物通过抗原特异性地结合并激活T细胞受体复合物而促进T细胞的生长。刺激性组合物包含有效量的抗原特异性的TCR/CD3活化剂。刺激性组合物可以进一步包括一种或多种附加的试剂，例如共同刺激性试剂、第二调节T细胞刺激性试剂、或者通常可促进T细胞存活和/或生长的试剂。刺激性组合物可以在溶液或者悬浮液中。为了促进活化和扩展，TCR/CD3活化剂和TCR共同刺激物可以典型地被固定化在3维固体表面比如寄主细胞、珠子、或者其它基材上。参见，例如，Thomas et al.，Clin.1mmunOl.，105:259-272 (2002)，在此通过引用将其全部内容并入本文。适合用作基材的细胞包括可呈递人工抗原的细胞(aAPCs)。参见，例如、Kim，et al.，Nat.BiotechnOl.22 (4):403-410(2004)；以及 Thomas, et al.，Clin.1mmunOl.105(3):259-272(2002)，在此通过引用将每个文献的全部内容并入本文。珠子可以是塑料、玻璃、或者任何其它合适的材料，典型地直径在I μ M.20 μ M的范围。在一种实施方式中，活化剂可以被固定化在顺磁性珠子上，细胞:珠子的比率在2:1和1:5之间、优选在1:1和1:3之间。最适宜的珠子大小可以通过经验来确定，尽管典型地尺寸落在直径I μ Μ.20 μ M的范围内。
[0146]TCR/CD3活化剂是用于TCR/CD3的多价抗体或配体，包括:抗原非特异性活化剂例如a-CD3抗体、以及抗原特异性活化剂例如主要组织相容性复合体(MHC)-肽多聚体。参见，例如，Yee, et al., Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8+Tcell clones for the treatment of patients with metastatic melanoma:In vivopersistence, migration, and antitumor effect oftransferred T cells, Proc NatlAcad Sci USA99 (25): 16168-16173 (2002) ；Butterfield, et al—T-Cell responses toHLA-A*0201 immunodominant peptides derived from, alpha, -fetoprotein in patientswith hepatocellular cancer, Clin.Cancer Res.9(16):5902-5908(2003)；以及 Yee,et al., Isolation of high avidity melanoma-reactive CTL from heterogeneouspopulations using peptide-MHC tetramers, J.1mmunOl.162:2227-2230 (1999)。通过引用将每个文献的全部内容结合于本文。MHC-肽多聚体可以是I类MHC/抗原肽复合物或者II类MHC/抗原肽复合物。抗原肽可以是自身抗原肽或者异源抗原肽。抗原肽典型地是与自身免疫病相关的肽、当给药于个体时在调节自身免疫反应时有效的肽、或者可在个体中促进不期望有的免疫反应的抗原。参见，例如、Bluestone，et al.，⑶127表达与FoxP3 和 CD4+Treg 的抑制作用反向相关(Expression Inversely Correlates wit FoxP3andSuppressiveFunctions ofOM+TregS),美国专利申请公开2008/0131445,在此通过弓I用将每个文献的全部内容并入本文。这里使用的术语“自身抗原肽”或者“自身抗原”是指，是对哺乳动物而言自然的、并且在哺乳动物中病理地免疫原性的抗原或者表位。
[0147]自身抗原肽还可以是能够与II类MHC分子复合的模拟表位肽。模拟表位肽在下述文献中有描述:例如，Bluestone，et al.，⑶127表达与FoxP3和⑶4+TMg的抑制作用反向相关(Expression Inversely Correlates wit FoxP3and Suppressive Functions of CD4 +TMgS)，美国专利申请公开2008/0131445，在此通过引用将其全部内容并入本文。这里使用的术语“异源抗体肽”是指生物体自身识别体系一部分的抗原或表位，当其被注入到另一个来自相同种类的个体中时，可触发目的在于清除该肽的免疫反应。示例性的II类MHC分子/肽复合物在下述文献中有描述:例如，Bluestone，et al.，⑶127表达与FoxP3和⑶4+TMgS的抑制作用反向相关(Expressionlnversely Correlates wit FoxP3and SuppressiveFumctions of CD4 + I；egS)，美国专利申请公开2008/0131445，在此通过引用将其全部内容并入本文。
[0148]使用TCR/⑶3活化剂以便扩展来自别的普通T细胞的调节T细胞的方案包括使用自身抗原特异性的MHC-肽四聚物、随肽波动的DCs (Yamazald，et al.，J.Exp.Med.198:235-247,2003)或者人工的 APCs (Maus，et al.，Nat.BiotechnOl.20:143.148,2002)以便扩展来自个体的调节T细胞，所述个体独立于细胞表面表现型。另外，体外方法和体内方法的组合可以增强治疗效果。例如，近年来的研究显示，自体抗原、改变的肽配体甚至非专一性刺激物比如FcR非结合性a -CD3单克隆抗体的给药可以促进抗原特异性的调节的T细胞活性。参见，例如 Apostolou, et al.，].Exp.Med.199:1401-1408 (2003) ；Belghith, etal.,Nat.Med.9:1202.1208 (2003)，在此通过引用将每个文献的全部内容并入本文。因而，用于诱导调节T细胞的体内免疫与体外扩展的合并可以是有利的。
[0149]在一种实施方式中，刺激性组合物包含I类MHC/抗原肽复合物、尤其是这种MHC/肽复合物的聚集物。在该实施方式的一个方面，刺激性组合物包含I类MHC/异源抗原肽复合物或I类MHC/抗原肽复合物。在另一个实施方式中，刺激性组合物包含II类MHC/抗原肽复合物、尤其是这种MHC/肽复合物的聚集物。在该实施方式的一个方面，刺激性组合物包含TT类MHC/异源抗原肽复合物或II类MHC/抗原肽复合物。许多用于产生功能性的I类MHC/肽和II类MHC/肽复合物的可应用的方法在本【技术领域】是已知的。
[0150]TCR共同刺激物活化剂是对TCR共同刺激物特异的多价抗体或配体，比如 CD28、GITR、B7-1/2、CD5、I COS, 0X40 或者 CD40。参见，例如 Shimizu et al,Stimulation of CD25(+)CD4(+)regulatory T cells through GITR breaksimmunological self-tolerance, Nat Tmmunol3(2): 135-142(2002) ；Tone et al, Mouseglucocorticoid-1nduced tumor necrosis factor receptor ligand is co-stimulatoryfor T cells,Proc Natl Acad Sci USAlOO (25): 15059-15064 (2003)，在此通过引用将每个文献的全部内容并入本文。共同刺激性试剂可以是激动剂抗体，比如可结合于CD28、GITR、B7.1/2、CD5、I COS, 0X40 或 CD40 的激动剂抗体。
[0151]第二调节T细胞刺激性试剂是细胞因子，例如，肝细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、白细胞间介素比如IL-2、IL-6、IL-7、IL-13、以及IL.15。有效量典型地是大约200IU/mL 至大约 2500IU/mL。
[0152]在一种实施方式中，扩展包含预期生物标志物表达模式的T细胞亚群可以通过使T细胞亚群与抗原相接触而完成。在该实施方式的一个方面，包含预期生物标志物表达模式的T细胞亚群可以通过使细胞种群与抗原特异性的调节T细胞刺激性组合物相接触而完成。在该实施方式的另一个方面，刺激性组合物包含II类MHC/自身抗原肽复合物。在该实施方式的另一个方面，包含预期生物标志物表达模式的T细胞亚群可以通过使细胞种群与抗原特异性的调节T细胞刺激性组合物和另一种刺激性试剂或第二调节T细胞刺激性试剂相接触而完成。
[0153]在又一个实施方式中，扩展包含预期生物标志物表达模式的T细胞亚群可以通过使T细胞亚群与激动剂抗体相接触而完成。在该实施方式的一个方面，激动剂抗体是a_CD3抗体或a-⑶28抗体。
[0154]在再一个实施方式中，扩展包含预期生物标志物表达模式的T细胞亚群可以通过使T细胞亚群与激动剂抗体和第二刺激性试剂相接触而完成。在该实施方式的一个方面，第二刺激性试剂是细胞因子。在该实施方式的一个方面，细胞因子是白细胞介素比如IL-2。在该实施方式的一个方面、扩展包含预期生物标志物表达模式的T细胞亚群可以通过在TGFii或者雷帕霉素存在的条件下使T细胞亚群与α-⑶3抗体或者α-⑶28抗体、以及IL-2相接触而完成。
[0155]刺激性组合物中各组分的最佳浓度、培养物条件和持续时间可以使用常规实验凭经验确定。最大的扩展凭经验确定，并且随着例如细胞类型、孵育条件而改变。在该实施方式的一个方面，包含预期生物标志物表达模式的T细胞亚群的最大扩展可以是例如至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少500倍或者至少800倍。
[0156]本申请说明书的一些方面部分地公开了治疗个体中基于免疫的紊乱的方法。在一种实施方式中，在此公开的方法是适于采用的细胞免疫疗法。
[0157]在另一个实施方式中，本文中的方法包括:获得生物样品，该生物样品包含个体兼容的T细胞种群；筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；分离包含⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及将具有⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。在该实施方式的一个方面，该方法还包括:在将T细胞亚群给药于个体体内之前，扩展包含⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群。
[0158]在另一个实施方式中，本文中公开的方法包括:使包含T细胞种群的样品与⑶6生物标志物配体相接触；筛选T细胞种群，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；分离包含CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及将具有⑶6 ffiA表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。在该实施方式的一个方面，该方法还包括:在将T细胞亚群给药于个体体内之前，扩展包含⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群。
[0159]在又一个实施方式中，本文中的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，其中至少两种不同生物标志物包括CD25生物标志物和⑶6生物标志物；分离包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及将具有CD25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。在该实施方式的一个方面，该方法还包括:在将T细胞亚群给药于个体体内之前，扩展包含⑶25+CD6ffi/-表达模式的T细胞亚群。
[0160]在又一个实施方式中，本文中的方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触,其中所述至少两种不同生物标志物配体包括CD25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少两种不同生物标志物包括CD25生物标志物和CD6生物标志物；分离包含⑶25+⑶6ffi/卜表达模式的T细胞亚群；以及将具有⑶25+⑶6 —表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。在该实施方式的一个方面，该方法还包括:在将T细胞亚群给药于个体体内之前，扩展包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群。
[0161]在再一个实施方式中，本文中的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，其中至少两种不同生物标志物包括CD6生物标志物和B127生物标志物；分离包含B6ffi/_CD127ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及将具有CD6?表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊
舌L。在该实施方式的一个方面，该方法还包括:在将T细胞亚群给药于个体体内之前，扩展包含B25+B6ffi/卜表达模式的T细胞亚群。
[0162]在再一个实施方式中，本文中的方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触,其中所述至少两种不同生物标志物配体包括CD6生物标志物配体和B127生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少两种不同生物标志物包括B6生物标志物和B127生物标志物；分离包含CD6—表达模式的T细胞亚群；以及将具有B6ffi/_CD127低〃表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。在该实施方式的一个方面，该方法还包括:在将T细胞亚群给药于个体体内之前，扩展包含B6ffi/TD127 ffi/_表达模式的T细胞亚群。
[0163]在另一个实施方式中，本文中公开的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，其中所述至少三种不同生物标志物包括B4生物标志物、CD25生物标志物、以及B6生物标志物；以及分离包含B4 +B25+B6 ?
表达模式的T细胞亚群；以及将具有B4+B25+B6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。在该实施方式的一个方面，该方法还包括:在将T细胞亚群给药于个体体内之前，扩展包含B4+B25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群。
[0164]在另一个实施方式中，本文中公开的方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括CD4生物标志物配体、B25生物标志物配体、以及B6生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括CD4生物标志物、B25生物标志物、以及B6生物标志物；分离包含B4+CD25+B6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及将具有B4+CD25+B6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。在该实施方式的一个方面，该方法还包括:在将T细胞亚群给药于个体体内之前，扩展包含B4+B25+B6ffi/_表达模式的T细胞亚群。
[0165]在另一个实施方式中，本文中公开的方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，其中所述至少三种不同生物标志物包括B25生物标志物、B6生物标志物、以及B127生物标志物；分离包含B25+B6ffi/XD127低-表达模式的T细胞亚群；以及将具有B25+B6—表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。在该实施方式的一个方面，该方法还包括:在将T细胞亚群给药于个体体内之前，扩展包含B25+B6ffi/TD127ffi/_表达模式的T细胞亚群。
[0166]在另一个实施方式中，本文中公开的方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括B25生物标志物配体、B6生物标志物配体、以及B127生物标志物配体；筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括CD25生物标志物、B6生物标志物、以及B127生物标志物；分离包含B25+B6—表达模式的T细胞亚群；以及将具有B25 +B6ffi/_CD127ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。在该实施方式的一个方面，该方法还包括:在将T细胞亚群给药于个体体内之前，扩展包含⑶25+⑶6A表达模式的T细胞亚群。
[0167]筛选步骤、接触步骤、分离步骤、以及扩展步骤在本文中已有描述。获得的生物样品包含个体兼容的T细胞种群。这里使用的术语“个体兼容的T细胞”是指这样的细胞:其可以被导入个体，可选择地与免疫抑制疗法相结合，不会导致大量慢性的移植物抗宿主疾病(graft versus host disease, GvHD)。获得的个体兼容的T细胞种群可以包含抗原或自身抗原特异性的调节T细胞，并且可以来源于任何其中存在抗原或自身抗原特异性的调节T细胞的来源比如周围血液、脐带血、胸腺、淋巴结、脾、以及骨髓。生物样品可以由健康个体、或者正在遭受本文中公开的基于免疫的紊乱或者经受本文描述的治疗后正从该基于免疫的紊乱中缓解的个体得到。
[0168]在一种实施方式中，包含个体种群兼容的细胞的生物样品是由个体细胞即自体细胞得到的。在另一个实施方式中，包含个体种群兼容的细胞的生物样品是由与个体不同的供体得到的。所述供体优选是同系基因的，但还可以是异源的，甚至是异基因的，只要获得的细胞是个体兼容的即可，该细胞可以被导入个体中、可选择地与免疫抑制疗法相结合，不会导致大量慢性的移植物抗宿主疾病(GvHD)。异源供体细胞优选是人白血球抗原(HLA)兼容的，并且典型地被与免疫抑制疗法一起给药。为了使之成为个体兼容性的，异基因的细胞可以经受Y照射或者PENlO处理。在特定的实施方式中，调节T细胞来源可以是来自尸体组织。
[0169]具有预期生物标志物表达模式的T细胞亚群被给药于个体。个体可以是其中免疫反应调整是预期的任何哺乳动物。个体包括人，并且人可以是病人。典型地，作为用于常规治疗基于免疫的紊乱的候选人的任何个体是在此公开的用于基于免疫的紊乱医治的候选人。除充分知情同意公开所有的相关风险和程序好处之外，事先操作评估典型地包括常规的病史和体检。
[0170]具有预期生物标志物表达模式的T细胞亚群是调节T细胞种群。在该实施方式的一个方面，调节T细胞种群包含⑶6 ?7表达模式。
[0171]在该实施方式的另一个方面，调节T细胞种群包含包含⑶25+⑶表达模式。在该实施方式的另一个方面，调节T细胞种群包含⑶6ffi/TD127ffi/-表达模式。在该实施方式的又一个方面，调节T细胞种群包含⑶表达模式。在该实施方式的另一个方面，调节T细胞种群包含CD6低表达模式。
[0172]在该实施方式的另一个方面，调节T细胞种群包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式。在该实施方式的另一个方面，调节T细胞种群包含⑶25+CD6ffiA表达模式。在该实施方式的又一个方面，调节T细胞种群包含⑶6/10127^1049(1^-表达模式。在该实施方式的另一个方面，调节T细胞种群包含⑶6 ? 7XD127? 7XD38 ?卜表达模式。
[0173]在该实施方式的另一个方面，调节T细胞种群包含⑶4+⑶25+⑶6 ? 7XD127? 表达模式。在该实施方式的另一个方面，调节T细胞种群包含⑶4+CD25+⑶6ffi/TD49d ffi/_表达模式。在该实施方式的又一个方面，调节T细胞种群包含⑶4+CD25+⑶6ffi/TD38 ffi/_表达模式。在该实施方式的另一个方面，调节T细胞种群包含⑶4 +⑶25+⑶67TDASRAffi A表达模式。在该实施方式的另一个方面，调节T细胞种群包含⑶25+CD6 ? 7TD127卜表达模式。在该实施方式的又一个方面，调节T细胞种群包含⑶25+⑶6表达模式。在该实施方式的另一个方面，调节T细胞种群包含⑶6ffi
ffi/_表达模式。
[0174]在该实施方式的其他方面，调节τ细胞种群或者包含表达模式、包含⑶25+CD6ffi/-表达模式，或者包含⑶4+⑶25+⑶6ffi/-表达模式，进一步包含⑶127低/_表达模式、CD49d ffi L表达模式、⑶38 ffi —表达模式、⑶45RA ?卜表达模式、HLA-Dr+表达模式、HLA-Dr低A表达模式、FoxP3+表达模式、FoxP3ffi/_表达模式、CTLA-4+表达模式、CTLA_4ffi/_表达模式、GITR+表达模式、GITRffi表达模式、LAG-3+表达模式、LAG-3低表达模式、CD39+表达模式、CD39ffi/-表达模式、HeIios+表达模式、HeIiosffi表达模式、FcRL3+表达模式、FcRL3低卜表达模式、CCR7+表达模式、CCR7ffi/-表达模式、CCR4+表达模式、CCR4ffi/_表达模式、CCR8+表达模式、CCR8ffi/_表达模式、CD62L+表达模式、CD62Lffi/_表达模式、ICOS+表达模式、ICOS低表达模式、CD103+表达模式、CD103低A表达模式、PD-1+表达模式、PD.1低〃表达模式、CD 134+表达模式、CD134ffi/-表达模式、GARP+表达模式、GARPffi/_表达模式、CD45RB+表达模式、CD45RBffi/-表达模式、CD45R0+表达模式、CD45R0低〃表达模式、CD95+表达模式、CD95低卜表达模式、⑶122+表达模式、⑶122 —表达模式、⑶147 ffi/_表达模式、⑶8+表达模式、⑶8ffi/_表达模式、或者它们的任何组合物。
[0175]被给药于个体的具有预期生物标志物表达模式的调节T细胞典型地是组合物包含预定的抗原或自身抗原特异性调节T细胞。这类预定的抗原或自身抗原特异性调节T细胞通过使用本文中公开的方法由优选对预定的抗原或自身抗原特异的细胞得到并扩展，所述抗原或自身抗原与被靶向的变态反应或者自身免疫反应有关。被给药于个体的调节T细胞可以用作“特洛伊木马”，以便将抑制性的因子或者其它生物因子释放至炎症(比如IL-4缺乏、干细胞生长因子缺乏、血管生成调控子缺乏、或者基因缺陷)位点。
[0176]个体被治疗其基于免疫的紊乱。这里使用的术语“基于免疫的紊乱”是指其中异常免疫反应对个体中基于免疫的紊乱的发病机理做出贡献的状况、紊乱、或者疾病。异常免疫反应是任何特征为不期望有的免疫免疫反应或者自身免疫反应的个体中免疫反应。公开的治疗方法可用于治疗多种不同的其中在宿主中异常免疫反应的调整是预期的基于免疫的紊乱。基于免疫的紊乱包括、但不限于:自身免疫状况、紊乱或者疾病，移植物排斥，移植物抗宿主疾病，癌，基于免疫的炎症疾病，以及持久的和累进的对感染性非自体抗原的免疫反应，所述非自体抗原来自于细菌、病毒、真菌、或者侵入并保持在哺乳动物和人类体内的寄生生物体。这些状况和紊乱包括过敏和/或哮喘。过敏和哮喘可以归因于外来抗原或非自体抗原比如花粉、动物头皮屑和食品蛋白质的致敏作用。引发性外来抗原的来源可以是植物、真菌、霉菌、或者其它环境杂质。例如，基于免疫的紊乱可以是:自身免疫反应，而抗原是自身抗原；移植物对宿主免疫反应，而抗原是自身抗原；过敏；哮喘；组织或器官移植体排斥；或者移植物对宿主免疫反应，而抗原是提纯的或未提纯的可激发有害的免疫反应的过敏原或者移植组织或器官的组分。
[0177]自身免疫被定义为对于非感染性自体抗原的持久的和累进的免疫反应，所述非感染性的自体抗原不同于来自细菌、病毒、真菌、或者侵入并保持在哺乳动物和人类体内的寄生生物体的感染性的非自体抗原。当个体的免疫系统将自身抗原识别为外来物时，会发生自身免疫反应，导致产生自我反应性效应物免疫细胞。自身反应性效应物免疫细胞包括来自多种系谱的细胞，包括、但不限于细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、以及非胸腺依赖性B细胞。虽然精确的机制不同，罹患自体免疫疾病的个体中自体反应效应物免疫细胞的存在导致个体的组织和细胞破坏，导致病理学症状。可以按照本领域的普通技术人员所熟知的方法诊断具有自体免疫疾病的个体。可以根据症状和/或通过获得来自个体的样品、并且分离自体反应性T细胞并将个体中自体反应性T细胞的水平与对照物相比较，来识别这类个体。参见，例如，美国专利申请公开2006/0105336。许多用于确定个体中这种细胞存在、并且因此确定在个体中自体免疫疾病比如抗原特异性的自体免疫疾病存在的测定法已为本领域的技术人员所熟知，并且容易在本文公开的方法中使用。所关注的测定法包括、但不限于下述文献描述的测定法，例如，Autoimmunity36 (6-7):361-366 (2003) ;J.Pediatr.HematOl.0ncOl.25 (Suppll):S57_S61 (2003) ；Proteomics3 (II):2077-2084(2003)；Autoimmun.Rev.2 (I):43-49 (2003)。
[0178]取决于每种疾病的主要临床病理学特征，自身免疫状况、紊乱或者疾病可以被概括性地分成系统性的和器官特异性的自身免疫状况、紊乱或者疾病。系统性自身免疫状况、紊乱或者疾病包括、但不限于全身性红斑狼疮(全SLE)、斯耶格伦综合症(sj6gren/ ssyndrome)、硬皮病、变形性关节炎和多肌炎。器官特异性自身免疫状况、紊乱或者疾病可以是内分泌性的(I型糖尿病、淋巴瘤性甲状腺肿、阿狄森氏病等等)、皮肤病(寻常天疱疮、牛皮癣、硬皮病)、血液学的(自身免疫溶血性贫血)、神经系统的(多发性硬化)，或者可以涉及几乎任何限定的躯体组织物质。自体免疫状况、紊乱或者疾病包括、但不限于:急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、阿狄森氏病、过敏或者敏感性、α.磷脂抗体综合症(APS)、关节炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫胃炎、自身免疫肝炎、自身免疫内耳疾病、自身免疫多内分泌腺综合症、自身免疫性葡萄膜视网膜炎(uveoretinitis)、大疱类天疱疮、脂泻病、恰加斯式病、慢性阻塞性肺病(COPD)、结肠炎、克罗恩氏病、I型糖尿病(IDDM)、子宫内膜异位、纤维肌痛(fibromyalgia)、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合症(GBS)、淋巴瘤性甲状腺肿、化脓性汗腺炎、特发性血小板减少性紫癜、炎症性肠病、间质性膀胱炎、狼疮(包括盘状红斑狼疮、药物诱导的红斑狼疮、狼疮肾炎、新生狼疮、亚急性皮肤红斑狼疮和全身性红斑狼疮)、硬斑病、多发性硬化(MS)、重症肌无力、肌病、发作性睡病、神经肌强直(neuiOmyotonia)、寻常天疱疮、恶性贫血、夏科氏肝硬变、复发性传播脑脊髓炎(多阶段传播性脑脊髓炎)、风湿热、精神分裂症、硬皮病、斯耶格伦综合症、腱鞘炎、甲状腺炎、血管炎、以及白斑病。参见Pamela D Van Schaack&Kenneth L Tong的“用神经毒素治疗自身免疫紊乱”，美国专利申请公开2006/138059，在此通过引用将其全部内容并入本文。有许多己建立的动物模型用于使用自身抗原的T细胞表位来诱导耐受性，包括多发性硬化(EAE:实验性自身免疫脑脊髓炎)、重症肌无力(EMG:实验性重症肌无力)和神经炎(EAN:实验性自身免疫神经炎)。
[0179]本发明的一些方面部分地提供了移植物排斥。当移植的器官或组织不被移植物接受者的身体接受时，会发生移植物排斥，因为接受者的免疫系统会攻击移植的器官或组织。自适应的免疫反应、移植物排斥同时通过T细胞介导的机制和体液免疫(抗体)机制被介导。错配等位基因的数量可确定排斥反应的速度和等级。不同的机制倾向于针对不同的移植物发生反应。
[0180]移植物排斥可以被分类成超急排斥、急性排斥、或者慢性排斥。超急排斥是在具有预先存在的针对供体的抗体(例如，ABO血型分型法血型抗体)的接受者中被补体调节的反应。超急排斥发生在移植后几分钟内，并且必须立即排除以便防止严重的系统性炎症反应。发生快速的血液凝结。
[0181]急性排斥反应可以早在在移植后一周开始(与立即发生的超急排斥相反)。在移植以后头三个月，急性排斥反应的风险是最高的。然而，在移植以后在几个月到几年，还可能发生急性排斥反应。通常在移植后一周开始急性排斥反应的原因是，T细胞与排斥机制有关。这些T细胞必须在排斥开始前分化。T细胞引起移植组织中的细胞溶解、或者产生可引起移植组织坏死的细胞因子。急性排斥反应的单个急性发作不是有关是否被识别并且即时治疗的原因，并且很少导致器官破坏。在某种程度上急性排斥发生在所有的移植物中(除了同卵双生之间移植物之外)，除非通过使用免疫抑制药物来改变免疫反应。这是由错配HLA引起的，错配HLA存在于身体的所有细胞上。每种HLA都有大量不同的等位基因，因此在供体组织和接受者身体中所有的HLA之间的理想匹配是非常稀有的。
[0182]移植器官或组织的慢性排斥是由下述原因引起的排斥:很少了解的慢性炎症和针对移植组织的免疫反应。在肺移值后的慢性排斥是肺移植病人中的长期病态和死亡的主要原因。
[0183]术语“移植物排斥”中还包括的是移植物抗宿主疾病(GvHD)。GVHD是同种异基因骨髓移植的共同复杂化，其中在移植的骨髓中的功能性免疫细胞将接受者识别为“外来物”并且设置免疫学攻击。在某种情况下，其还可以发生在输血中。GVHD被分成急性形式和慢性形式。急性形式或者暴发性形式的疾病(aGVHD)通常会在移植后头100天之内被观察到，并且是移植物的主要挑战，因为与病态和死亡有关。慢性形式的移植物对宿主病(cGVHD)通常发生在100天以后。cGVHD的严重案例的适度现象不利地影响长期存活性。急性和慢性的GvHD似乎涉及不同的免疫细胞子集、不同的细胞因子分布图、多少不同的宿主标靶、以及不同的治疗反应。
[0184]急性GvHD的特征是对肝脏、皮肤和粘膜、胃肠道、免疫系统(造血系统，例如，骨髓和胸腺)本身、以及呈自发肺炎形式的肺的选择性破坏。胃肠道的急性GvHD可能导致严重的肠炎、粘膜的脱落、严重的腹泻、腹痛、恶心、以及呕吐。这典型地通过肠的活体解剖来诊断。肝GvHD通过急性病人中的胆红素水平来测量。皮肤GvHD导致斑丘疹皮疹的扩散，有时呈花边模式。急性GvHD按如下分阶段:每个器官总的等级(皮肤-肝脏-肠)分别地从低的I阶段到高的4阶段。具有等级IV GvHD的病人通常具有不良的预后。如果GvHD严重，并且需要强烈的涉及类固醇和附加试剂的免疫抑制以便控制住，病人可能发展成作为免疫抑制结果的严重的传染，并且可能死于传染。慢性GvHD还会攻击上述器官，但在它的长期过程中还可能损害结缔组织和外分泌腺。
[0185]本文中公开的抗原特异性调节T细胞也可以被用于治疗传染性疾病，所述传染性疾病中，病原性不是病原体细胞病变效应的结果、而是由针对传染剂的免疫炎性反应引起的损伤。例如，靶向在本文中公开的被表达的病毒抗原的调节T细胞能够治疗病毒诱导的免疫炎性疾病，因为这些T细胞可以被用于抑制由感染引起的局部组织损伤、并且降低引起自体免疫疾病发展的炎症。病毒诱导的免疫炎性疾病的非限制性例子包括丙型肝炎、HSV诱导的角膜炎、柯萨奇病毒诱导的胰腺炎、以及柯萨奇病毒诱导的I型糖尿病。
[0186]本文中使用的术语“治疗”是指在个体中降低、改善、或者清除基于免疫的紊乱的临床症状；或者在个体中延迟或者抑制基于免疫的紊乱的临床症状的发作。例如，术语“治疗”可以是指将基于免疫的紊乱的特征状况的症状降低例如至少20%、至少30%、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、或者至少100 %。基于免疫的紊乱的症状包括、但不限于:浮肿、充血、红斑、擦伤、脆弱、僵硬、肿大、发烧、寒战、鼻塞、憋气、呼吸困难、体液潴留、血液凝结、食欲不振、心率加快、肉芽瘤形成、机化性淋巴、出脓、不粘的血清液、溃疡、自我反应性效应物免疫细胞的产生增加、炎症、以及疼痛。与基于免疫的紊乱有关的实际症状为大家所熟知，并且可以被本领域技术人员通过考虑某些因素来确定，所述因素包括、但不限于:基于免疫的紊乱的位置、基于免疫的紊乱的原因、基于免疫的紊乱的严重程度、受基于免疫的紊乱影响的组织或器官。
[0187]本发明的一些方面部分地提供了降低与自身免疫紊乱或者移植物排斥有关的症状。在该实施方式的一个方面，被降低的症状是炎症、疲劳、眩晕、不适、升高发烧和高的体温、对手脚冷的极端敏感、肌肉和关节的虚弱和僵硬、体重变化、消化问题或者胃肠问题、低血压或者高血压、过敏性、焦虑、或者沮丧、不育或者性欲降低(低性欲)、血糖改变、以及取决于自体免疫疾病类型的器官或组织尺寸的提高、器官或者组织的破坏。
[0188]本发明的一些方面部分地提供了降低与炎症有关的症状。在该实施方式的一个方面，被降低的症状是浮肿、充血、红斑、擦伤、脆弱、僵硬、肿大、发烧、寒战、包括鼻以及支气管在内的呼吸道充血、窦道充血、呼吸问题、体液潴留、血液凝块、食欲不振、心率升高、肉芽瘤形成、机化性淋巴、出脓、或者不粘的血清液、溃疡形成、或者疼痛。
[0189]与本文中公开的治疗方法一起使用的本文中公开的调节T细胞的量典型地是治疗有效量。这里使用的术语“治疗有效量”的意义和“治疗有效剂量”是一样的，并且是指调节T细胞的量可引起专业人员在需要的个体中寻求的生物反应或者临床反应。作为非限制性实例，有效量是降低基于免疫的紊乱的症状的用量，所述症状包括、但不限于:浮肿、充血、红斑、擦伤、脆弱、硬化、肿大、发烧、寒战、鼻塞、憋气、呼吸困难、体液潴留、血液凝结、食欲不振、心率加快、肉芽瘤形成、机化性淋巴、出脓、不粘的血清液、溃疡、自我反应性效应物免疫细胞的产生增加、炎症、或者疼痛。
[0190]通过使用在此提供的指导，本领域技术人员可以确定本文中公开的方法用于特殊应用的待给药的合适有效量。例如，通过观察一种或多种临床症状、和/或与状况有关的生理学指示剂，可以确定本文中公开的调节T细胞在治疗基于免疫的紊乱的特征状况症状中的有效性。通过确定症状的严重程度、或者通过确定来自具有基于免疫的紊乱的个体的样品中自体反应性T细胞的频率，可以监控具有基于免疫的紊乱的个体对于治疗的反应。基于免疫的紊乱的症状严重程度可以与自体反应性T细胞数目相互关联。参见，例如，美国专利申请公开2006/0105336。另外，样品中自体反应性T细胞数目的增加可以被用作的指示，以便将计划的治疗应用于使得症状严重程度最小化并A/或者在症状出现以前治疗基于免疫的紊乱。作为另一个实例，借助于现有的T细胞注入治疗，通过依靠临床经验，可以确定本文中公开的调节T细胞在治疗基于免疫的紊乱的状况症状中的有效性。基于免疫的紊乱的改善还可能通过减少对同时发生的治疗的需要而被显示。本领域的技术人员将会知道与特定的基于免疫的紊乱有关的合适症状或指标，并且将会知道如何确定一个个体是否是在此公开的治疗的候选人。本领域的技术人员将认识到，个体可能的状况被监控其整个治疗过程，并且被给药的本文中公开的化合物或者组合物的有效量可能据此被调节。
[0191]在该实施方式的一些方面，本文中公开的调节T细胞的治疗有效量可将与基于免疫的紊乱有关的症状降低例如至少IO %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或者至少100%。在该实施方式的其他方面，本文中公开的调节T细胞的治疗有效量可将与基于免疫的紊乱有关的症状降低例如至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%、至多60%、至多70%、至多80%、至多90%、或者至多100%。在该实施方式的其他方面，本文中公开的调节T细胞的治疗有效量可将与基于免疫的紊乱有关的症状降低例如大约10%至大约100%、大约10%至大约90%、大约10%至大约80%、大约10%至大约70%、大约10%至大约60%、大约10%至大约50%、大约10%至大约40%、大约20%至大约100%、大约20%至大约90%、大约20%至大约80%、大约20%至大约20%、大约20%至大约60%、大约20%至大约50%、大约20%至大约40%、大约30%至大约100%、大约30%至大约90%、大约30%至大约80%、大约30%至大约70%、大约30%至大约60%、或者大约30%至大约50%。在该实施方式的其他方面，本文中公开的调节T细胞的治疗有效量是足以将与基于免疫的紊乱有关的症状降低保持如下时间的剂量:例如,至少一周、至少一个月、至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少七个月、至少八个月、至少九个月、至少十个月、至少十一个月、或者至少十二个月。
[0192]在该实施方式的其他方面，本文中公开的调节T细胞的治疗有效量是例如大约IxlO7个细胞、大约IxlO8个细胞、大约IxlO9个细胞、大约IxlOici个细胞、或者大约IxlO11个细胞。在该实施方式的其他方面，本文中公开的调节T细胞的治疗有效量是例如至少IxlO7个细胞、大约IxlO8个细胞、大约IxlO9个细胞、大约IxlOici个细胞、或者大约IxlO11个细胞。在该实施方式的其他方面，本文中公开的调节T细胞的治疗有效量是在下述之间:例如，大约IxlO7个细胞至大约IxlO11个细胞、大约IxlO8个细胞至大约IxlO11个细胞、大约IxlO9个细胞至大约IxlO11个细胞、大约IxIOki个细胞至大约IxlO11个细胞、大约IxlO7个细胞至大约IxlOici个细胞、大约IxlO8个细胞至大约IxIOki个细胞、大约IxlO9个细胞至大约IxIOki个细胞、或者大约IxlO8个细胞至大约IxlO9个细胞。
[0193]本文中公开的调节T细胞可能以多种方式被给药。作为非限制性的实例，细胞可以被静脉内释放至邻接于待被抑制的免疫反应位置的体腔比如腹膜内的腔体，或者直接注射在免疫反应位点之内或者邻接位点。静脉内给药例如有利于许多这些状况的治疗。
[0194]通过使用普通的药学可接受的用于通过注射给药的肠胃外赋形剂，本文中公开的调节T细胞可以被配制成药物和药物组合物。这些赋形剂可以是无毒的和治疗性的，并且许多配方在Remington' s Pharmaceutical Sciences中被阐明。赋形剂的非限制性例子是盐水、Ringer溶液、盐水-葡萄糖溶液、以及Hank平衡盐液。药物组合物还可以含有少量的添加剂比如用于保持等渗性、生理pH、以及稳定性的物质。包含本文中公开的调节T细胞的药物和组合物可以呈单位剂量形式。一般来讲，单位剂量含有治疗有效量的调节T细胞。该量将通常取决于年龄、身量、病人性别、待治疗的状况及其严重程度、细胞状况、以及它们的由样品供体得到的原始特征。滴定剂量以便识别治疗有效剂量的方法已为本领域技术人员所熟知。一般来讲，调节T细胞的治疗有效量可能是从大约IxlO7至大约IxlO11个。
[0195]本申请说明书的一些方面部分地公开了一种试剂盒，其包含对进行在此公开的任何一种方法有用的成分。
[0196]在一种实施方式中，用于识别、分离、和/或富集免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒包含必需的成分。在该实施方式的一个方面，用于识别和/或分离或者富集免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒包含CD6生物标志物配体。
[0197]在该实施方式的另一个方面，用于识别、分离、和/或富集免疫抑制性调节T细胞群的试剂盒包含至少两种不同生物标志物配体，其中所述至少两种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体。
[0198]在该实施方式的另一个方面，用于识别、分离、和/或富集免疫抑制性调节T细胞群的试剂盒包含至少两种不同生物标志物配体，其中所述至少两种不同生物标志物配体包括⑶6生物标志物配体和⑶127生物标志物配体。
[0199]在一种实施方式中，试剂盒被设计成一步染色方案，该方案使用全血、并且使用三种不同的细胞表面生物标志物配体。在该实施方式的一个方面，试剂盒包含CD4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体、以及⑶6生物标志物配体。在该实施方式的另一个方面,试剂盒包含⑶25生物标志物配体、⑶6生物标志物配体、以及⑶127生物标志物配体。在该实施方式的另一个方面，试剂盒包含⑶6生物标志物配体、⑶127生物标志物配体、以及⑶49d生物标志物配体。在该实施方式的又一个方面，试剂盒包含⑶6生物标志物配体、⑶127生物标志物配体、以及⑶38生物标志物配体。在该实施方式的另一个方面，试剂盒包含⑶6生物标志物配体、⑶49d生物标志物配体、以及⑶38生物标志物配体。在该实施方式的另一个方面，试剂盒包含FOXPS生物标志物配体作为阳性对照。
[0200]在该实施方式的又一个方面，用于识别、分离、和/或富集免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒包含至少三种不同生物标志物配体，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括⑶4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体、以及⑶6生物标志物配体。
[0201]在该实施方式的又一个方面，用于识别、分离、和/或富集免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒包含至少三种不同生物标志物配体，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体、⑶6生物标志物配体、以及⑶127生物标志物配体。
[0202]在该实施方式的其他方面，本文中公开的用于识别、分离、和/或富集免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒可以进一步包括⑶49d生物标志物配体、⑶38生物标志物配体、⑶45RA生物标志物配体、HLA-DR生物标志物配体、FoxP3生物标志物配体、CTLA-4生物标志物配体、GITR生物标志物配体、LAG-3生物标志物配体、⑶39生物标志物配体、Helios生物标志物配体、FcRL3生物标志物配体、CCR7生物标志物配体、CCR4生物标志物配体、CCR8生物标志物配体、⑶62L生物标志物配体、ICOS生物标志物配体、⑶103生物标志物配体、PD.1生物标志物配体、⑶134生物标志物配体、GARP生物标志物、⑶45RB生物标志物、⑶45R0生物标志物、⑶95生物标志物、⑶122生物标志物、⑶147生物标志物、⑶8生物标志物配体、或者它们的任意组合。在该实施方式的其他方面，用于识别、分离、和/或富集免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒可以进一步包括阳性对照和/或阴性对照、和/或通过使用试剂盒的内容物来识别、分离、和/或富集免疫抑制性调节T细胞种群的说明书。在该实施方式的另一个方面，用于识别、分离、和/或富集免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒可以进一步包括为扩展免疫抑制性调节T细胞种群所必需的成分。
[0203]在另一个实施方式中，试剂盒包含为扩展免疫抑制性调节T细胞种群所必需的成分。在该实施方式的一个方面，用于扩展免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒包含刺激性组合物。在该实施方式的一个方面，刺激性组合物包含有效量的抗原或者异源抗原。在该实施方式的其他方面，刺激性组合物包含有效量的TCR/CD3活化剂。在该实施方式的其他方面，刺激性组合物还包括共同刺激性试剂、第二调节T细胞刺激性试剂、或者它们的任何组合物。在该实施方式的另一个方面，用于扩展免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒包含刺激性组合物，该刺激性组合物包括α -⑶3抗体、α -⑶28抗体、IL_2或m.15、以及TGF β或雷帕霉素。在该实施方式的其他方面，用于扩展免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒可以进一步包括阳性对照和/或阴性对照、和/或通过使用试剂盒的内容物来扩展免疫抑制性调节T细胞种群的说明书。在该实施方式的其他方面，用于扩展免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒可以进一步包括培养容器，比如培养皿或者培养瓶、培养基、或者任何必要的对促进细胞生长有用的缓冲液、因子。在另一个方面，用于扩展免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒还可以包括本文中公开的CD6生物标志物配体、至少两种不同生物标志物配体、或者至少三种不同生物标志物配体。
[0204]这些被公开的生物标志物可以是抗体或者配体，并且可以被标记或者未被标记。如果被标记，生物标志物配体可以以共价方式或非共价方式与如下物质相连接:荧光基团、量子点、磷光基团(phosphore)、化学发光化合物、生物发光化合物、显色化合物、同位素化合物比如镧系元素、放射性同位素、酶、生物素或者亲和素分子、或任何对于检测被生物标志物结合的细胞有用的其他标记物。如果未做标记，则试剂盒可以进一步包括标记物和其他对生物标志物配体进行标记有用的试剂。将标记物附接于抗体的方法已为本领域的技术人员所熟知。特别优选的标记物是这样的标记物:其通过连接物被附接于生物标志物配体，所述连接物可以容易地被裂解或者分离、或者通过与预定的酶与接触而在生理条件下经受水解。在该实施方式的一个方面，CD4生物标志物配体是荧光标记的抗CD4单克隆抗体，⑶25生物标志物配体是荧光标记的抗⑶25单克隆抗体，⑶6生物标志物配体是荧光标记的抗⑶6单克隆抗体，并且⑶127生物标志物配体是荧光标记的抗⑶127单克隆抗体。
[0205]本文公开的刺激性组合物可以包含有效量的抗原特异性的TCR/⑶3活化剂。刺激性组合物可以进一步包括一种或多种附加的试剂，例如共同刺激性试剂、第二调节T细胞刺激性试剂、或者通常可促进T细胞存活和/或生长的试剂。刺激性组合物可能在溶液或悬浮液中、或者被固定化在固体表面比如寄主细胞、珠子、或者其它的基材上。适合用作基材的细胞包括可呈递人工抗原的细胞(aAPCs)。珠子可以是塑料珠、玻璃珠、磁珠、或者任何其它合适的材料，典型的直径范围为I μ M至20ρΜ。刺激性组合物、TCR/CD3活化剂、共同刺激性试剂、第二调节T细胞刺激性试剂、以及存活和/或培养促进性因子在本文中有描述。
[0206]本文中公开的说明书可以呈多种形式存在于试剂盒中，一种或多种形式说明书可以存在于试剂盒中。这些说明书中的一种形式可以是在合适的介质或基材的打印信息，例如在试剂盒包装中、包装说明书等中的纸张上印刷该信息。另一种手段是电脑可读的介质例如磁盘、磁带、或者CD，其上已经记录所述信息。另一种手段是出现在网址上，可以通过使用因特网在取出的地址来获取该信息。可以以任何方便的方式存在于试剂盒中。
[0207]本申请说明书的一些方面部分地公开了一种组合物，其包含根据本文中公开的方法获得的免疫抑制性调节T细胞种群。在一个实施方式，包含本文中公开的免疫抑制性调节T细胞种群的组合物是根据获得本文中公开的免疫抑制性调节T细胞种群的方法制造的。在另一个实施方式中，包含本文中公开的免疫抑制性调节T细胞种群的组合物是根据扩展本文中公开的免疫抑制性调节T细胞种群的方法制造的。在该实施方式的一个方面，免疫抑制性调节T细胞种群包括:包含⑶6ffi/-表达模式的免疫抑制性调节T细胞，包含⑶25+CD6ffi/_表达模式的免疫抑制性调节T细胞，包含⑶6—表达模式的免疫抑
制性调节T细胞，包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式的免疫抑制性调节T细胞，包含⑶25+CD6低⑶127低表达模式的免疫抑制性调节T细胞、或者包含ra4+CD25+ra6ffi/TD127ffi/-表达模式的免疫抑制性调节T细胞。
[0208]在另一个实施方式中，包含本文中公开的免疫抑制性调节T细胞种群的组合物是药物组合物。可以通过将治疗有效量的本文中公开的免疫抑制性调节T细胞与普通的可接受的药物赋形剂合并而制备出药物组合物。治疗有效量的调节T细胞典型地是在此本文中公开的治疗有效量，并且典型地为大约IxlO7个细胞至大约IxlO11个细胞。优选当给药于个体时，药物组合物不生产不利的、过敏的、或者其它不幸的或者不期望有的反应。在此公开的药物组合物可以用于医学和兽医应用。可以单独地、或者与其它补充的活性化合物、试剂、药物或激素结合而将药物组合物给药于个体。可以使用包括、但不限于下述多种工艺中的任何一种来制造药物组合物:常规混合、溶解、粒化、糖衣制作、磨光、乳化、装入胶囊、捕集、以及冻干。药物组合物可能采取包括、但不限于下述多种形式中的任何一种:无菌溶液、悬浮液、或者任何其它适合给药的剂量形式。
[0209]在另一个实施方式中，在治疗本文公开的个体中基于免疫的紊乱的方法中使用包含本文中公开的免疫抑制性调节T细胞种群的组合物。在又一个实施方式中，包含本文中公开的免疫抑制性调节T细胞种群的组合物被用于制造药物，该药物用于治疗本文中公开的基于免疫的紊乱。
[0210]本申请说明书的一些方面部分地公开了一种在个体中富集免疫抑制性调节T细胞的方法。在一个方面，本文公开的方法包括将a.CD6抗体给药于个体，其中所述给药可提供的是不宜操作的包含⑶表达模式的T细胞、而不是包含⑶表达模式的T细胞，从而在个体中富集免疫抑制性调节T细胞种群。
[0211]可用于实施本文中公开的方法的抗CD6抗体在下述文献中有描述:例如Starlingetal.，抗人类CD6的单克隆抗体，US6，372，215 ;以及Casimiro，et al.，抗CD6单克隆抗体及其应用，US6，572，857，在此通过引用将每个文献的全部内容并入本文。α -⑶6抗体可以是本文中公开的任何种类的抗体。
[0212]可以通过使用任何合适的剂量配方和给药途径来给药α-⑶6抗体。例如，包含α -⑶6抗体的组合物可以通过注射给药。
[0213]与本文中公开的在个体中富集免疫抑制性调节T细胞的方法一起使用的本文中公开的a-CD6抗体的用量典型地是治疗有效量。关于在个体中用于富集免疫抑制性调节T细胞的被给药的a-CD6抗体，治疗有效量是指下述a-CD6抗体的量:其可引起专业人员在需要的个体中寻求的生物反应或者临床反应。作为非限制性的实例，a-CD6抗体的有效量是足以在个体中富集免疫抑制性调节T细胞的量。
[0214]在该实施方式的一些方面，α-⑶6抗体的治疗有效量是这样的量:在个体中与包含CD6ffi/-表达模式的细胞数目相比，提供不宜操作的包含CD6^+表达模式的免疫抑制性调节T细胞种群例如至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、或者至少60%、至少70%、至少80%、或者至少90%。在该实施方式的其他方面，α -⑶6抗体的治疗有效量是这样的量:在个体中与包含CD6ffi/-表达模式的细胞数目相比，提供不宜操作的包含CD6^+表达模式的免疫抑制性调节T细胞种群例如至少两倍、至少四倍、至少八倍、至少十倍、至少20倍、至少50倍、或至少100倍。
[0215]在该实施方式的一些方面，α α.⑶6抗体的治疗有效量是这样的量:在个体中与包含⑶6^+表达模式的细胞数目相比，可富集包含⑶表达模式的免疫抑制性调节T细胞种群例如至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、或至少60 %、至少70 %、至少80 %、或至少90%。在该实施方式的其他方面，c a -CD6抗体的治疗有效量是这样的量:在个体中与包含⑶6表达模式的细胞数目相比，可富集包含⑶表达模式的免疫抑制性调节T细胞种群例如至少两倍、至少四倍、至少八倍、至少十倍、至少20倍、至少50倍、或至少100倍。
[0216]本申请说明书的一些方面还可以描述如下:
1.一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；其中包含⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
2.一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:使包含T细胞种群的样品与CD6生物标志物配体相接触；以及筛选T细胞种群，以便检测CD6生物标志物的细胞表达水平；其中包含⑶4+⑶25+⑶6—表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
3.一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，其中，所述至少两种不同生物标志物包括⑶25生 物标志物和⑶6生物标志物；
其中包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
4.一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触，其中，所述至少两种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体；以及
筛选T细胞种群，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中至少两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物；
其中包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
5.一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:
筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，其中，所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；
其中包含⑶4+CD25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
6.一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:
使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括⑶4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体、以及⑶6生物标志物配体；以及 筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；
其中包含⑶4+CD25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
7.如实施方式1-6所述的方法,其中，该方法还包括:分离或者富集免疫抑制性调节T细胞种群。
8.如实施方式7所述的方法，其中，该方法还包括:用刺激性组合物扩展免疫抑制性调节T细胞种群。
9.一种获得免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:
筛选包含T细胞种群的样品，以便检测CD6生物标志物的细胞表达水平；以及分离包含CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
10.一种获得免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:
使包含T细胞种群的样品与CD6生物标志物配体相接触；以及筛选T细胞种群，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；以及分离包含⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
11.一种获得免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:
筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，其中所述至少两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物；以及
分离包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
12.—种获得免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:
使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触，其中，所述至少两种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体；
筛选T细胞种群，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物；以及
分离包含⑶25+⑶表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
13.一种获得免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:
筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，其中，所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；以及
分离包含⑶4+⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
14.一种获得免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括:
使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括⑶4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体、以及⑶6生物标志物配体；
筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；以及分离包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。 15.如实施方式9.14所述的方法，其中，该方法还包括:扩展免疫抑制性调节T细胞种群。
16.一种获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括下述步骤:
筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；分离包含⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及使包含⑶表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
17.一种获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括下述步骤:
使包含T细胞种群的样品与CD6生物标志物配体相接触；以及筛选T细胞种群，以便检
测⑶6生物标志物的细胞表达水平；分离包含⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及使包含CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
18.一种获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括下述步骤:
筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，其中,所述至少两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物；
分离包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及使包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
19.一种获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括下述步骤:
使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触，其中，所述至少两
种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体；以及
筛选T细胞种群，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物；
分离包含⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及
使包含⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
20.一种获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括下述步骤:
筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，其中，所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；
分离包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及
使包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
21.一种获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括下述步骤:
使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少三种
不同生物标志物配体包括⑶4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体、以及⑶6生物标志物配体；以及
筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；
分离包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及
使包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群与刺激性组合物相接触，从而获得扩展的免疫抑制性调节T细胞种群。
22.—种治疗个体中基于免疫的紊乱的方法，该方法包括:
获得生物样品，该生物样品包含个体兼容的T细胞种群；
筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；
分离包含⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及将具有⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。
23.一种治疗个体中基于免疫的紊乱的方法，该方法包括:
获得生物样品，该生物样品包含个体兼容的T细胞种群；
使包含T细胞种群的样品与CD6生物标志物配体相接触；以及筛选T细胞种群，以便检测⑶6生物标志物的细胞表达水平；分离包含⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及将具有CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。
24.一种治疗个体中基于免疫的紊乱的方法，该方法包括:
获得生物样品，该生物样品包含个体兼容的T细胞种群；.筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，其中,所述至少两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物；
分离包含⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及
将具有CD25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。
25.一种治疗个体中基于免疫的紊乱的方法，该方法包括:
获得生物样品，该生物样品包含个体兼容的T细胞种群；
使包含T细胞种群的样品与至少两种不同生物标志物配体相接触，其中，所述至少两种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体；以及
筛选T细胞种群，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物；
分离包含⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及
将具有⑶25 +⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。
26.一种治疗个体中基于免疫的紊乱的方法，该方法包括:
获得生物样品，该生物样品包含个体兼容的T细胞种群；
筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，其中，所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；
分离包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及
将具有CD4+CD25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。
27.一种治疗个体中基于免疫的紊乱的方法，该方法包括:
获得生物样品，该生物样品包含个体兼容的T细胞种群；
使包含T细胞种群的样品与至少三种不同生物标志物配体相接触，其中所述至少三种不同生物标志物配体包括⑶4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体、以及⑶6生物标志物配体；以及
筛选T细胞种群，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平；其中所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；
分离包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及
将具有CD4+CD25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内，从而在个体中治疗基于免疫的紊乱。
28.如实施方式22和23所述的方法，其中，该方法还包括:在将具有⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于个体体内之前，用刺激性组合物扩展具有CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群。
29.如实施方式24和25所述的方法，其中，该方法还包括:在将具有具有⑶25+⑶6?h表达模式的T细胞亚群给药于个体体内之前，用刺激性组合物扩展具有⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群。
30.如实施方式26和27所述的方法，其中，该方法还包括:在将具有⑶4+⑶25+CD6?卜表达模式的T细胞亚群给药于个体体内之前，用刺激性组合物扩展具有⑶4 +⑶25+CD6 ?h表达模式的T细胞亚群。
31.如实施方式8、16-21和28-30所述的方法，其中，所述刺激性组合物包含抗原特异性的TCR/⑶3活化剂。
32.如实施方式31所述的方法，其中，刺激性组合物还包括共同刺激性试剂、第二调节T细胞刺激性试剂、或T细胞存活剂或者生长剂。
33.如实施方式32所述的方法，其中，刺激性组合物包含eα -⑶3抗体、α -⑶28抗体、IL-2或IL.15、以及TGFP或者雷帕霉素。
34.如实施方式1.33所述的方法，其中，样品是PBMC样品。
35.如实施方式1-33所述的方法，其中，样品是血液样品、淋巴组织样品、胸腺样品、胰腺样品、眼睛样品、心脏样品、肝脏样品、神经样品、肠样品、皮肤样品、肌肉样品、软骨样品、或韧带样品。
36.如实施方式1、2、7、8、15.17、22、23、28和31-35所述的方法，其中，CD6生物标志物配体是荧光标记的抗CD6单克隆抗体。
37.如实施方式3、4、7、8、15、18、19、24、25、29和31-35所述的方法，其中，CD25生物标志物配体是荧光标记的抗⑶25单克隆抗体，并且⑶6生物标志物配体被荧光标记的抗⑶6单克隆抗体。
38.如实施方式5-8、15、20、21、26、27和30-35所述的方法，其中，CD4生物标志物配体是荧光标记的抗CD4单克隆抗体，CD25生物标志物配体是荧光标记的抗CD25单克隆抗体，⑶6生物标志物配体是荧光标记的抗⑶6单克隆抗体。
39.如实施方式1.38所述的方法，其中，该方法进一步包括⑶127生物标志物配体、⑶49d生物标志物配体、⑶38生物标志物配体、⑶45RA生物标志物配体、HLA-DR生物标志物配体、FoxP3生物标志物配体、CTLA-4生物标志物配体、GITR生物标志物配体、LAG-3生物标志物配体、⑶39生物标志物配体、Helios生物标志物配体、FcRL3生物标志物配体、CCR7生物标志物配体、CCR4生物标志物配体、CCR8生物标志物配体、⑶62L生物标志物配体、ICOS生物标志物配体、⑶103生物标志物配体、PD.1生物标志物配体、⑶134生物标志物配体、GARP生物标志物配体、⑶45RB生物标志物配体、⑶45R0生物标志物配体、⑶95生物标志物配体、⑶122生物标志物配体、⑶147生物标志物配体、⑶8生物标志物配体、或它们的任何
组合物。
40.如实施方式1-39所述的方法，其中，该方法进一步包括⑶127生物标志物、⑶49d生物标志物、⑶38生物标志物、⑶45RA生物标志物、HLA-DR生物标志物、FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、GITR生物标志物、LAG-3生物标志物、⑶39生物标志物、HeIios生物标志物、FcRL3生物标志物、CCR7生物标志物、CCR4生物标志物、CCR8生物标志物、⑶62L生物标志物、ICOS生物标志物、⑶103生物标志物、PD-1生物标志物、⑶134生物标志物、GARP生物标志物、⑶45RB生物标志物、⑶45R0生物标志物、⑶95生物标志物、⑶122生物标志物、⑶147生物标志物、⑶8生物标志物、或它们的任何组合物。
41.如实施方式1-40所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶127生物标志物的细胞表达水平，其中还包含⑶127ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
42.如实施方式1-41所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶49d生物标志物的细胞表达水平，其中还包含⑶49dffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
43.如实施方式1-42所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶38生物标志物的细胞表达水平，其中还包含⑶38—表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
44.如实施方式1-43所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶45RA生物标志物的细胞表达水平，其中还包含⑶45RAffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
45.如实施方式1-44所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测HLA-DR生物标志物的细胞表达水平，其中还包含HLA-DR+Kffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
46.如实施方式1-45所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测FoxP3生物标志物的细胞表达水平，其中还包含FOXP3+B8ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
47.如实施方式1-46所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测CTLA-4生物标志物的细胞表达水平，其中还包含CTLA-4+B8ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
48.如实施方式1-47所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测GITR生物标志物的细胞表达水平，其中还包含GITR+—表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
49.如实施方式1-48所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测LAG-3生物标志物的细胞表达水平，其中还包含LAG-3+B8ffi/-表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
50.如实施方式1-49所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶39生物标志物的细胞表达水平，其中还包含⑶39+表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
51.如实施方式1-50所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测Helios生物标志物的细胞表达水平，其中还包含Helios+表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
52.如实施方式1-51所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测FcRL3生物标志物的细胞表达水平，其中还包含FcRL3+卜表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
53.如实施方式1-52所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测CCR7生物标志物的细胞表达水平，其中还包含CCR7+B8ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
54.如实施方式1-53所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测CCR4生物标志物的细胞表达水平，其中还包含CCR4+B8ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
55.如实施方式1-54所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测CCR8生物标志物的细胞表达水平，其中还包含CCR8+sSffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
56.如实施方式1-55所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶62L生物标志物的细胞表达水平，其中还包含⑶62L+—表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
57.如实施方式1-56所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测ICOS生物标志物的细胞表达水平，其中还包含ICOS表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
58.如实施方式1-57所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶103生物标志物的细胞表达水平，其中还包含⑶103+卜表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
59.如实施方式1-58所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测ro-1生物标志物的细胞表达水平，其中还包含ro-1+B8ffi卜表达模式的τ细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节τ细胞种群。
60.如实施方式1-59所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶134生物标志物的细胞表达水平，其中还包含⑶134 表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
61.如实施方式1-60所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测GARP生物标志物的细胞表达水平，其中还包含GARP+B8ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
62.如实施方式1-61所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶45RB生物标志物的细胞表达水平，其中还包含⑶45RB +s8ffi卜表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
63.如实施方式1-62所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶45R0生物标志物的细胞表达水平，其中还包含⑶45R0+表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
64.如实施方式1-63所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶95生物标志物的细胞表达水平，其中还包含⑶95+§^卜表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
65.如实施方式1-64所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶122生物标志物的细胞表达水平，其中还包含⑶122+B8ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
66.如实施方式1-65所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶147生物标志物的细胞表达水平，其中还包含⑶147+B8ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
67.如实施方式1-66所述的方法，其中，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶8生物标志物的细胞表达水平，其中还包含⑶8+卜表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
68.一种用于识别、分离、和/或富集免疫抑制性调节T细胞群的试剂盒，试剂盒包含⑶6生物标志物配体。
69.如实施方式68所述的试剂盒， 其中，CD6生物标志物配体是荧光标记的抗CD6单克隆抗体。
70.一种用于识别、分离、和/或富集免疫抑制性调节T细胞群的试剂盒，该试剂盒包含至少两种不同生物标志物配体，所述至少两种不同生物标志物配体包括CD25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体。
71.如实施方式70所述的试剂盒，其中，CD25生物标志物配体是荧光标记的抗CD25单克隆抗体，CD6生物标志物配体是荧光标记的抗CD6单克隆抗体。
72.一种用于识别、分离、和/或富集免疫抑制性调节T细胞群的试剂盒，该试剂盒包含至少两种不同生物标志物配体，所述至少两种不同生物标志物配体包括CD6生物标志物配体和⑶127生物标志物配体。
73.如实施方式72所述的试剂盒，其中，CD6生物标志物配体是荧光标记的抗CD6单克隆抗体，⑶127生物标志物配体是荧光标记的抗⑶127单克隆抗体。
74.一种用于识别、分离、和/或富集免疫抑制性调节T细胞群的试剂盒，该试剂盒包含至少三种不同生物标志物配体，所述至少三种不同生物标志物配体包括CD4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体。
75.如实施方式74所述的试剂盒，其中，CD4生物标志物配体是荧光标记的抗CD4单克隆抗体，⑶25生物标志物配体是荧光标记的抗⑶25单克隆抗体，CD6生物标志物配体是荧光标记的抗⑶6单克隆抗体。
76.一种用于识别、分离、和/或富集免疫抑制性调节T细胞群的试剂盒，该试剂盒包含至少三种不同生物标志物配体，所述至少三种不同生物标志物配体包括⑶25生物标志物配体、⑶6生物标志物配体和⑶127生物标志物配体。
77.如实施方式76所述的试剂盒，其中，CD25生物标志物配体是荧光标记的抗CD25单克隆抗体，CD6生物标志物配体是荧光标记的抗CD6单克隆抗体，CD 127生物标志物配体是荧光标记的抗CD127单克隆抗体。78.如实施方式68-77所述的试剂盒，其中，该试剂盒进一步包括⑶49d生物标志物配体、⑶38生物标志物配体、⑶45RA生物标志物配体、HLA-DR生物标志物配体、FoxP3生物标志物配体、CTLA-4生物标志物配体、GITR生物标志物配体、LAG-3生物标志物配体、⑶39生物标志物配体、Helios生物标志物配体、FcRL3生物标志物配体、CCR7生物标志物配体、CCR4生物标志物配体、CCR8生物标志物配体、⑶62L生物标志物配体、ICOS生物标志物配体、⑶103生物标志物配体、PD-1生物标志物配体、⑶134生物标志物配体、GARP生物标志物配体、⑶45RB生物标志物配体、⑶45R0生物标志物配体、⑶95生物标志物配体、⑶122生物标志物配体、⑶147生物标志物配体、⑶8生物标志物配体、或它们的任何组合物。
79.一种用于扩展免疫抑制性调节T细胞种群的试剂盒，该试剂盒包含刺激性组合物。
80.如实施方式79所述的试剂盒，其中，刺激性组合物包含抗原特异性的TCR/CD3活化剂。
81.如实施方式79和80所述的试剂盒，其中，刺激性组合物还包括共同刺激性试剂、第二调节T细胞刺激性试剂、或T细胞存活剂或者生长剂。
82.如实施方式79所述的试剂盒，其中，刺激性组合物包含α-⑶3抗体、α -⑶28抗体、IL-2或IL-15、以及TGF0或者雷帕霉素。
83.如实施方式79-82所述的试剂盒，其中，试剂盒还包括CD6生物标志物配体或者如实施方式68-79中任何一个所述的试剂盒。
84.如实施方式79- 81所述的试剂盒，其中，试剂盒还包括⑶25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体、或者如实施方式68-79中任何一个所述的试剂盒。
85.如实施方式79-81所述的试剂盒，其中，试剂盒还包括⑶6生物标志物配体和⑶127生物标志物配体、或者如实施方式68-79中任何一个所述的试剂盒。
86.如实施方式79-81所述的试剂盒，其中，试剂盒还包括⑶4生物标志物配体、⑶25生物标志物配体和CD6生物标志物配体、或者如实施方式68-79中任何一个所述的试剂盒。
87.如实施方式79-81所述的试剂盒，其中，试剂盒还包括⑶25生物标志物配体、⑶6生物标志物配体和⑶127生物标志物配体、或者如实施方式68-79中任何一个所述的试剂盒。
88.—种组合物，其包含根据如实施方式7-22或31-67所述的方法获得的免疫抑制性调节T细胞种群。
89.如实施方式88所述的组合物，其中，组合物是药物组合物。
90.一种在个体中富集免疫抑制性调节T细胞的方法，该方法包括:将a -CD6抗体给药于个体，其中给药提供的是不宜操作的包含CD6^+表达模式的T细胞、而不是包含CD6 ?h表达模式的T细胞，从而在个体中富集免疫抑制性调节T细胞种群。
91.一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集的方法，该方法包括下述步骤:
筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、⑶6生物标志物、以及一个附加的生物标志物的细胞表达水平，所述一个附加的生物标志物是FoxP3生物标志物、⑶45RA生物标志物、CCR4生物标志物、⑶39生物标志物、或HLA-DR生物标志物；
其中免疫抑制性调节T细胞的四个不同的成熟子集的检测是以下述方式为基础的:i) CD4+CD25+CD6 ? 7XD45RA+表达模式与CCR4低表达模式、CD39低表达模式、或HLA-Dr ?表达模式相结合；ii)⑶4+⑶25+CD6ffi/TD45RA+表达模式与CCR4-表达模式、⑶39-表达模式、或HLA-Dr-表达模式相结合；iii) CD4+CD25 */+CD6低表达模式与CCR4高/+表达模式、⑶45RA-表达模式、⑶39*/+表达模式、或HLA-Drffi/_表达模式相结合；以及iv)⑶4+⑶25+⑶6+表达模式与CR4*/+表达模式、C D45RA_表达模式、⑶39ffi/_表达模式、或HLA-Dr ? —表达模式相结合。
92.如实施方式91所述的方法，其中，免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集之一是自然的或者休眠的免疫抑制性调节T细胞种群子集，所述自然的或者休眠的免疫抑制性调节T细胞种群子集包含⑶4+⑶25+⑶6 7TDASRA+CCRf表达模式、⑶4+⑶25+⑶6低 ACD45RA+CD39-表达模式、或 CD4+CD25+CD64ffi 7XDASRA+HLA-Dr-表达模式。
93.如实施方式91或92所述的方法，其中，免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集之一是未成熟的或者记忆性的免疫抑制性调节T细胞种群子集，所述未成熟的或者记忆性的免疫抑制性调节T细胞种群子集包含⑶4+CD25+⑶6<￡/工045狀+0^4<￡表达模式、CD4+CD25+CD6 ? ACD45RA+CD39 低表达模式、或 CD4+CD25+CD6 ? ^OMSRA+HLA-Dr 低表达模式。
94.如实施方式91-93所述的方法，其中，免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集之一是成熟的或者效应物免疫抑制性调节T细胞种群子集，所述成熟的或者效应物免疫抑制性调节T细胞种群子集包含CD4+CD25*/+CD6ffi Accimsa表达模式、CD4+CD25 */+CD6 ? ACD45RA-表达模式、CD4+CD25 * /+CD6 ? 7XD39 */+ 表达模式、CD4+CD25 * /+CD6 ? 7XCR4高 iaMSRA-表达模式、CD4+CD25 * /+CD6 ? 7XCR4 高 /+CD39 */+ 表达模式、或者 CD4+CD25 * /+CD6低ACCR4 * /+HLA-DR低表达模式。
95.如实施方式91-94所述 的方法，其中，免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集之一是末端分化的免疫抑制性调节T细胞种群子集，所述末端分化的免疫抑制性调节 T 细胞种群子集包含 aM+a^S^+CDe^+CCIM?.表达模式、CD4+CD25*/+CD6*/+CD45RA-表达模式、CD4+CD25 * /+CD6 * /+CD39 低表达模式、CD4+CD25 * /+CD6 * /+HLA-Dr 低表达模式、CD4+CD25 * /+CD6 高 /+CCR4 高 /+CD45RA_ 表达模式、CD4+CD25 高 /+CD6 高 /+CCR4 * /+CD39 低表达模式、或者 CD4+CD25 * /+CD6 * /+CCR4 * /+HLA_DR低表达模式。
96.一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集的方法，该方法包括下述步骤:
筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、⑶127生物标志物、以及一个附加的生物标志物的细胞表达水平，所述一个附加的生物标志物是FoxP3生物标志物、⑶45RA生物标志物、CCR4生物标志物、⑶39生物标志物、或HLA-DR生物标志物；
其中免疫抑制性调节T细胞的四个不同的成熟子集的检测是以下述方式为基础的:i)CD4+CD25+CD127ffi/TD45RA+表达模式与CCR4低表达模式、CD39低表达模式、或HLA-Dr ?表达模式相结合；ii)⑶4+⑶25+⑶127ffi/TD45RA+表达模式与CCR4-表达模式、⑶39-表达模式、或HLA-Dr-表达模式相结合；i i i) CD4+CD2 5 * /+CD12 7 表达模式与CCR4 */+表达模式、⑶45RA-表达模式、⑶39*/+表达模式、或HLA-Drffi/_表达模式相结合；以及iv)CD4+CD25+CD127+表达模式与CR4*/+表达模式、CD45RA-表达模式、CD39ffi/-表达模式、或HLA-Dr ? —表达模式相结合。97.如实施方式96所述的方法，其中，免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集之一是自然的或者休眠的免疫抑制性调节T细胞种群子集，所述自然的或者休眠的免疫抑制性调节T细胞种群子集包含⑶4+⑶25+⑶127ffi/TD45RA+CCR4-表达模式、CD4+CD25+CD127? /XD45RA+CD39_ 表达模式、或 CD4+CD25+CD127? /_0045^^-0^ 表达模式。
98.如实施方式96或97所述的方法，其中，免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集之一是未成熟的或者记忆性的免疫抑制性调节T细胞种群子集，所述未成熟的或者记忆性的免疫抑制性调节T细胞种群子集包含⑶4+CD25+⑶127ffi/XD45RA+CCR4ffi表达模式、CD4+CD25+CD127 <￡/-0)45狀+0039<￡表达模式、或 CD4+CD25+CD127 ^OMSRA+HLA-Drffi表达模式。
99.如实施方式96-98所述的方法，其中，免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集之一是成熟的或者效应物免疫抑制性调节T细胞种群子集，所述成熟的或者效应物免疫抑制性调节τ细胞种群子集包含CD4+CD25*/+CD127ffi/TCR4*/+表达模式、CD4+CD25*/+CD127 ? ACD45RA-表达模式、CD4+CD25 * /+CD127 ? /-CD39 */+ 表达模式、CD4+CD25 * /+CD127 低/-(:0?4高/+0)45狀-表达模式、CD4+CD25 高/+CD127ffi/TCR4*/+CD39 *表达模式、或者 CD4+CD25高/+CD127低7XCR4高/+HLA-DR低表达模式。
100.如实施方式96-99所述的方法，其中，免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集之一是末端分化的免疫抑制性调节T细胞种群子集，所述末端分化的免疫抑制性调节T细胞种群子集包含0)4+0)25^+0)127^+0^4*1表达模式、CD4+CD25W+CD127 */+CD45RA-表达模式、CD4+CD25 高/+CD127 高4CD39 低表达模式、CD4+CD25 高/+CD127 高/+HLA_Dr低表达模式、CD4+CD25 高/+CD127 高/+CCR4*/+CD45RA-表达模式、CD4+CD25 高/+CD127 高/+CCR4 高4CD39 低表达模式、或者 CD4+CD25 * /+CD127? /+CCR4 * /+HLA_DR低表达模式。
101.如实施方式91-100所述的方法,其中，该方法还包括:分离或者富集免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集中的一`个或多个。
102.如实施方式91-101所述的方法，其中，该方法还包括:用刺激性组合物扩展免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集中的一个或多个。
103.如实施方式102所述的方法，其中，刺激性组合物包含抗原特异性的TCR/⑶3活化剂。
104.如实施方式102或103所述的方法，其中，刺激性组合物还包括共同刺激性试剂、第二调节T细胞刺激性试剂、或T细胞存活剂或者生长剂。
105.如实施方式102所述的方法，其中，刺激性组合物包含α-⑶3抗体、α-⑶28抗体、IL-2或IL-15、以及TGF0或者雷帕霉素。
106.如实施方式91-105所述的方法，其中，样品是PBMC样品。
107.如实施方式91-106所述的方法，其中，样品是血液样品、淋巴组织样品、胸腺样品、胰腺样品、眼睛样品、心脏样品、肝脏样品、神经样品、肠样品、皮肤样品、肌肉样品、软骨样品、或韧带样品。
实施例
[0217]提供下述非限制性实施例，仅用于说明目的，以便有利于更全面地理解下述有代表性的优选的实施方式。这些实施例不得被理解为限制本申请说明书中所述的任何一种实施方式，包括与识别、获得、扩展调节T细胞相配的方法，包含对进行的在此公开的任何一种方法有用的组分和包含调节T细胞的组合物的试剂盒。
实施例1
具有较低CD6表达的CD4+F0XP3 +和CD25+F0XP3+细胞种群
[0218]为了显示 CD6 表达在 CD4+F0XP3 'CD25+F0XP3+ 和 CD4+CD25+FoxP3+ 调节 T 细胞中的分布，进行多色流式细胞分析以便测定在这些细胞子集中的⑶6表达模式。
[0219]收获的周围血液单核细胞(PBMCc)被染色，用于⑶4、⑶25、⑶6的细胞表面表达，并且用于FoxP3的胞内染色。简而言之，通过Ficoll梯度离心(水溶性聚蔗糖梯度离心)，来自健康对照的PBMCs被从肝素化血液分离出来。大约1-2χ106个收获的PBMC/100 μ L的lxPBS-2%人类AB血清(HABS)-1%多聚甲醛(PFA)在4°C下与下述细胞表面染色单克隆抗体混合物(或称单克隆抗体鸡尾酒)一起孵育20-30分钟:0 α -⑶6-FITC、α -⑶4 一 PC7、以及a-CD25-APC。孵育后的细胞用Ix PBS_2% HABS-1 % PFA洗涤两次，用Perm/Fix缓冲液(eBioscience)固定并透化,用Perm/Wash缓冲液(ebiocience)洗漆两次,然后在4°C下与人IgG —起孵育5分钟。将包含a-FoxP3_Pacific蓝克隆206D(BioLegend)单克隆抗体的胞内染色混合物加至这些细胞中，在室温下黑暗中孵育60分钟，用Perm/Wash缓冲液洗涤，接着用Ix PBS-2% HABS洗涤，并且再悬浮于500 μ LlxPBS-2% HABS-1 % PFA中。
[0220]对于多色流式细胞分析,使用配备有405nm、488nm、以及633nm激光的流式细胞仪(GALL10S?流式细胞仪)分析了超过500，000个细胞，并且以正向光散射和侧向光散射为基础门控淋巴细胞。自发荧光对照物、同型对照物和FMO对照物被用于确立阴性荧光事件和阳性荧光事件的直方图位置，并且每个单克隆抗体的结果被表示为细胞超过阴性区域的百分比和/或分散的种群的荧光强度平均值(MFI)。通过使用单试管用针对人类淋巴细胞标志物的抗体染色，进行补偿对照物，所述标记物偶联有在染色方案中使用的荧光染料。通过用荧光减去对照物、同型对照和/或已知阴性细胞种群的荧光，确定用于FoxP3染色的阴性对照物。结果代表两个样品的评估。使用Summit5.0或者Kaluzal.1来进行被收集数据的分析。使用ModFit软件来分析增殖测定中的前体频率。对于统计分析，使用MicrosoftOffice Excel2003 和 GraphPad Prism5.0l0
[0221]结果表明，⑶4FoxP3淋巴细胞种群显示出，与包含⑶4+F0XP3_表达模式的细胞相t匕，包含⑶4+F0XP3+表达模式的细胞中表面⑶6生物标志物表达要低大约两倍(MFI6.3对
11.6)(图1A)。类似地，⑶25FoxP3淋巴细胞种群分析显示出，与包含⑶4+⑶25T0xP3-表达模式(MFI6.2对12.5)或者⑶4+⑶25Τ0ΧΡ3_表达模式(MFI6.2对11.4)的细胞相比，包含⑶4+CD25+FOXP3+表达模式的细胞中⑶6生物标志物表达要低两倍(图1Β)。
[0222]人类自然产生的T调节细胞(nTMg)已经被限定为⑶4+F0XP3+、⑶4+CD25+或⑶4+CD25+FoxP3 +细胞，这些与接触依赖性的体外抑制有关。该结果表明，⑶4+CD25 + FoxP3+和/或⑶4+CD25sF0XP3+nI；eg细胞显示出较低的⑶6生物标志物表达。⑶6阴性T细胞已经显示缺乏设置同种异体反应性响应的能力，并且被认为是无反应性的细胞。在nTMg细胞上CD6表达的缺乏建议了一个为何这些调节细胞也是无反应性的细胞的机制。
实施例2
CD4+CD25+CD6 细胞种群表达 FoxP3
[0223]为了评估在⑶4/⑶25/⑶6亚群上FoxP3标志物的表达，进行多色流式细胞分析以便测定在这些调节T细胞子集中的FoxP3表达模式。[0224]对于细胞表面生物标志物表达和细胞内生物标志物，按照在实施例1中描述的方法分离、收获并且染色人类PBMC。为了进行多色流式细胞分析，使用流式细胞仪(GALL10S?流式细胞仪)分析了超过500，000个细胞，并且以正向光散射和侧向光散射为基础门控淋巴细胞。在⑶6/⑶25表达点阵图中分析了⑶4+淋巴细胞。在三个⑶4+细胞子集⑶25 +⑶⑶25-⑶和⑶25TD6+中分析了 F0XP3表达。通过用荧光减去对照物、同型对照和/或已知阴性细胞种群的荧光，确定用于FoxP3染色的阴性对照物。按照在实施例1中描述的方法，分析样品规模和数据。
[0225]结果显示，94.2%的包含⑶4+⑶25+CD6ffi/_表达模式的淋巴细胞也表达FoxP3(图2B)。然而，仅仅9.5%的包含⑶4+CD25TD6ffi/_表达模式的淋巴细胞表达FoxP3，并且仅仅
1.8%的包含^4+0025-^6+表达模式的淋巴细胞表达？(《?3(图2B)。这些结果表明，可以确证F0XP3+细胞对于⑶25生物标志物表达是异源的，而且显示出具有⑶6ffi/_表达模式的调节T细胞似乎可识别大多数F0XP3+nTMg细胞。
实施例3
CD25+CD6ffi/-细胞种群表达FoxP3
[0226]为了评估在淋巴细胞⑶25+CD6ffi/_亚群上FoxP3标记物的表达，进行多色流式细胞分析以便测定在这些调节T细胞子集中的FoxP3表达模式。
[0227]对于细胞表面生物标志物表达和细胞内生物标志物，按照在实施例1中描述的方法分离、收获并且 染色人类PBMC。为了进行多色流式细胞分析，使用流式细胞仪(GALL10STM流式细胞仪)分析了超过500，000个细胞，并且在⑶6/⑶25表达点阵图中分析了淋巴细胞。在三个细胞子集⑶25+⑶⑶25-⑶6 ffiA和⑶25TD6+中分析了 F0XP3表达。通过用荧光减去对照物、同型对照和/或已知阴性细胞种群的荧光，确定用于FoxP3染色的阴性对照物。按照在实施例1中描述的方法，分析样品规模和数据。
[0228]结果显示，89.2%的包含CD25+CD6ffi/_表达模式的淋巴细胞也表达FoxP3(图3)。然而，仅仅9.0%的包含⑶25-GD6ffi/_表达模式的淋巴细胞表达FoxP3，并且仅仅1.8%的包含⑶25-⑶6+表达模式的淋巴细胞表达FoxP3(图3)。该分析表明，包含⑶25+CD6ffi/_表达模式的淋巴细胞包括两个种群子集，一个主要的种群具有高水平的FoxP3表达(89.2% )，而次要的种群显示出低水平的或者不存在的FoxP3表达(10.7%)(图3)。另外，这些实验表明，包含⑶25 ? /TD6+表达模式的细胞不表达FoxP3，反之具有⑶25 ? 7XD6 ?卜表达模式的细胞含有次要的也表达FoxP3的细胞子集(9.0% )(图3)。这些结果表明，F0XP3+细胞对于⑶25生物标志物表达是异源的，而且显示出具有⑶6ffi/_表达模式的调节T细胞似乎可识别大多数F0XP3+nTMg细胞。
实施例4
CD6ffi/-细胞种群表达FoxP3
[0229]为了评估在F0XP3+细胞上⑶6耗减(depletion)的效果，进行多色流式细胞分析以便测定在⑶6+和⑶6ffi/_细胞子集中的FoxP3表达模式。
[0230]对于细胞表面生物标志物表达和细胞内生物标志物，按照在实施例1中描述的方法分离、收获并且染色人类PBMC。 为了进行多色流式细胞分析，使用流式细胞仪(GALL10STM流式细胞仪)分析了超过500，000个细胞，并且在⑶6/⑶4表达点阵图中分析了淋巴细胞。在两个细胞子集PBMC CD6ffi/_和PBMC CD6+中分析了 F0XP3表达。通过用荧光减去对照物、同型对照和/或已知阴性细胞种群的荧光，确定用于FoxP3染色的阴性对照物。按照在实施例1中描述的方法，分析样品规模和数据。
[0231]该分析也表明，包含PBMC⑶6ffi/_表达模式的淋巴细胞显示出比包含PBMC⑶6+表达模式的淋巴细胞(8.3% )更高水平的FoxP3表达(41.5% )(图4A)。这些结果表明，在PBMC中CD6耗减可以产生显著的F0XP3+nTMg细胞富集。
实施例5
⑶4 +⑶25+⑶6低7XDl27低细胞种群显示出较高的F0XP3+表达富集
[0232]为了识别更多的FoxP3同源CD4+CD25+细胞种群，进行多色流式细胞分析以便测定在这些调节T细胞子集中的⑶6和⑶127表达模式。
[0233]对于细胞表面生物标志物表达和细胞内生物标志物，按照在实施例1中描述的方法分离、收获并且染色人类的PBMC，与实施例1不同之处在于PBMC是从四个健康个体得到的、并且将a-CD127-PE单克隆抗体加至细胞表面染色混合物中。为了进行多色流式细胞分析，使用流式细胞仪(GALL10S?流式细胞仪)分析了超过500，000个细胞，并且以正向光散射和侧向光散射为基础门控淋巴细胞。在⑶4/⑶25表达、⑶127/⑶25表达、以及⑶6/⑶25表达点阵图中分析了⑶4+淋巴细胞。在⑶127/⑶6表达点阵图中分析了⑶4+⑶25+淋巴细胞。在下述 CD4+ 细胞子集 CD25+、CD25+CD127ffi/TD25+CD6ffi/'CD25+CD6ffi/XD127ffi/_ 和⑶25+CD6+⑶127+中分析了 F0XP3表达。通过用荧光减去对照物、同型对照和/或已知阴性细胞种群的荧光，确定用于FoxP3染色的阴性对照物。按照在实施例1中描述的方法，分析样品规模和数据。丨
[0234]结果表明，在CD4+CD25 高细胞(85.1 % F0XP3.)、CD4+CD6 低卜(87.9 % F0XP3.)和⑶4+CD127ffi/_细胞(88.0 % F0XP3+)之间的FoxP3表达中没有发现显著的差异(图5A)。令人惊讶的是，当分析⑶4+⑶25*细胞的⑶6和⑶127表达时，该分析显示94.9 %的包含⑶4+⑶25+CD127 ? 7XD6 表达模式的细胞表达FoxP3 (图5B)，表达水平可与CD4+CD25+CD127低A细胞的92.8%表达FoxP3相比。反之，CD4+CD25高CD6+CD127+细胞子集显示出低的FoxP3表达(22.6% )(图5B)。总之，在F0XP3+细胞中从CD4+CD25? < CD4+CD6低/_ = CD4+CD127低a < CD4+CD25高CD6低/-CD127低中群有累进的富集(图5C)。因此，CD6和⑶127表面标志物的组合可识别具有最高的F0XP3+细胞富集的⑶4+⑶25 s种群，并且这些结果表明同源的F0XP3+细胞种群可能基于ra4+ra25+CD127ffi/TD6ffi/_表达模式被识别。
实施例6
⑶4+⑶25高/+⑶细胞种群抑制T细胞活化
[0235]为了显示包含⑶4+⑶25S/+⑶6ffi/_表达模式的淋巴细胞的抑制作用，使用基于琥珀酰亚胺羧基荧光素双乙酸酯(CFSE)的增殖测定法，用被分类的细胞进行抑制测定，以便评估被加入的CD4+CD25s/+CD6ffi/_细胞抑制异源CD8+效应物(responder) T细胞增殖的能力。
[0236]通过Ficoll梯度离心，从肝素化血液中分离出来自健康对照的人类PBMC。大约20-30xl06个收获的PBMC/500 μ tL的完全细胞培养基与下述细胞表面染色单克隆抗体混合物一起在4°C下孵育30分钟:α -⑶6-APC、α -⑶4 一 PC7、以及α -⑶25-ΡΕ。孵育后的细胞用Ix PBS洗涤两次，并且再悬浮于完全培养基中，至密度为约IOxIO6个细胞/mL。
[0237]为了使用流式细胞技术进行细胞分类，使用以依续的门控限定为基础的细胞分类器(MOFLO ? XDP细胞分类器)在完全培养基中将大约60，000个至100，000个细胞进行分类。以正向光散射和侧向光散射为基础门控淋巴细胞，并且通过SSC-H/SSC-W和FSC-H/FSC-W点阵图排除双重线(doublets)。在⑶25/⑶6表达点阵图中分析了⑶4+淋巴细胞。筛选两个⑶4+子集⑶25+⑶6低[(FOXPS+Treg细胞)和⑶25XD6+(F0XP3-非Treg细胞)用于高速细胞分类。
[0238]结果显示，该分类方案导致⑶4+CD25+CD6ffiA细胞种群的分离纯度(sortingscheme)为 96% (图 6A)。
[0239]为了进行I；eg抑制测定，将500 μ L的0.6 μ M CFSE加至500 μ L细胞悬液中，所述细胞悬液包含1-20百万个指定为T-效应物(Tmsp)细胞、从单个健康个体分离的PBMC。该细胞悬液混合物在20°C下保温大约大约5分钟，加入大约ImL的冷的HABS，并且该混合物被保温大约I分钟。在保温后，加入大约IOmL的Ix PBS，并且该混合物在大约20°C下1500rpm离心大约5分钟。细胞被再悬浮在完全细胞培养基(RMPI1640、Glutamax-1、25mM!fepes、2.5%人类AB血清、丙酮酸钠、100U/mL青霉素、100 μ g/mL链霉素、加非必需氨基酸和2-巯基乙醇)中至密度为大约IxlO6个细胞/mL。
[0240]抑制测定是以TMg细胞数量的滴定为基础的。以下述被分类的⑶4+⑶25+CD6ffi/-TMg细胞对于Tresp细胞的比率:1:1、1:2、1:4、以及1:8，将大约30，000至50，000个总的细胞铺入96孔板中。被铺入的细胞在37°C下于5% CO2环境和95%湿度中被保温4天。细胞然后用0.5 μ g/mL可溶性α -⑶3和α -⑶28单克隆抗体进行刺激，并且在37°C下于5% CO2环境和95%湿度中孵育4天。为了进行收获，细胞在大约20°C下被750rpm离心3分钟，吸出培养基，并且将150 μ L新鲜培养基加至每个孔。将大约4 μ L的O α -⑶8-APC单克隆抗体加至每个孔中(除了 “PBMC未染色的”对照物之外)，并且在4°C下避光孵育30分钟。将大约200 μ Llx PBS、10% HABS加至每个孔中，并且96孔板在大约20°C下被750rpm离心3分钟，吸出培养基 ，并且将大约200 μ Llx PBS、10% HABS加至每个孔中。将大约5 μ L的7AAD加至每个孔中，以便识别活细胞。为了使用流式细胞技术分析Ireg细胞抑制，以正向光散射和侧向光散射为基础门控细胞，然后包含7AAD+表达模式的细胞被排除，并且通过CFSE染色来分析包含⑶8+表达模式的细胞，以便评估细胞增殖。被分类的包含⑶4+CD25TD6+表达模式的非Ireg细胞种群在所有的实验中用作阴性对照。未受刺激的应答细胞(respondercells)的CFSE直方图限定了总群(parent population),并且通过使用ModFit LT软件(Verity Software House, v3.0 ； Top sham ME)计算前体频率(pf)来测定被活化的应答细胞的增殖。评估三个样品的有代表性的结果，并且对于每个TMg =Tresp比率样品，表示为pf的％抑制。
[0241]结果表明，包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式的细胞对于用α -⑶3和α -⑶28单克隆抗体刺激的⑶8+Τ细胞具有剂量-反应抑制作用(图6Β)。在1:1的Treg =Tresp比率下观察到最大抑制(57% )。该抑制活性类似于用作测定中阳性对照的被分类的CD4+CD25SCD127ffiA细胞的抑制活性(图6B)。用作阴性对照的被分类的⑶4+CD25-⑶6+或⑶4+⑶25TD127+非TMg细胞未显示出抑制活性(数据未显示)。这些结果表明，⑶4+⑶25+CD6ffi/_细胞种群含有抑制调节性。总之，FoxP3的高表达、与Treg相关的抗原(CD4和⑶25)的特征分布、以及在体外功能性测定法建立中的抑制活性得出如下结论:自然的调节T抑制性细胞显示出低的/阴性的细胞表面⑶6表达，并且⑶4+⑶25+CD6ffi/_表达模式识别出调节T细胞抑制性细胞。
实施例7
与Ireg相关的标志物在⑶25+CD6ffi/_细胞种群上的表征
[0242]为了确定⑶6ffi/_表达模式是否限定同源的或异源的细胞种群，使用多种生物标志物进行多色流式细胞分析，以便确定是否在CD25+CD6ffi调节T细胞中观察到不同的生物标志物表达模式。
[0243]对于细胞表面生物标志物表达和细胞内生物标志物，按照在实施例1中描述的方法，分离、收获并且染色人类PBMC，与实施例1不同之处在于将α -⑶45RA-E⑶单克隆抗体、以及a -HLA-Dr-APCA750单克隆抗体加至细胞表面染色混合物中，并且将a -CTLA-4-PC5单克隆抗体加至胞内染色混合物中。为了进行多色流式细胞分析，使用流式细胞仪(GALL10S?流式细胞仪)分析了超过500，000个细胞，并且以正向光散射和侧向光散射淋巴细胞为基础门控淋巴细胞，在CD6/FoxP3表达点阵图中分析了淋巴细胞。通过用荧光减去对照物和己知阴性细胞种群的荧光，确定用于FoxP3染色的阴性对照物。在多色流式细胞分析第二轮中，分析了超过500，000个细胞。以正向光散射和侧向光散射为基础门控淋巴细胞，并且基于CD45RA/FoxP3表达模式用与CD45RA、HLA_Dr和CTLA_4I；eg相关的标志物进行分析。按照在实施例1中描述的方法，分析样品规模和数据。
[0244]来自CD6和FoxP3表达分析的结果表明，三个不同的调节T细胞种群可以被识别(图7)。大约22.0%的⑶6ffi/-细胞是进一步包含⑶45RA+F0XP3ffi/_表达模式的细胞；大约
37.1%的⑶细胞是进一步包含⑶45RAT0XP3+表达模式的细胞；大约29.2%的⑶6 ?
细胞是进一步包含⑶45RAT0XP3ffi/_表达模式的细胞。使用附加的生物标志物这三个⑶6 细胞种群的进一步分析如表1所示。
表1.三个CD0 细胞种群的分析
【权利要求】
1.一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括: 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，所述至少两种不同生物标志物包括⑶25生物标志物和⑶6生物标志物； 其中包含⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括:分离或者富集免疫抑制性调节T细胞种群。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法还包括:使免疫抑制性调节T细胞种群与刺激性组合物相接触，从而扩展免疫抑制性调节T细胞种群。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶4生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶127生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶25+⑶6—表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶4生物标志物和⑶127生物标志物的细胞表达水平，其中包含^4+0025+^6<￡/工0127<￡/-表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测HLA-Dr生 物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+⑶25+CD6ffi/-HLA-Drffi7表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，筛选步骤进一步包括: 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶49d生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6ffi/TD49dffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶38生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6ffi/TD38ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶45RA生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4 +⑶25 +⑶6 ? 7XD45RA?卜表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测FoxP3生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6AFoxPS+s8ffiA表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测CTLA-4生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_CTLA-4+B8ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测GITR生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_GITR+B8ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测LAG-3生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_LAG-3+B8ffi/-表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶39生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6ffi/TD39+B8ffi/-表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测Helios生物标志物的细胞表达水平，其中包含ra4+CD25+ra6ffi/_HeliOS+B8ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测FcRL3生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6AFcRI^+s8ffiA表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测CCR7生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25 +⑶6ffi/_CCR7 +s8ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测CCR4生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6AcOM+s8ffiA表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测CCR8生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25 +⑶6ACCRS+s8ffiA表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶62L生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6yTDeZL+s8ffiA表达模式的τ细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测ICOS生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_IC0S+B8ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶103生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6ffi/TD103+B8ffi/-表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含τ细胞种群的样品，以便检测ro-1生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6ApD-1+s8ffiA表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶134生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6〃表达模式的τ细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测GARP生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_GARP+B8ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶45RB生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶67TDASRB+s8ffiA表达模式的τ细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶45R0生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶67TDASRO+s8ffiA表达模式的τ细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞釉群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶95生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+CD25+⑶6ffi/TD95+B8ffi卜表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶122生物标志物的细胞表达水平，其中包含^4+0025+^6<￡/-^122+5^/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群；以及/或者 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶8生物标志物的细胞表达水平，其中包含ra4+CD25+ra6ffi/-ra8+s8ffi/-表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
9.一种治疗个体中基于免疫的紊乱的方法，该方法包括: 获得生物样品，该生物样品包含个体兼容的T细胞种群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少两种不同生物标志物的细胞表达水平，所述至少两种不同生物标志物包括⑶25`生物标志物和⑶6生物标志物； 分离包含⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群；以及 将具有CD25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群给药于所述个体体内，从而在个体中治疗免疫反应。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该方法还包括:在将具有⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群导入所述个体体内之前，扩展具有⑶25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，筛选步骤进一步包括: 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶4生物标志物的细胞表达水平，并且分离包含⑶4+CD25+⑶表达模式的T细胞亚群； 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶127生物标志物的细胞表达水平，并且分离包含CD25+CD6ffi ,0)127^-表达模式的T细胞亚群；或者 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶4生物标志物和⑶127生物标志物的细胞表达水平，并且分离包含⑶4+⑶25+⑶6低z TD127ffi/-表达模式的T细胞亚群。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，基于免疫的紊乱是:自身免疫状况，紊乱或疾病，移植物排斥，移植物抗宿主疾病，或者持久性的和累进性的对于来自细菌、病毒、真菌或者寄生生物体的感染性的非白体抗原的免疫反应。
13.一种用于识别、分离、和/或富集免疫抑制性调节T细胞群的试剂盒，该试剂盒包含至少两种不同生物标志物配体，所述至少两种不同生物标志物包括CD25生物标志物配体和⑶6生物标志物配体。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒进一步包括CD4生物标志物配体、CD 127生物标志物配体、⑶49d生物标志物配体、⑶45RA生物标志物配体、HLA_DR生物标志物配体、FoxP3生物标志物配体、CTLA-4生物标志物配体、GITR生物标志物配体、LAG-3生物标志物配体、⑶39生物标志物配体、Helios生物标志物配体、FcRL3生物标志物配体、CCR7生物标志物配体、CCR4生物标志物配体、CCR8生物标志物配体、⑶62L生物标志物配体、ICOS生物标志物配体、⑶I O 3生物标志物配体、PD-1生物标志物配体、⑶134生物标志物配体、GARP生物标志物配体、⑶45RB生物标志物配体、⑶45R0生物标志物配体、⑶95生物标志物配体、⑶122生物标志物配体、⑶8生物标志物配体、或它们的任何组合物。
15.一种包含免疫抑制性调节T细胞种群的组合物，所述免疫抑制性调节T细胞种群通过包含下述步骤的方法获得: 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测至少三种不同生物标志物的细胞表达水平，其中，所述至少三种不同生物标志物包括⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、以及⑶6生物标志物；以及 分离包含⑶4+CD25+⑶6ffi/_表达模式的T细胞亚群，从而获得免疫抑制性调节T细胞种群。
16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述筛选步骤进一步包括:筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶127生物标志物的细胞表达水平，其中包含⑶4+⑶25+CD6ffi/ _CD127ffi/_表达模式的T细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节T细胞种群。
17.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述方法还包括:在将具有⑶4+CD25+⑶6ffi /_表达模式的T细胞亚群导入个体体内之前，扩展具有⑶4+⑶25+CD6ffi/_表达模式的T细胞亚群。
18.一种识别两种以上不同的免疫抑制性调节T细胞种群的方法，该方法包括下述步骤: 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、⑶6生物标志物、以及一个附加的生物标志物的细胞表达水平，所述一个附加的生物标志物是FoxP3生物标志物、CTLA-4生物标志物、⑶45RA生物标志物、或HLA-Dr生物标志物； 其中两种不同免疫抑制性调节T细胞种群的检测是基于:i)包含CD4+CD25+CD6 ?AFOXP3+表达模式和CD4+CD25+CD6低AFOXP3低表达模式的T细胞；ii)包含CD4+CD25+CD6低^CTLA-4+表达模式和CD4+CD25+CD6ffi/XTLA-4ffiA表达模式的T细胞；iii)包含CD4+CD25+CD6? 7XD45RA+表达模式和⑶4+⑶25+⑶6 ? yTDdSRA低〃表达模式的T细胞；或者iv)包含CD4+CD25+CD6ffi/TlLA-Dr+ 表达模式和 CD4+CD25+CD6? ^HLA-Drffi 卜表达模式的 T 细胞。
19.一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集的方法，该方法包括下述步骤: 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、⑶6生物标志物、以及一个附加的生物标志物的细胞表达水平，所述一个附加的生物标志物是FoxP3生物标志物、⑶45RA生物标志物、CCR4生物标志物、⑶39生物标志物、或HLA-Dr生物标志物； 其中免疫抑制性调节T细胞的四个不同的成熟子集的检测是基于包含下述方式的表达模式:i)与CCR4ffi表达模式、⑶39<￡表达模式、或者HLA-Drffi表达模式相结合的CD4+CD25+CD6? 〃0)45狀+表达模式；i i)与CCR4-表达模式、CD3T表达模式、或者HLA-Df表达模式相结合的⑶4+⑶25+⑶6ffi/XD45RA+表达模式；iii)与CCR4*/+表达模式、⑶45RA_表达模式、⑶39高表达模式、或者HLA-Dr ffi/_表达模式相结合的⑶4+⑶25高/+⑶6ffi/_表达模式；以及iv)与CR4S/-表达模式、CD45RA—表达模式、CD39ffi/_表达模式、或者HLA-Drffi/-表达模式相结合的⑶4+⑶25+⑶6+表达模式。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于， 所述免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集之一是自然的或者休眠的免疫抑制性调节T细胞种群子集，所述自然的或者休眠的免疫抑制性调节T细胞种群子集包含 CD4+CD25+CD6 低 ACD45RA+CCR4-表达模式、CD4+CD25+CD6ffi/XD45RA+CD39-表达模式、或CD4+CD25+CD6ffi/ XD45RA+HLA_Dr-表达模式； 所述免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集之一是未成熟的或者记忆性的免疫抑制性调节T细胞种群子集，所述未成熟的或者记忆性的免疫抑制性调节T细胞种群子集包含 CD4+CD25+CD6 ? 7XD45RA+CCR4表达模式、CD4+CD25+CD6 ? ACD45RA+CD39 表达模式、或 CD4+CD25+CD6 ? 7XD45RA+HLA-Dr 低表达模式； 所述免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集之一是成熟的或者效应物免疫抑制性调节T细胞种群子集，所述成熟的或者效应物免疫抑制性调节T细胞种群子集包含 CD4+CD25 * /+CD6 ? 7XCR4 高卜表达模式、CD4+CD25 * /+CD6 ? 7XD45RA_ 表达模式、CD4+CD25 高/+CD6 ? /-CD39 */+ 表达模式、CD4+CD25 * /+CD6 ? 7XCR4 * /+CD45RA_ 表达模式、CD4+CD25 * 4CD6低ICCR4高/+CD39高4表达模式、或者CD4+CD25高/+CD6低/-CCR4高/+HLA-DR低表达模式；以及/或者 所述免疫抑制性调节T细胞 种群的四个不同的成熟子集之一是末端分化的免疫抑制性调节T细胞种群子集，所述末端分化的免疫抑制性调节T细胞种群子集包含CD4+CD25?/+CD6 * /+CCR4 */+ 表达模式、CD4+CD25 * /+CD6 * /+CD45RA_ 表达模式、CD4+CD25 * /+CD6 * /+CD39低表达模式、CD4+CD25 * /+CD6 * /+HLA-Dr 低表达模式、CD4+CD25 * /+CD6 * /+CCR4 * /+CD45RA_ 表达模式、CD4+CD25 * /+CD6 * /+CCR4 * /+CD39 低表达模式、或者 CD4 + CD25 高 /+CD6 * /+CCR4 * /+HLA_DR表达模式。
21.如权利要求18所述的方法,其特征在于,该方法还包括:分离或者富集所述免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集中的一个或多个。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，该方法还包括:使所述免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集中的一个或多个与刺激性组合物相接触，从而扩展免疫抑制性调节T细胞种群。
23.一种识别免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集的方法，该方法包括下述步骤: 筛选包含T细胞种群的样品，以便检测⑶4生物标志物、⑶25生物标志物、⑶127生物标志物、以及一个附加的生物标志物的细胞表达水平，所述一个附加的生物标志物是FoxP3生物标志物、⑶45RA生物标志物、CCR4生物标志物、⑶39生物标志物、或HLA-Dr生物标志物； 其中所述免疫抑制性调节T细胞的四个不同的成熟子集的检测是基于包含下述方式的表达模式:i)与CCR4ffi表达模式、⑶39<￡表达模式、或者达模式相结合的⑶4+CD25+⑶127ffi/-⑶45RA+表达模式；ii)与CCR4-表达模式、⑶39-表达模式、或者HLA-Dr-表达模式相结合的⑶4+CD25+⑶127ffi/TD45RA+表达模式；iii)与CCR4?表达模式、CD45RA-表达模式、CD39 高/+表达模式、或者HLA-Dr 低/-表达模式相结合的CD4+CD25 高/+CD127低/-表达模式；以及iv)与CR4高/+表达模式、CD45RA—表达模式、CD39ffi/_表达模式、或者HLA-Drffi —表达模式相结合的CD4+CD25+CD127+表达模式。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于， 所述免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集之一是自然的或者休眠的免疫抑制性调节T细胞种群子集，所述自然的或者休眠的免疫抑制性调节T细胞种群子集包含 CD4+CD25+CD127 低^OMSRA+CCRf 表达模式、CD4+CD25+CD127低 ACD45RA+CD39-表达模式、或 CD4+CD25+CD127ffi/XD45RA+HLA-Df 表达模式； 所述免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集之一是未成熟的或者记忆性的免疫抑制性调节T细胞种群子集，所述未成熟的或者记忆性的免疫抑制性调节T细胞种群子集包含 CD4+CD25+CD127 yXDASRA+CCIMffi表达模式、CD4+CD25+CD127 <￡〃0)45狀+0)39<￡表达模式、或 0)4+0)25+00127<￡/1045狀+!11^-01^表达模式； 所述免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集之一是成熟的或者效应物免疫抑制性调节工细胞种群子集，所述成熟的或者效应物免疫抑制性调节T细胞种群子集包含 CD4+CD25 高4CD127? 7XCR4高/+ 表达模式、CD4+CD25 高/+CD127 ? 7XD45RA-表达模式、CD4+CD25高/+CD127ffi/-CD39高/+表达模式、CD4+CD25高/+CD127ffi/XCR4高/+CD45RA-表达模式、或者 CD4+CD25 高/+CD127 低/-(:0?4高/+0)39 高—表达模式、或者 CD4+CD25 高/+CD127 低/-CCR4 高/+HLA-DR<5)表达模式；以及/或者 所述免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集之一是末端分化的免疫抑制性调节T细胞种群子集，所述末端分化的免疫抑制性调节T细胞种群子集包含CD4+CD25?4CD127 高/+CCR4 高表达模式、CD4+CD25 高/+CD127 高/+CD45RA_ 表达模式、CD4+CD25 高/+CD127高/+CD39低表达模式、CD4+CD25高/+CD127高/+HLA-Dr低表达模式、CD4+CD25高/+CD127?/+CCR4高/+CD45RA-表达模式、CD4+CD25 高/+CD127 高/+CCR 高/+CD39 低表达模式、或者 CD4+CD25 高/+CD127 高/+CCR4 高 /+HLA-DR 低表达模式。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，该方法还包括:分离或者富集所述免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集中的一个或多个。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，该方法还包括:使所述免疫抑制性调节T细胞种群的四个不同的成熟子集中的一个或多个与刺激性组合物相接触，从而扩展免疫抑制性调节T细胞种群。
27.一种在个体中富集免疫抑制性调节T细胞的方法，该方法包括:将a-CD6抗体给药于所述个体，其中给药提供的是不宜操作的包含CD6SA表达模式的T细胞，而不是包含CD6ffi/_表达模式的T细胞，从而在个体中富集免疫抑制性调节T细胞种群。
【文档编号】G01N33/569GK103782173SQ201280042351
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年6月29日 优先权日:2011年7月1日
【发明者】卡洛斯·A·加西亚桑塔纳 申请人:贝克曼考尔特公司