利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序的利记博彩app

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【专利摘要】本发明提供了在使用共焦显微镜或多光子显微镜检测样本溶液中的发光粒子的光的扫描分子计数法中能够以尽可能地降低将同一发光粒子检测为不同的粒子的可能性且尽可能地使光检测区域的尺寸、形状不变的方式使光检测区域沿着更广的区域或更长距离的路径移动来进行样本溶液内的扫描的光分析技术。在本发明的光分析技术中，在使光检测区域的位置在样本溶液内沿着第二路径移动的期间进行来自光检测区域的光的检测和按时间序列的光强度数据的生成，使用按时间序列的光强度数据逐个检测表示来自存在于规定路径内的各发光粒子的光的信号，其中，该第二路径的位置沿着第一路径移动。
【专利说明】利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种光分析技术，能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测来自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”。)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子的光，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统逐个检测来自单个发光粒子的光并进行各种光分析的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序。此外，在本说明书中，发光的粒子(以下称为“发光粒子”。)可以是其自身发光的粒子、或附加了任意的发光标识或发光探针的粒子，从发光粒子发出的光可以是荧光、磷光、化学发光、生物发光、散射光等。
【背景技术】
[0002]由于近年来的光测量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或荧光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光的测量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的装置或方法。例如，在荧光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如参照专利文献 1-3、非专利文献 1-3)中，利用激光共焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测量来自出入样本溶液中的微小区域(被称为显微镜的激光会聚到的焦点区域-共焦区组织)内的荧光分子或被荧光标识的分子(荧光分子等)的荧光强度，根据由测量得到的该荧光强度的自相关函数的值所确定的在微小区域内的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)和滞留分子的个数的平均值，获取荧光分子等的运动的速度或大小、浓度之类的信息，或检测分子的构造或大小的变化、分子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象。另外，在荧光强度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如专利文献 4、非专利文献4)、光子计数直方图(Photon Counting Histogram:PCH。例如专利文献5)中，生成与FCS同样地测量出的出入共焦区组织内的荧光分子等的荧光强度的直方图，使统计性的模型公式拟合该直方图的分布，由此估算荧光分子等的固有的亮度的平均值和滞留在共焦区组织内的分子的个数的平均值，根据这些信息估计分子的构造或大小的变化、结合/离解状态、分散/聚合状态等。另外，除此以外，在专利文献6、7中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统测量出的样本溶液的荧光信号的时间经过来检测荧光性物质的方法。专利文献8提出了一种信号运算处理技术，其用于使用光子计数技术测量来自流通于流式细胞仪的荧光微粒子或固定在基板上的荧光微粒子的微弱光，来检测流体中或基板上的荧光微粒子的存在。
[0003]特别是，根据FCS、FIDA等使用了利用共焦显微镜的光学系统和光子计数技术进行微小区域的荧光测量的技术的方法，进行测量所需要的样本与以前相比可以是极低浓度且极微量(在一次测量中使用的量至多为几十yL左右)，测量时间也大幅缩短(在一次测量中反复多次进行秒级时间的测量。)。因而，期待这些技术特别是在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查的强力工具。
[0004]专利文献1:日本特开2005-098876
[0005]专利文献2:日本特开2008-292371
[0006]专利文献3:日本特开2009-281831
[0007]专利文献4:日本专利第4023523号
[0008]专利文献5:国际公开2008-080417
[0009]专利文献6:日本特开2007-20565
[0010]专利文献7:日本特开2008-116440
[0011]专利文献8:日本特开平4-337446号公报
[0012]非专利文献1:金城政孝，蛋白质核酸酶Vol.44，N0.9，1431-1438页1999年
[0013]非专利文献2:F.J.Meyer-Alms,突光相关谱(Fluorescence CorrelationSpectroscopy), R.Rigler 编,Springer,柏林,2000 年,204-224 页
[0014]非专利文献3:加藤则子及其他4名，遗传医学，Vol.6，N0.2，271-277页
[0015]非专利文献4:卡斯柯(Kask)及其他3名，美国科学学院纪要，1999年，96卷，13756-13761 页(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))

【发明内容】

[0016]发明要解决的问题
[0017]在上述的FCS、FIDA等使用了共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的光学分析技术中，所测量的光是从荧光单分子或多分子发出的光，但在该光的解析中，执行按时间序列测量出的荧光强度数据的自相关函数的运算或对直方图的拟合之类的荧光强度的波动的计算等统计性的处理，并非逐个参照或分析来自各个荧光分子等的光的信号。即，在这些光分析技术中，对来自多个荧光分子等的光的信号统计性地进行处理，针对荧光分子等检测统计平均的特性。因而，为了在这些光分析技术中得到统计上有意义的结果，需要样本溶液中的作为观测对象的荧光分子等的浓度或数密度在平衡状态下为在一次秒级长度的测量时间内能够进行统计性处理的个数的荧光分子等出入微小区域内的水平，优选的是在微小区域内始终存在一个左右的荧光分子等的水平。实际上，共焦区组织的体积为IfL左右，因此，在上述的光分析技术中使用的样本溶液中的荧光分子等的浓度典型地是InM左右或其以上，在大幅低于InM时，产生在共焦区组织内不存在荧光分子等的时间而无法得到统计上有意义的分析结果。另一方面，在专利文献6?8所记载的荧光分子等的检测方法中，不包括荧光强度的波动的统计性运算处理，即使样本溶液中的荧光分子等小于InM也能够检测荧光分子等，但无法定量地计算在溶液中随机运动的荧光分子等的浓度或数密度。
[0018]因此，本申请的 申请人:在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于新原理的光分析技术，能够定量地观测作为观测对象的发光粒子的浓度或数密度低于利用FCS、FIDA等包含统计性处理的光分析技术进行处理的水平的样本溶液中的发光粒子的状态或特性。在所述新的光分析技术中，如果清楚地进行描述，则与FCS、FIDA等同样地，在使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的情况下，一边使作为光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”。)的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域包含在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子时检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的各发光粒子逐个地检测，来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。根据该新的光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”。)，与FCS、FIDA等光分析技术同样地，进行测量所需要的样本可以是微量的(例如几十UL左右)，另外，测量时间短，并且与FCS、FIDA等光分析技术的情况相比，能够检测更低浓度或数密度的发光粒子的存在，并定量地检测其浓度、数密度或其它特性。
[0019]在上述扫描分子计数法中，在以发光粒子的计数、发光粒子的浓度或数密度的检测为主要目的的情况下，如果能够检测溶液中的尽可能多的发光粒子，则能够得到更高精度的结果。特别地，在发光粒子浓度低的溶液的情况下，为了检测尽可能多的发光粒子，优选使光检测区域能够沿着更广的区域或更长距离的路径移动。此时，为了得到更可靠的检测结果(发光粒子的检测数或数密度)，应该注意在光检测区域移动过程中避免将同一发光粒子检测为不同的粒子并且避免光检测区域的尺寸、形状发生变化。[如果将同一发光粒子检测为不同的粒子、或者光检测区域的尺寸、形状发生变化，则发光粒子的检测数或数密度的精度变差。]
[0020]这样，本发明的主要课题在于提供如下一种新的方法:在上述的扫描分子计数法中，以尽可能地降低将同一发光粒子检测为不同的粒子的可能性且尽可能不使光检测区域的尺寸、形状发生变化的方式使光检测区域移动，从而能够沿着更广的区域或更长距离的路径扫描样本溶液内。
[0021]用于解决问题的方案
[0022]根据本发明的一个方式，通过光分析装置达成上述课题，该光分析装置使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析装置的特征在于，包括:光检测区域移动部，其使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内的平面内移动；光检测部，其检测来自光检测区域的光；以及信号处理部，其生成一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边由光检测部检测出的来自光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在按时间序列的光强度数据中逐个检测表示来自各个发光粒子的光的信号，其中，光检测区域移动部使光检测区域的位置沿着第二路径移动，该第二路径的位置沿着第一路径移动。
[0023]在所述结构中，“在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子”是指在样本溶液中分散或溶解的原子、分子或它们的聚合体等发出光的粒子，如果是不固定在基板等上而自由地在溶液中进行布朗运动的粒子，则可以是任意的粒子。所述发光粒子典型地是荧光性粒子，但也可以是通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等而发出光的粒子。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指这些显微镜中检测光的微小区域，在从物镜提供照明光的情况下，相当于该照明光会聚到的区域(在共焦显微镜中，特别地根据物镜和针孔之间的位置关系来确定。在发光粒子没有照明光而发光的情况下，例如是通过化学发光或生物发光来发光的粒子的情况下，在显微镜中不需要照明光。)。此外，在本说明书中，在称为发光粒子的“信号”的情况下，只要没有特别说明，是指表示来自发光粒子的光的信号。
[0024]如从上述理解的那样，在作为本发明的基本结构的扫描分子计数法中，首先，一边在使光检测区域的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边依次进行光的检测。这样，可以期待在样本溶液内移动的光检测区域包含了随机运动的发光粒子时检测到来自发光粒子的光，由此检测一个发光粒子的存在。因而，在依次检测出的光中逐个检测来自发光粒子的光的信号，由此一个一个地逐个且依次检测粒子的存在，能够获取与粒子在溶液内的状态有关的各种信息。此时，典型地，存在如下情况:在光检测区域的位置以沿某个封闭的路径绕圈的方式移动的情况下，在发光粒子的扩散运动比较慢时，每绕一周都检测到同一发光粒子。另外，当光检测区域的位置的移动路径三维地展开时，光检测区域移动部的机构变得复杂，并且基于物镜的形式，根据光轴方向的光检测区域的位置的不同而光检测区域的形状、尺寸可能产生变化。并且，检测单分子那样的高灵敏度的共焦光学系统所使用的物镜的动作距离短，因此很难应用于接近样本溶液的方向被限定为仅仅是容器底面的微孔板(Microtiter plate)。
[0025]因此，在上述的本发明的装置中，使光检测区域的位置在样本溶液内的平面内沿着第二路径移动，该第二路径的位置沿着第一路径移动。根据所述结构，通过使光检测区域的位置沿着进行移动的第二路径的位置移动，至少在沿着第一路径的第二路径的位置移动完成之前，样本溶液内的光检测区域的位置的移动路径(除了路径瞬间交叉的情况以外)不通过同一区域，从而大幅降低将同一发光粒子检测两次以上的可能性。另外，通过使光检测区域的位置在样本溶液内的平面内移动，由此将光检测区域的位置的形状、尺寸的变化抑制为最小限度。
[0026]在上述结构中，为了将光检测区域的形状、尺寸的变化尽可能地抑制为最小限度，应该将光检测区域的位置限制在物镜的视场内且像差小的范围内。另一方面，观测对象物是随机运动的发光粒子，因此认为如果是经过足够被检测出一次的发光粒子扩散而移动到其它场所的时间之后，则光检测区域的位置也可以通过同一位置。因此，作为光检测区域的位置的轨道的第二路径和作为第二路径的位置的轨道的第一路径可以分别是循环路径。在这种情况下，为了容易地掌握以样本溶液为基准的光检测区域的位置的轨道而容易确认光检测区域的位置在短时间内不会连续通过同一区域，可以将沿着第二路径的光检测区域的位置的移动周期设定得比沿着第一路径的第二路径的位置的移动周期短。另外，在将第一和第二路径设为循环路径的情况下，为了尽可能地避免光检测区域的位置通过同一区域，优选将光检测区域的位置的移动周期τ I和第二路径的位置的移动ν2设定成光检测区域的位置的移动周期τ 1、第二路径的位置的移动速度ν2以及光检测区域的直径d满足
[0027]ν2.τ I〉 d。
[0028]由此，在光检测区域的位置绕第二路径一周的期间，第二路径至少移动相当于光检测区域的直径的距离，因此避免在光检测区域的位置的连续绕圈中光检测区域与在前次的绕圈中通过的区域重复。
[0029]上述的共焦点光学显微镜的光学系统中的光检测区域的位置在样本溶液内的移动具体地说能够通过变更显微镜的光学系统的光路或移动包含样本溶液的容器来执行。因此，在本发明中，典型地，可以是光检测区域的位置的沿着第二路径的移动通过变更显微镜的光学系统的光路来执行，第二路径的位置的沿着第一路径的移动通过移动样本溶液的位置来执行。换言之，根据该方式，通过将变更光学系统的光路而执行的光检测区域的绕圈运动和样本溶液的绕圈运动组合，能够以更广或更长的距离扫描样本溶液内。在此，变更显微镜的光学系统的光路而执行的光检测区域的位置在样本溶液内沿着第二路径的移动可以通过任意的方式进行。例如可以使用在激光扫描型光学显微镜中所采用的检电镜(Galvano-mirror)等变更显微镜的光学系统的光路来变更光检测区域的位置。根据变更显微镜的光学系统的光路来变更光检测区域的位置的方式，光检测区域的移动迅速，并且在样本溶液中实质上不发生机械振动、流体力学作用，因此作为检测对象的发光粒子不会受到力学作用的影响而能够在稳定的状态下进行光的测量，在这点上是有利的。具体地说，第二路径可以是圆形或椭圆形。另一方面，第一路径的形状可以是圆形、椭圆形或直线。此夕卜，对于样本溶液的移动，优选的是，可以如已经记述的那样通过移动显微镜的台等来移动各样本溶液的容器。在这种情况下，溶液内不发生流动，因此认为降低了对样本溶液的发光粒子的影响。
[0030]并且，在上述的装置中，可以根据发光粒子的特性、样本溶液中的数密度或浓度适当变更光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度。如本领域技术人员所理解的那样，从发光粒子检测出的光的方式可能根据发光粒子的特性或者样本溶液中的数密度或浓度而变化。特别是当光检测区域的移动速度变快时，从一个发光粒子获得的光量减少，因此优选的是适当地变更光检测区域的移动速度以能够高精度地或高灵敏度地测量来自一个发光粒子的光。
[0031]另外，进一步地，在上述的装置中，更优选的是将光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度设定得比作为检测对象的发光粒子的扩散移动速度(由布朗运动所造成的粒子的平均移动速度)高。如上述说明的那样，本发明的装置在执行扫描分子计数法的情况下，在光检测区域通过发光粒子的存在位置时对从该发光粒子发出的光进行检测来逐个检测发光粒子。然而，发光粒子在溶液中由于进行布朗运动而随机地移动，在多次出入光检测区域的情况下，导致从一个发光粒子多次检测到(表示发光粒子的存在的)信号，难以使检测出的信号与一个发光粒子的存在对应起来。因此，如上述那样，将光检测区域的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度高，由此能够使一个发光粒子对应一个(表示发光粒子的存在的)信号。此外，扩散移动速度根据发光粒子的不同而变化，因此，如上所述，优选的是本发明的装置构成为能够根据发光粒子的特性(特别是扩散常数)适当地变更光检测区域的移动速度。
[0032]在上述的本发明的装置的信号处理部的处理中，可以根据时序光强度数据中的信号的形状来进行基于逐次的来自光检测部的检测值的信号判断是否一个发光粒子进入了光检测区域的判断。在实施方式中，典型地，可以在检测到具有大于规定阈值的强度的信号时，检测为一个发光粒子进入了光检测区域。更具体地说，如后面的实施方式一栏中说明的那样，通常表示来自发光粒子的光的信号被表现为光检测部的按时间序列的检测值、即在光强度数据中具有某程度以上的强度的吊钟型的脉冲状信号，噪声不是吊钟型的脉冲状，或被表现为强度小的信号。因此，本发明的装置的信号处理部可以构成为将在时序光强度数据上具有超过规定阈值的强度的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号。“规定阈值”能够通过实验设定为适当的值。[0033]并且，本发明的装置的检测对象是来自单个发光粒子的光，因此光强度非常微弱，在一个发光粒子是荧光单分子或多分子等的情况下，发光粒子所发出的光是概率性地释放的，在微小的时间内可能产生信号的值的缺失。而且，当产生这样的缺失时，难以进行与一个发光粒子的存在对应的信号的确定。因此，信号处理部可以构成为使时序光强度数据平滑化，在对数据进行加工以能够忽略微小时间内的信号值的缺失之后，将在平滑化后的时序光强度数据中具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号。
[0034]在上述的本发明的一个实施方式中，可以对信号的个数进行计数来对包含在光检测区域中的发光粒子的个数进行计数(粒子的计数)。在这种情况下，通过将检测出的发光粒子的个数和光检测区域的位置的移动量组合，能够获得与样本溶液中的被同定的发光粒子的数密度或浓度有关的信息。具体地说，例如可以计算多个样本溶液的数密度或浓度之比或者计算相对于作为浓度或数密度的基准的标准样本溶液的相对的数密度或浓度之比，或者使用相对于作为浓度或数密度的基准的标准样本溶液的相对的数密度或浓度之比来决定绝对的数密度值或浓度值。或者，如果通过任意的方法、例如以规定的速度移动光检测区域的位置等而能够确定光检测区域的位置的移动轨迹的总体积，则能够具体估算发光粒子的数密度或浓度。
[0035]通过通用的计算机也能够实现在上述本发明的装置中一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边进行光检测来逐个检测来自各个发光粒子的信号的光分析技术的处理，在该光分析技术中，使光检测区域的位置在样本溶液内的平面内沿着第二路径移动，其中，该第二路径的位置沿着第一路径移动，由此大幅降低将同一发光粒子检测两次以上的可能性。因而，根据本发明的另一个方式，提供一种光分析用计算机程序，用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析用计算机程序的特征在于，使计算机执行以下步骤:光检测区域移动步骤，使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内的平面内沿着第二路径移动，该第二路径的位置沿着第一路径移动；时序光强度数据生成步骤，在光检测区域的位置移动的期间检测来自光检测区域的光，生成按时间序列的光强度数据；以及发光粒子信号检测步骤，使用时序光强度数据，逐个检测表示来自各个发光粒子的光的信号。此外，计算机程序通过存储在计算机可读取的存储介质中来提供。计算机读出存储在存储介质中的程序来执行信息的加工、运算处理，由此实现上述步骤。在此，计算机可读取的记录介质可以是磁盘、磁光盘、⑶-ROM、DVD-ROM、半导体存储器等。并且，上述的程序也可以通过通信线路传输到计算机，由接受该传输的计算机来执行程序。
[0036]在所述的计算机程序中也同样，优选的是，第一和第二路径是循环路径，将沿着第二路径的光检测区域的位置的移动周期设定得比沿着第一路径的第二路径的位置的移动周期短。另外，在这种情况下，优选将光检测区域的位置的移动周期τ 1、第二路径的位置的移动速度ν2以及光检测区域的直径d设定成满足
[0037]ν2.τ I〉 d。
[0038]而且，可以通过变更光学系统的光路来进行沿着第二路径的光检测区域的位置的移动，通过移动样本溶液的位置来进行沿着第一路径的样本溶液内的第二路径的位置的移动。在这种情况下，对于通过变更光学系统的光路进行的光检测区域的位置在样本溶液内的移动，例如可以使用在激光扫描型光学显微镜中采用的检电镜等变更显微镜的光学系统的光路来变更光检测区域的位置。另外，第二路径可以是圆形或椭圆形，第一路径可以是圆形、椭圆形或直线。并且，可以根据发光粒子的特性、样本溶液中的数密度或浓度适当地变更光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度，优选的是，将光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度设定得比作为检测对象的发光粒子的扩散移动速度高。
[0039]另外，在上述计算机程序中也同样，可以根据按时间序列的信号的形状来进行表示来自各个发光粒子的光的信号的逐个检测。在实施方式中，典型地，可以在检测出具有大于规定阈值的强度的信号时，检测为一个发光粒子进入了光检测区域。具体地说，可以将在光强度数据上具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号，优选的是，可以使时序光强度数据平滑化，将在平滑化后的时序光强度数据中具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号。
[0040]并且，在上述计算机程序中也同样，可以包括以下步骤:对来自逐个检测出的发光粒子的信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置的移动过程中检测出的发光粒子的个数进行计数；和/或根据检测出的发光粒子的个数来确定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
[0041]根据上述本发明的装置或计算机程序，实现一种一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边检测各个发光粒子的光的新的光分析方法，在该方法中，使光检测区域的位置在样本溶液内的平面内沿着第二路径移动，该第二路径的位置沿着第一路径移动，由此大幅降低将同一发光粒子检测两次以上的可能性。这样，根据本发明，还提供一种光分析方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析方法的特征在于，包括以下过程:光检测区域移动过程，使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内的平面内移动；时序光强度数据生成过程，在光检测区域的位置移动的期间检测来自光检测区域的光，生成按时间序列的光强度数据；以及发光粒子信号检测过程，使用按时间序列的光强度数据，逐个检测表示来自各个发光粒子的光的信号，其中，在光检测区域移动过程中，使光检测区域的位置沿着第二路径移动，该第二路径的位置沿着第一路径移动。
[0042]在所述方法中也同样，优选的是，第一和第二路径是循环路径，将沿着第二路径的光检测区域的位置的移动周期设定得比沿着第一路径的第二路径的位置的移动周期短。另夕卜，在这种情况下，优选将光检测区域的位置的移动周期τ 1、第二路径的位置的移动速度ν2以及光检测区域的直径d设定成满足
[0043]ν2.τ I〉 d。
[0044]而且，可以通过变更光学系统的光路来沿着第二路径进行光检测区域的位置的移动，通过移动样本溶液的位置来沿着第一路径进行样本溶液内的第二路径的位置的移动。在这种情况下，对于通过变更光学系统的光路进行的光检测区域的位置在样本溶液内的移动，例如可以使用在激光扫描型光学显微镜中所采用的检电镜等变更显微镜的光学系统的光路来变更光检测区域的位置。另外，第二路径可以是圆形或椭圆形，第一路径可以是圆形、椭圆形或直线。并且，可以根据发光粒子的特性、样本溶液中的数密度或浓度适当地变更光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度，优选的是将光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度设定得比作为检测对象的发光粒子的扩散移动速度高。
[0045]另外，在上述的方法中也同样，可以根据按时间序列的信号的形状进行表示来自各个发光粒子的光的信号的逐个检测。在实施方式中，典型地，可以在检测出具有大于规定阈值的强度的信号时，检测为一个发光粒子进入了光检测区域。具体地说，可以将在光强度数据上具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号，优选的是，可以使时序光强度数据平滑化，将在平滑化后的时序光强度数据中具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号。
[0046]并且，在上述的方法中也同样，可以包括以下步骤:对逐个检测出的来自发光粒子的信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置的移动过程中检测出的发光粒子的个数进行计数；和/或根据检测出的发光粒子的个数来决定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
[0047]上述本发明的光分析技术典型地用于分析或解析蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的生物学对象物在溶液中的状态的用途，但是也可以用于分析或解析非生物学粒子(例如原子、分子、胶束(micelles)、金属胶体等)在溶液中的状态，应该理解为这种情况也属于本发明的范围。
[0048]发明的效果
[0049]这样，在上述本发明的扫描分子计数法中，对光检测区域的位置的移动路径、即样本溶液内的扫描路径进行改进，尽可能地避免将同一发光粒子检测为不同的粒子以及避免光检测区域的尺寸、形状的变化，通过沿着更广的区域或更长距离的路径执行样本溶液内的扫描，能够防止发光粒子的检测数或数密度的精度变差。实际上，在使光检测区域的位置沿着一个循环路径移动的情况下，对于扩散速度低的发光粒子，有时并非意图地周期性地多次检测同一粒子而将来自同一粒子的信号检测为不同的粒子，或者由于发光粒子的退色(参照实施例)而存在粒子的检测数的精度变差、结果值的偏差变大的情况(但是，也能够通过有意地多次检测同一粒子来提高粒子特性的检测精度。)。根据本发明，光检测区域在其位置的移动期间，除了路径的交叉点以外扫描样本溶液内的不同的区域，因此将同一发光粒子检测为不同的粒子的可能性大幅降低，粒子的检测数的偏差缩小，或者发光粒子的退色的影响被抑制为最小限度(参照实施例)。
[0050]通过本发明的以下优选实施方式的说明可清楚本发明的其它目的和优点。
【专利附图】

【附图说明】
[0051]图1的(A)是执行本发明的扫描分子计数法的光分析装置的内部结构的示意图。图1的(B)是共焦区组织(共焦显微镜的观察区域)的示意图。图1的(C)是变更反射镜7的朝向使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。图1的(D)是移动微板的水平方向位置来移动样本溶液的位置的机构的示意图。
[0052]图2的㈧、⑶分别是说明应用本发明的扫描分子计数法中的光检测原理的示意图以及所测量的光强度的时间变化的示意图。图2的(C)是说明本发明中的通过变更光学系统的光路来使光检测区域的位置沿着扫描轨道(第二路径)移动的方式的图。图2的(D)是说明样本溶液的位置的移动(第二路径的位置沿着第一路径的移动)的方式的图。图2的(E)是说明样本溶液的位置的移动与沿着扫描轨道的光检测区域的位置的移动的关系的图。
[0053]图3是以流程图的形式表示依照本发明执行的扫描分子计数法的处理过程的图。
[0054]图4的(A)、(B)分别是表示在发光粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时以及在通过以比发光粒子的扩散移动速度快的速度使样本溶液内的光检测区域的位置移动而发光粒子横穿光检测区域时的粒子的运动方式的模型图。图4的(C)是说明用于依照扫描分子计数法根据所测量的时序光强度数据(光子计数的时间变化)检测发光粒子的存在的处理过程中的检测信号的信号处理过程的例子的图。
[0055]图5示出了所测量的光子计数数据的实测例子(直方图表)、对数据进行平滑处理而得到的曲线(虚线)以及在脉冲存在区域拟合的高斯函数(实线)。在图中，附加为“噪声”的信号作为由噪声或异物造成的信号而被忽略。
[0056]图6的㈧是在实施例1中观测的利用了分子信标的核酸结合反应的分子形态变化的示意图。图6的(B)示出了在(A)的反应系统的溶液中变更了目标粒子浓度时通过扫描分子计数法检测出的粒子数。“样本容器有移动”是依照本发明的教导同时执行通过变更光路进行的光检测区域的位置的移动和通过移动样本容器进行的光检测区域的位置的移动路径的移动的情况，“样本容器不移动”是仅执行通过变更光路进行的光检测区域的位置的移动的情况。直方图表是20秒X 30次的测量的平均值，误差条是CV值。图6的(C)示出了连续地执行20秒X30次的光测量时的每一次(20秒)检测出的发光粒子数的变化。
[0057]图7是在以往的计算荧光强度的波动的光分析技术中得到的光子计数(光强度)的时间变化的例子，(A)是样本内的粒子的浓度为能够提供足够的测量精度的程度的情况，(B)是样本内的粒子的浓度相比于(A)的情况大幅降低的情况。
[0058]附图标记说明
[0059]1:光分析装置(共焦显微镜)；2:光源；3:单模光纤(single-mode opticalfiber) ；4:准直透镜；5:分色镜；6、7、11:反射镜；8:物镜；9:微板；10:皿(样本溶液容器)；12:聚光镜(condenser lens) ；13:针孔；14:屏蔽滤波器；14a:分色镜或偏振分束器；15:多模光纤(mult1-mode optical fiber) ；16:光检测器；17:反射镜偏转器；17a:台位置变更装置；18:计算机。
【具体实施方式】
[0060]下面，详细说明本发明的优选实施方式。
[0061]光分析装置的结构
[0062]实现本发明的光分析技术的光分析装置可以是如下的装置:在基本结构中，如图1的(A)示意性地例示那样，组合能够执行FCS、FIDA等的共焦显微镜的光学系统和光检测器而成。参照该图，光分析装置I由光学系统2?17以及用于控制光学系统的各部分的动作并且获取并解析数据的计算机18构成。光分析装置I的光学系统可以与普通的共焦显微镜的光学系统相同，在此，使从光源2发射并在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的出射端成为以由固有的NA决定的角度发散的光而被发射，通过准直器4成为平行光，被分色镜5、反射镜6、7反射，入射到物镜8。典型地，在物镜8的上方配置有微板9，该微板9排列有注入了 I μ L?几十μ L的样本溶液的样本容器或皿10，从物镜8射出的激光在样本容器或皿10内的样本溶液中聚焦，形成光强度强的区域(激励区域)。在样本溶液中分散或溶解有作为观测对象物的发光粒子，典型地是附加有荧光性粒子或荧光色素等发光标识的粒子，当所述发光粒子进入到激励区域时，在其间发光粒子被激励而释放出光。所释放的光(Em)通过物镜8、分色镜5，被反射镜11反射而在聚光镜12聚光，通过针孔13，透过屏蔽滤波器14 (在此，只选择特定波长频带的光成分。)，被导入到多模光纤15，到达光检测器16，在被变换为按时间序列的电信号之后输入到计算机18，以后面说明的方式进行用于光分析的处理。此外，如本领域技术人员所了解的那样，在上述结构中，针孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置，由此仅从如图1的(B)示意性地表示的激光的焦点区域、即激励区域内发出的光通过针孔13，来自激励区域以外的光被遮断。图1的⑶所例示的激光的焦点区域通常是具有IfL?IOfL左右的有效体积的本光分析装置中的光检测区域(典型地，是光强度以区域中心为顶点的高斯型分布。有效体积是以光强度为l/e2的面为边界的大致椭圆球体的体积。)，被称为共焦区组织。另外，在本发明中，检测来自一个发光粒子的光、例如来自一个荧光色素分子的微弱光，因此作为光检测器16，优选的是使用能够在光子计数中使用的超高灵敏度的光检测器。在光的检测是通过光子计数进行的情况下，以在规定时间内按每个规定的单位时间(BIN TIME)逐次测量来到光检测器的光子的个数的方式执行光强度的测量。因而，在这种情况下，按时间序列的光强度的数据是按时间序列的光子计数数据。另外，可以在显微镜的台(未图示)设置用于移动微板9的水平方向位置以变更要观察的皿10的台位置变更装置17a。可以由计算机18控制台位置变更装置17a的动作。根据所述结构，在存在多个检体的情况下也能够达成迅速的测量。
[0063]并且，在上述的光分析装置的光学系统中，设置有用于通过光检测区域扫描样本溶液内的、即用于使焦点区域即光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构。作为所述的用于使光检测区域的位置移动的机构，例如图1的(C)示意性地例示的那样，可以采用变更反射镜7的朝向的反射镜偏转器17 (变更光路来移动光检测区域的绝对位置的方式)。所述反射镜偏转器17可以与在通常的激光扫描型显微镜中装备的检电镜装置相同。另外，还如图1的(D)所例示的那样，使台位置变更装置17a进行动作以移动注入有样本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置来移动样本溶液内的光检测区域的相对位置(使样本溶液的位置移动的方式)。如后面详细说明的那样，在本发明中，通过变更上述光路来使光检测区域的绝对位置移动的方式使光检测区域沿扫描轨道(第二路径)进行绕圈移动，同时通过使样本溶液的位置移动的方式来使样本溶液内的光检测区域的扫描轨道的位置沿着规定的移动路径(第一路径)移动。无论哪种方式，都在计算机18的控制下，与光检测器16的光检测相协调地驱动反射镜偏转器17或台位置变更装置17a以达成所期望的光检测区域的位置的移动图案。光检测区域的位置的扫描轨道可以是圆形、椭圆形等封闭的循环路径，可以从圆形、椭圆形、直线、曲线或它们的组合中任意地选择样本溶液的位置的移动路径(可以形成为在计算机18的程序中能够选择各种移动图案。)。
[0064]在作为观测对象物的发光粒子通过多光子吸收而发光的情况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在这种情况下，只在激励光的焦点区域(光检测区域)释放光，因此可以去除针孔13。另外，在作为观测对象物的发光粒子不通过激励光而通过化学发光、生物发光现象发光的情况下，可以省略用于生成激励光的光学系统2?5。在发光粒子通过磷光或散射而发光的情况下，能够直接使用上述的共焦显微镜的光学系统。并且，可以在光分析装置I中如图示那样设置多个激励光源2，可以设为能够根据发光粒子的激励波长而适当地选择激励光的波长。同样地，可以在检测光光路中插入分色镜14a，将检测光分割为多个波长频带，来由多个光检测器16分别进行检测。根据所述结构，还能够在检测与发光粒子的发光波长特性(发光频谱)有关的信息、包含有多种发光粒子的情况下，根据来自它们的光的波长分别检测该光。并且，关于光的检测，也可以使用向规定的方向偏振的光作为激励光，分别检测检测光的与激励光的偏振方向垂直的方向的成分，从而能够检测发光粒子的光的偏振特性。在这种情况下，在激励光光路中插入偏振片(未图示)，在检测光光路中插入偏振分束器14a。
[0065]计算机18具备CPU和存储器，通过由CPU执行各种运算处理来执行本发明的过程。此外，各过程也可以通过硬件构成。本实施方式所说明的处理的全部或一部分可以由计算机18使用存储有实现这些处理的程序的计算机可读取的存储介质执行。即，计算机18可以通过读出存储在存储介质中的程序来执行信息的加工、运算处理，由此实现本发明的处理过程。在此，计算机可读取的记录介质可以是磁盘、磁光盘、⑶-R0M、DVD-R0M、半导体存储器等，或者也可以将上述程序通过通信线路传输到计算机，由接受该传输的计算机来执行程序。
[0066]本发明的光分析技术的原理
[0067]如“
【发明内容】
” 一栏所记载的那样，如果清楚地进行描述，则在本发明的光分析技术中，在扫描分子计数法中光检测区域的位置在样本溶液内的平面内移动的过程中，使光检测区域的位置的扫描轨道移动，使得在短时间内尽可能地不通过同一区域，由此尽可能地避免将同一发光粒子检测为不同的粒子以及避免光检测区域的尺寸、形状的变化，抑制了发光粒子的检测数的偏差，提高了检测精度。下面，说明本发明的扫描分子计数法的原理、光检测区域的绕圈移动的方式。
[0068]1.扫描分子计数法的原理
[0069]FCS、FIDA等光谱分析技术与现有的生物化学的分析技术相比，其优点在于所需要的样本量极少且能够迅速地执行检查。然而，在FCS、FIDA等光谱分析技术中，在原理上，根据荧光强度的波动来估算发光粒子的浓度、特性，因此为了得到高精度的测量结果，要求如图7的(A)示意性地描绘的那样样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度为在荧光强度的测量过程中在光检测区域CV内始终存在一个左右的发光粒子的水平，如该图的右侧所示那样在测量时间中始终检测到有意义的光强度(光子计数)。如果发光粒子的浓度或数密度低于此水平，例如在如图7的(B)所描绘的那样发光粒子为只是偶尔进入到光检测区域CV内的水平的情况下，如该图的右侧所例示的那样，只在测量时间的一部分出现有意义的光强度的信号(光子计数)，难以进行高精度的光强度的波动的估算。另外，与在测量中在光检测区域内始终存在一个左右的发光粒子的水平相比发光粒子的浓度大幅降低的情况下，在光强度的波动的运算中，容易受到背景的影响，为了得到足够进行运算的量的有意义的光强度数据而测量时间变长。
[0070]因此，本申请的 申请人:在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于新原理的“扫描分子计数法”，即使发光粒子的浓度低于如上所述的在FCS、FIDA等光谱分析技术中要求的水平的情况下，也能够检测发光粒子的数密度或浓度等特性。
[0071]作为在扫描分子计数法中执行的处理，如果清楚地描述，则驱动用于使光检测区域的位置移动的机构来变更光路，如图2的(A)示意性地描绘的那样，一边使光检测区域CV的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域CV扫描样本溶液内，一边执行光检测。这样，例如在光检测区域CV移动的期间(图中为时间to?t2)，在通过存在一个发光粒子的区域时(tl)，从发光粒子释放出光，如在图2的⑶中所描绘的那样，在按时间序列的光强度数据上出现有意义的光强度(Em)的脉冲状的信号。这样，执行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，一个一个地检测其间出现的如图2的(B)所例示那样的脉冲状的信号(有意义的光强度)，由此逐个检测发光粒子，并对其个数进行计数，从而能够获取在所测量的区域内存在的发光粒子的个数、或者与浓度或数密度有关的信息。另外，能够根据信号的强度而针对每个发光粒子检测各种发光粒子的光的特性、发光粒子自身的特性。在所述的扫描分子计数法的原理中，不进行如荧光强度的波动的计算那样的统计性的运算处理而是一个一个地检测发光粒子，因此即使在要观测的粒子的浓度低至通过FCS、FIDA等无法以足够的精度进行分析的程度的样本溶液中，也能够获取与粒子的浓度或数密度、特性有关的信息。
[0072]2.光检测区域的扫描轨道
[0073]在上述的扫描分子计数法中，对于光检测区域的位置的移动，优选的是如后面更详细地说明的那样，与发光粒子的布朗运动造成的移动速度(扩散移动速度)相比是高速。另外，为了发光粒子及其它物质的稳定性，应该使样本溶液内的流动、振动等扰乱最小。因而，对于光检测区域的位置的移动，原则上优选通过变更显微镜的光学系统的光路来进行。如上述所说明的那样，这是因为通过利用反射镜偏转器17变更光路，能够比较容易地高速执行光检测区域的位置的移动。关于该点，物镜的视场的周缘一般像差变大，光检测区域的尺寸、形状根据场所的不同而有可能不同，因此，对于基于光路变更的光检测区域的位置的移动范围，优选在物镜的像差少的视场中心附近的区域内执行。然而，如果将光检测区域的位置的移动范围限制在物镜的视场中心附近的区域内，则光检测区域所通过的区域、即扫描区域变小，能够检测到的发光粒子的个数也变少。另外，在反复通过较小的区域的情况下，特别是对于扩散慢的粒子，光检测区域反复通过其存在区域，从而多次检测同一粒子。可是，虽然通过有意地反复检测来自同一粒子的光来高精度地估计该光的特性也是有用的，但是在发光粒子的个数的计数、浓度或数密度的检测等想要使发光粒子的检测数尽可能多时，优选不多次检测同一粒子而能够扫描更广范围的区域或更长的距离。另外，此时，在想要得到关于发光粒子的浓度的信息时，优选光检测区域的尺寸、形状几乎不变而容易估计扫描区域(光检测区域的通过区域)的长度或体积。
[0074]这样，在本发明中，考虑到如上所述的扫描分子计数法中的与光检测区域的位置的移动有关的要求，如已经记述的那样为了能够稳定地扫描更广范围的区域或更长的距离，而对光检测区域的位置的移动路径进行改进，以在二维平面内在使光检测区域的位置在规定的扫描轨道上移动的同时使该扫描轨道移动来尽可能地避免光检测区域的位置在短时间内通过(除了路径的交叉点以外)同一区域。
[0075]具体地说，首先，驱动图1的反射镜偏转器17来变更光路，在物镜的视场内，如图2的(C)那样使光检测区域沿扫描轨道(第二路径)绕圈移动。而且，与该运动同时地，如图2的(D)那样连续地驱动台位置变更装置17a来移动样本溶液的位置，由此以样本溶液为基准移动光检测区域的扫描轨道的位置，来尽可能地避免光检测区域在短时间内扫描同一区域。[如图2的(D)那样，当将样本溶液的位置的移动设为循环路径时，当光检测区域的扫描轨道的位置绕该循环路径一周时，光检测区域再次扫描相同的区域，但是在光检测区域的扫描轨道的位置绕一周的期间，通常假定发光粒子由于扩散而移动到其它的场所，因此可以认为同一发光粒子被再次检测的可能性非常低。]
[0076]此外，在期望以样本溶液为基准的光检测区域的速度大致固定以使发光粒子的光的信号的脉冲状形状始终固定的情况下，如果样本溶液的位置的移动速度高到与光检测区域在扫描轨道上的移动速度同等的程度，则以样本溶液为基准的光检测区域的速度发生变动。因此，优选的是，样本溶液的位置的移动速度与光检测区域在扫描轨道上的移动速度相比非常低(例如20%以下)。另外，如图2的(E)所示那样，在光检测区域绕扫描轨道一周时，为了避免前次(i)绕圈时通过的区域与本次(ii)绕圈时通过的区域重复，而设定样本溶液的位置的移动速度(扫描轨道的位置的移动速度)v2和光检测区域在扫描轨道上的移动周期τI使得与光检测区域的直径d之间
[0077]vv2.τ I) d...(I)
[0078]的关系成立。具体地说，光检测区域的直径d为0.4 μ m?30 μ m，当设光检测区域的扫描轨道上的移动周期τ I为0.6ms?600ms时，样本溶液的位置的移动速度v2为
0.67μπι/秒以上。实际上，通常光检测区域在扫描轨道上的移动周期τ I被设定为6ms?60ms，因此在这种情况下，样本溶液的位置的移动速度v2为17μπι/秒以上。光检测区域在扫描轨道上的移动速度典型地被设定为IOmm?90mm/秒，因此样本溶液的位置的移动速度v2小至几乎能够忽略的程度。
[0079]扫描分子计数法的处理操作过程
[0080]在依照使用了图1的(A)所例示的光分析装置I的本发明的扫描分子计数法的实施方式中，具体地说，执行以下的处理:(1)包含发光粒子的样本溶液的调制，⑵样本溶液的光强度的测量处理以及(3)测量出的光强度的分析处理。图3示出了以流程图的形式表示的本实施方式中的处理。
[0081](I)样本溶液的调制
[0082]作为本发明的光分析技术的观测对象物的粒子，如果是溶解的分子等在样本溶液中分散并在溶液中随机运动的粒子，则可以是任意的，例如可以是蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞、或金属胶体、其它非生物学分子等。在作为观测对象物的粒子不是发光的粒子的情况下，使用以任意的方式对作为观测对象物的粒子附加了发光标识(荧光分子、磷光分子、化学、生物发光分子)的粒子。样本溶液典型地是水溶液，但是不限定于此，可以是有机溶剂及其它任意的液体。
[0083](2)样本溶液的光强度的测量(图3-步骤100)
[0084]对于本实施方式的利用扫描分子计数法的光分析中的光强度的测量，除了在测量过程中驱动反射镜偏转器17和台位置变更装置17a来进行光检测区域的位置在样本溶液内的移动(样本溶液内的扫描)以及样本溶液的移动以外，可以通过与FCS或FIDA中的光强度的测量过程相同的方式执行。在操作处理中，典型地，在向微板9的皿10注入样本溶液并载置在显微镜的台上后，在使用者向计算机18输入开始测量的指示时，计算机18依照存储在存储装置(未图示)中的程序(使光检测区域的位置在样本溶液内移动的过程和在光检测区域的位置的移动过程中检测来自光检测区域的光并生成按时间序列的光强度数据的过程)，开始样本溶液内的光检测区域中的激励光的照射以及光强度的测量。在所述测量中，在依照计算机18的程序的处理动作的控制下，首先，反射镜偏转器17驱动反射镜7(检电镜)来执行在皿10内沿着扫描轨道的光检测区域的位置的绕圈移动，并且由台位置变更装置17a移动显微镜的台上的微板9的位置。与此同时，光检测器16将逐次检测出的光变换为电信号并发送到计算机18，在计算机18中，通过任意的方式，根据所发送的信号生成按时间序列的光强度数据并保存。这样，在任意的时间执行这些处理而结束一次测量。此外，典型地，光检测器16是能够检测单光子的到来的超高灵敏度光检测器，因此在通过光子计数进行光的检测的情况下，时序光强度数据可以是按时间序列的光子计数数据。
[0085]光强度的测量过程中光检测区域的位置沿着扫描轨道绕圈移动时的移动速度可以是任意地设定以例如符合实验或分析目的的规定的速度。在根据检测出的发光粒子的个数来获取与其数密度或浓度有关的信息的情况下，需要光检测区域通过的区域的大小或体积，因此以能够掌握移动距离的方式执行光检测区域的位置的移动。此外，由于测量中的经过时间与光检测区域的位置的移动距离具有比例关系更容易解释测量结果，因此优选移动速度基本上是固定速度，但是不限定于此。 [0086]为了满足上述式(I)的条件并且定量地高精度地执行基于测量出的按时间序列的光强度数据的发光粒子的逐个检测或者发光粒子的个数的计数，优选将光检测区域的位置的移动速度设定为比发光粒子的随机运动、即布朗运动所引起的移动速度快的值。本发明的光分析技术的观测对象粒子是在溶液中分散或溶解并自由且随机运动的粒子，因此由于布朗运动，位置随着时间而移动。因而，在光检测区域的位置的移动速度比粒子的布朗运动所引起的移动慢的情况下，如图4的(A)示意性地描绘的那样，粒子在区域内随机地移动，由此光强度随机地变化(如已经提及的那样，光检测区域的激励光强度以区域的中心为顶点向外方降低。)，难以确定与各个发光粒子对应的有意义的光强度的变化。因此，优选的是将光检测区域的位置的移动速度设定得比粒子的因布朗运动引起的平均移动速度(扩散移动速度)快，使得如图4的(B)所描绘的那样粒子大致直线地横穿光检测区域，由此在按时间序列的光强度数据中如图4的(C)最上部所例示的那样与各个发光粒子对应的光强度的变化的轮廓大致一致(在发光粒子大致直线地通过光检测区域的情况下，光强度的变化的轮廓为与激励光强度分布大致相同的吊钟型。)，从而能够容易地确定各个发光粒子与光强度之间的对应。
[0087]具体地说，具有扩散系数D的发光粒子由于布朗运动而通过半径Wo的光检测区域(共焦区组织)时所需要的时间根据以下的平均平方位移的关系式
[0088](2Wo)2=6D.At...(2)
[0089]而成为
[0090]At=(2ffo)2/6D— (3),
[0091]因此，发光粒子因布朗运动而移动的速度(扩散移动速度)Vdif大致为
[0092]Vdif=2ffo/ At = 3D/Wo…(4)。
[0093]因此，可以参照所述Vdif将光检测区域的位置的移动速度设定为与其相比充分快的值。例如在预想观测对象粒子的扩散系数是D=2.0X l(Tlclm2/s左右的情况下，在设Wo为0.62 μ m左右时，Vdif为1.0X 10_3m/s，因此，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为其10倍以上的15mm/s等。此外，在观测对象粒子的扩散系数未知的情况下，可以设定各种光检测区域的位置的移动速度，反复执行用于找到光强度的变化的轮廓为预想的轮廓(典型地，与激励光强度分布大致相同)的条件的预备实验，来决定适合的光检测区域的位置的移动速度。
[0094](3)光强度的分析
[0095]当通过上述处理得到样本溶液中的发光粒子的按时间序列的光强度数据时，在计算机18中，通过依照存储在存储装置中的程序的处理，执行光强度数据上的与来自发光粒子的光对应的信号的检测、发光粒子浓度的计算等分析。
[0096](i)与发光粒子对应的信号的检测
[0097]在按时间序列的光强度数据中，在一个发光粒子通过光检测区域时的轨迹如图4的(B)所示那样是大致直线状的情况下，与该粒子对应的信号中的光强度的变化具有反映(由光学系统决定的)光检测区域内的光强度分布的大致吊钟状的轮廓(参照图4的(C)的最上部)。因而，在扫描分子计数法中，基本上可以在超过适当设定的阈值的光强度所持续的时间宽度处于规定的范围时，判断为具有该光强度的轮廓的信号与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测。而且，超过阈值的光强度所持续的时间宽度不在规定的范围内的信号被判定为噪声或异物的信号。另外，在能够将光检测区域的光强度分布假定为高斯分布，即
[0098]=A.e X P (_2t2/a22)…(5)，
[0099]在使式(5)拟合有意义的光强度的轮廓(能够明确地判断为不是背景的轮廓)而计算出的强度A和宽度a处于规定的范围内时，可以将该光强度的轮廓判断为与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测。(强度A和宽度a处于规定的范围外的信号被判断为噪声或异物的信号，在其后的分析等中可以忽略。)
[0100]作为从时序光强度数据中一并检测发光粒子的处理方法的一个例子，首先，对时序光强度数据(图4的(C)、最上部“检测结果(未处理)”)进行平滑(平滑化)处理(图3的(C)-步骤110、图4的(C)的中上部`“平滑”)。发光粒子所发出的光是概率性地释放的，在微小的时间内可能产生数据值的缺失，因此通过所述平滑处理，能够忽略如上所述的数据值的缺失。例如可以通过移动平均法等进行平滑处理。此外，也可以根据获取光强度数据时的光检测区域的位置的移动速度(扫描速度)、ΒΙΝ --ΜΕ，适当地设定执行平滑处理时的参数、例如在移动平均法中进行一次平均的数据个数、移动平均的次数等。
[0101]接着，在平滑处理后的时序光强度数据中，为了检测有意义的脉冲状的信号(以下称为“脉冲信号”)所存在的时间区域(脉冲存在区域)，对平滑处理后的时序光强度数据的时间计算一次微分值(步骤120)。时序光强度数据的时间微分值如图4的(C)的中下部“时间微分”所例示的那样，信号值变化时间点的值的变化大，因此通过参照所述时间微分值，能够有利于决定有意义的信号的起点和终点。
[0102]然后，在时序光强度数据上逐次检测有意义的脉冲信号，判断检测出的信号是否为与发光粒子对应的信号。具体地说，首先在时序光强度数据的按时间序列的时间微分值数据上，参照时间微分值逐次搜索并决定一个脉冲信号的起点和终点，确定脉冲存在区域(步骤130)。当确定了一个脉冲存在区域时，针对该脉冲存在区域中的平滑后的时序光强度数据进行吊钟型函数的拟合(图4的(C)的下部“吊钟型函数拟合”)，计算吊钟型函数的脉冲的峰值(最大值)的强度Ipeak、脉冲宽度(半峰全宽)Wpeak、拟合时的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。此外，拟合的吊钟型函数典型地是高斯函数，但也可以是洛仑兹型函数。然后，判断计算出的吊钟型函数的参数是否处于对针对一个发光粒子通过光检测区域时检测出的脉冲信号所描绘的吊钟型轮廓的参数所设想的范围内，即判断脉冲的峰值强度、脉冲宽度、相关系数是否分别处于规定范围内、例如是否满足下述的条件等(步骤150)，即
[0103]20 μ s< 脉冲宽度〈400 μ S
[0104]峰值强度>1.0 [pc/10 μ s]…(A)
[0105]相关系数>0.95。
[0106]这样，如图5的左边所示那样，将被判断为计算出的吊钟型函数的参数处于针对与一个发光粒子对应的信号设想的范围内的信号判断为是与一个发光粒子对应的信号，由此，检测出一个发光粒子。另一方面，如图5的右边所示那样，计算出的吊钟型函数的参数不在设想的范围内的脉冲信号作为噪声而被忽略。
[0107]可以在时序光强度数据的整个区域中反复执行上述步骤130~150的处理中的脉冲信号的搜索和判断(步骤160)。此外，根据时序光强度数据逐个检测发光粒子的信号的处理不限于上述的过程，可以通过任意的方法执行。
[0108](ii)发光粒子浓度的确定
[0109]并且，也可以对检测出的发光粒子的信号的个数进行计数来确定发光粒子的个数(发光粒子的计数)。另外，如果通过任意的方法能够估算出光检测区域所通过的区域的总体积，则根据其体积值和 发光粒子的个数来决定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度(步骤170)。
[0110]光检测区域所通过的区域的总体积可以根据激励光或检测光的波长、透镜的数值孔径、光学系统的调整状态在理论上进行估算，但是也可以根据通过实验、例如针对发光粒子的浓度已知的溶液(对照溶液)以与要检查的样本溶液的测量相同的条件进行上述所说明的光强度的测量、发光粒子的检测以及计数所检测出的发光粒子的个数和对照溶液的发光粒子的浓度来决定。具体地说，例如针对发光粒子的浓度C的对照溶液，当将对照溶液的发光粒子的检测数设为N时，光检测区域所通过的区域的总体积Vt通过下式给出。
[0111]Vt=N/C...(6)
[0112]另外，可以准备发光粒子的浓度不同的多个溶液作为对照溶液，针对多个溶液分别执行测量，采用计算出的Vt的平均值作为光检测区域所通过的区域的总体积Vt。而且，当给出Vt时，发光粒子的计数结果为η的样本溶液的发光粒子的浓度c通过下式给出。
[0113]c=n/Vt...(7)
[0114]此外，可以不依据上述的方法而通过任意的方法、例如通过利用FCS、FIDA等给出光检测区域的体积、光检测区域所通过的区域的总体积。另外，在本实施方式的光分析装置中，关于所设想的光检测区域的移动图案，可以针对各种标准的发光粒子将浓度C与发光粒子的个数N之间的关系(式(6))的信息预先存储到计算机18的存储装置中，在装置的使用者实施光分析时能够适当地利用所存储的关系的信息。
[0115]这样，在通过光检测区域在样本溶液中扫描来逐个检测发光粒子的扫描分子计数法中，通过上述的处理过程，能够进行样本溶液中的发光粒子的计数、浓度的确定等。
[0116](iii)各种特性的确定
[0117]当进行发光粒子信号的检测时，除了发光粒子浓度以外，还能够使用信号的强度值获得与各种发光粒子的光的特性、发光粒子自身的特性有关的信息(信号的特征量)。例如在检测光的测量中，按偏振方向分别测量检测光，在按偏振方向生成光强度数据的情况下，能够根据基于这些光强度数据分别获得的信号的强度值来计算表示偏振度、偏振各向异性等偏振特性的任意指标值，根据所述指标值进一步计算发光粒子的旋转扩散特性的指标值。另外，在检测光的测量中，分别测量检测光的多个波长频带的成分，在按波长频带生成了光强度数据的情况下，能够根据基于这些光强度数据分别获得的信号的强度值来获得与发光粒子的发光波长频谱有关的信息(例如多个波长下的强度比)。在此，应该理解的一点在于在作为本发明的对象的扫描分子计数法中，针对每个发光粒子确定如上所述的与发光粒子的光的特性、发光粒子自身的特性有关的信息。
[0118]这样，根据上述本发明，在扫描分子计数法中，获得与样本溶液中的发光粒子的数密度、浓度有关的信息或与其它特性有关的信息。特别是在本发明中，如已经记述的那样，关于上述的光检测区域的位置的移动，在样本溶液中的二维的平面内，使光检测区域的位置沿着扫描轨道移动，并且移动样本溶液的位置由此移动样本溶液内的光检测区域的位置的扫描轨道的位置，由此将光检测区域的形状、尺寸的变化抑制为最小限度，并且避免光检测区域在短期间内重复通过同一区域。而且，根据所述结构，大幅地降低同一发光粒子被非意图地检测两次以上的可能性，尽可能多地检测更广区域中的发光粒子，实现了检测出的结果的精度的提高。
[0119]为了验证上述所说明的本发明的有效性而进行了如下的实验。此外，应该理解为下面的实施例例示本发明的有效性，不是限定本发明的范围。
[0120]实施例1
[0121]在依照上述扫描分子计数法检测发光粒子的信号并对其信号数进行计数的情况下，针对光检测区域的位置的移动方式与检测到的信号数的关系进行评价。通过实验验证了使用分子信标能够检测出特定的碱基序列的核酸分子。分子信标是指在两端分别付加有作为荧光能量转移现象的供体的荧光色素FL和作为受体Qc的分子的核酸分子。单体是如下结构的分子:如图6的(A)的左图示意性地描绘的那样，供体色素FL与受体分子Qc的距离接近而产生从供体色素向受体色素的荧光能量转移现象FRET，另一方面，当同具有与自身的碱基序列互补的碱基序列的核酸或核酸类似物T结合时，如图6的(A)的右图示意性地描绘的那样，供体色素FL与受体分子Qc之间的距离远离而不产生荧光能量转移现象。在本实施例中，作为供体色素，使用ATT0647N，作为受体分子，使用作为吸收ATT0647N的荧光的消光分子的BHQ2。因而，在分子信标单体的情况下，ATT0647N的荧光通过荧光能量转移现象被BHQ2吸收而不释放荧光，但是当与作为目标的核酸结合时，供体色素与受体分子的距离远离，释放荧光Em而能够检测出。
[0122]如下这样调制样本溶液。
[0123](调制作为分子信标的目标的核酸)
[0124]人工合成k-Ras基因并插入到质粒中，通过克隆纯化而得到(合成和纯化依靠北海道系统自然科学)。将合成得到的质粒作为模板(对PUC57载体插入k-RasWt序列而得到的模板)，复制10000个k-Ras质粒，将0.1 μ M的FwPrimer(F asmac)、0.I μ M的RePrimer (Fasmac)、0.125U 的 PrimeStar Taq (TaKaRa> RO10Α)、1 倍的 PrimeStar Buffer>800mM的dNTPs、2%的DMSO在10 μ L的反应容量中以(98°C 10秒一72°C 3分钟)X 35个循环的热循环进行PCR放大。然后，将PCR产物利用Wizard SV凝胶及PCR纯化系统(WizardSV Gel and PCR Clean-Up system(Promega、A9281)进行纯化，纯化出具有目标序列的核酸。此外,FwPrimer (kRas基因放大用)具有序列编号I的碱基序列,RePrimer (kRa s基因放大用)具有序列编号2,向pUC57载体导入k-Ras而得到的|旲板具有序列编号3的喊基序列。
[0125](杂交反应)
[0126]将在具有序列编号4的碱基序列的DNA的5’末端标记ATT0647N、在3’末端标记BHQ2得到的分子信标(83b、20pM、Sigma-genosys)与对插入有k-Ras基因的质粒进行PCR放大后进行纯化得到的模板(OpM~50pM)混合，在Tris缓冲液(IOmM的Tris-HCl (pH8.0)、400mM 的 NaCl.0.1% 的 PluronicF-127、10% 的硫酸葡聚糖))中，进行 95。。下 2 分钟、60°C下3个小时的退火，并在10°C下进行保存回收。 [0127]在光的测量中，作为光分析装置，利用具备共焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测量装置MF20 (奥林巴斯株式会社)，依照上述的“(2)样本溶液的光强度的测量”中所说明的方式，针对上述的样本溶液获取了时序光强度数据(光子计数数据)。此时，激励光使用633nm的激光(600 μ W)，利用带通滤波器来测量660nm_710nm的波长频带的光。将样本溶液中的光检测区域的位置的扫描轨道设为直径大约50 μ m的圆，将移动速度设为15mm/秒，将绕圈移动的周期设为IOm秒(=6000rpm)，使样本容器的位置沿着长轴2mm和短轴Imm的椭圆形以4mm/秒的移动速度(45rpm)移动(样本容器有移动的情况)。对于光测量，将BIN TIME设为10 μ S，通过光子计数连续地执行30次20秒的测量(即，在600秒内连续地执行光测量。)。另外，关于只样本容器的位置的移动不执行的情况，将其它条件设为相同来进行测量(样本容器不移动的情况)。
[0128]在光测量后的数据处理中，按照上述的“(3) (i)与发光粒子对应的信号的检测”所记载的处理过程，对在各条件下针对样本溶液获取到的按时间序列的光子计数数据中检测出表示来自的发光粒子的光的信号进行计数。在步骤110中的利用数据的移动平均法进行的平滑中，将一次进行平均的数据点设为9个，重复进行5次移动平均处理。另外，在步骤140的拟合中，通过最小二乘法使高斯函数拟合时序数据，决定(高斯函数中的)峰值强度、峰值宽度(半峰全宽)、相关系数。并且，在步骤150中的判断处理中，仅将满足下述条件、即
[0129]20 μ s< 脉冲宽度〈400 μ S
[0130]峰值强度>1.0 [pc/10 μ s]…(A)
[0131]相关系数>0.95
[0132]的脉冲信号判定为是与发光粒子对应的信号，另一方面，不满足上述条件的脉冲信号作为噪声而忽略，将判定为是与发光粒子对应的信号的信号的个数作为“脉冲数”进行计数。此外，上述的峰值强度的阈值是不会将光检测器APD自身的噪声错误检测为发光粒子的信号的程度的大小。
[0133]图6的(B)示出了针对对目标核酸的浓度进行各种变更而调制出的样本溶液依照上述的处理过程测量出的发光粒子的检测数的平均值(直方图表)和CV值(误差条)。图中的值是以20秒的测量为一次、根据30次的测量中的检测数计算出的平均值和CV值。参照该图，在各浓度的样本溶液中，在执行样本容器的移动的情况和没有执行样本容器的移动的情况中检测数的平均值未发现大的差，但是相对于在没有执行样本容器的移动的情况下CV值是5?19%，在执行了样本容器的移动的情况下CV值是2?3%，结果值的偏差被大幅地缩小。并且，当将针对浓度的检测数的灵敏度考虑为是ISD时，相对于在没有执行样本容器的移动的情况下能够识别的浓度的下限为50pM，在执行了样本容器的移动的情况下能够识别的浓度的下限为500fM，能够看到100倍的改善。即，根据上述的结果，确认出通过本发明能够缩小发光粒子的检测数的结果值的偏差和改善精度。
[0134]另外，图6的(C)示出了针对目标核酸的浓度为50pM的样本溶液连续地执行30次20秒的测量时的发光粒子的平均值的变化。此外，纵轴表示各次的检测数与第一次(最初的20秒)检测出的粒子数之比。如参照该图明显可知的那样，在执行30次的期间，每一次(每20秒)的发光粒子的检测数在执行了样本容器的移动的情况下几乎不变，与此相对地，在没有执行样本容器的移动的情况下，发生变动并且下降到大约55%。在本实施例中的发光粒子中，当如上述那样分子信标与目标核酸分子结合时，发出荧光，检测到其存在，因此考虑为同一样本溶液中的检测数的变动和减少是由于荧光色素的退色引起的。而且，荧光色素的退色与针对色素的激励光的照射量相应地发展，因此暗示了没有执行样本容器的移动的情况下的荧光色素的退色所引起的检测数的变动和减少是由于在光检测区域绕扫描轨道一周的期间或绕圈的期间发光粒子未脱离光检测区域的扫描轨道而发光粒子成为被反复照射激励光的状态。另一方面，在执行了样本容器的移动的情况下，认为始终是不同的发光粒子逐次进入光检测区域，因此几乎不会产生荧光色素的退色。
[0135]这样，如从上述的实施例的结果理解的那样，确认出依照本发明的教导，通过使光检测区域沿扫描轨道绕圈并移动样本溶液的位置，防止对同一粒子反复进行激励光照射，从而将同一粒子错误识别为不同的粒子的可能性变低，能够进行更广范围的扫描，由此粒子的检测数的偏差缩小、精度得到提高。
【权利要求】
1.一种光分析装置，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析装置的特征在于，包括: 光检测区域移动部，其使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内的平面内移动； 光检测部，其检测来自上述光检测区域的光；以及 信号处理部，其生成一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边由上述光检测部检测出的来自上述光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在上述按时间序列的光强度数据中逐个检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号， 其中，上述光检测区域移动部使上述光检测区域的位置沿着第二路径移动，该第二路径的位置沿着第一路径移动。
2.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 上述第一路径和上述第二路径是循环路径，沿着上述第二路径的上述光检测区域的位置的移动周期比沿着上述第一路径的上述第二路径的位置的移动周期短。
3.根据权利要求2所述的光分析装置，其特征在于， 上述光检测区域的位置的移动周期τ 1、上述第二路径的位置的移动速度ν2以及上述光检测区域的直径d满足
ν2.τ I) d。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 通过变更上述光学系统的光路来使上述光检测区域的位置沿着上述第二路径移动，通过移动上述样本溶液的位置来使上述样本溶液内的上述第二路径的位置沿着上述第一路径移动。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述第二路径是圆形或椭圆形，上述第一路径是圆形、椭圆形或直线。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述光检测区域移动部使上述光检测区域的位置以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部对逐个检测出的表示来自上述发光粒子的光的信号的个数进行计数来对在上述光检测区域的位置的移动过程中检测出的上述发光粒子的个数进行计数。
8.根据权利要求1至7中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部在检测出表不具有大于规定阈值的强度的光的信号时，检测出一个发光粒子进入了上述光检测区域。
9.根据权利要求1至8中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部使上述按时间序列的光强度数据平滑化，将平滑化后的上述按时间序列的光强度数据中具有超过上述规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个上述发光粒子的光的信号。
10.根据权利要求1至9中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部根据检测出的上述发光粒子的个数，来决定上述样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
11.一种光分析方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析方法的特征在于，包括以下过程: 光检测区域移动过程，使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内的平面内移动； 时序光强度数据生成过程，在上述光检测区域的位置移动的期间检测来自上述光检测区域的光，生成按时间序列的光强度数据；以及 发光粒子信号检测过程，使用上述按时间序列的光强度数据，逐个检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号， 其中，在上述光检测区域移动过程中，使上述光检测区域的位置沿着第二路径移动，该第二路径的位置沿着第一路径移动。
12.根据权利要求11所述的光分析方法，其特征在于， 上述第一路径和上述第二路径是循环路径，沿着上述第二路径的上述光检测区域的位置的移动周期比沿着上述第一路径的上述第二路径的位置的移动周期短。
13.根据权利要求11或12所述的光分析方法，其特征在于， 上述光检测区域的位置的移动周期τ 1、上述第二路径的位置的移动速度ν2以及上述光检测区域的直径d满足
ν2.τ I) d。
14.根据权利要求11至13中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 通过变更上述光学系统的光路来使上述光检测区域的位置沿着上述第二路径移动，通过移动上述样本溶液的位置来使上述样本溶液内的上述第二路径的位置沿着上述第一路径移动。
15.根据权利要求11至14中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 上述第二路径是圆形或椭圆形，上述第一路径是圆形、椭圆形或直线。
16.根据权利要求11至15中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 在上述光检测区域移动过程中，使上述光检测区域的位置以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。
17.根据权利要求11至16中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 还包括以下过程:对逐个检测出的表示来自上述发光粒子的光的信号的个数进行计数来对在上述光检测区域的位置的移动过程中检测出的上述发光粒子的个数进行计数。
18.根据权利要求11至17中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 在上述发光粒子信号检测过程中，在检测出表示具有大于规定阈值的强度的光的信号时，检测出一个发光粒子进入了上述光检测区域。
19.根据权利要求11至18中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 在上述发光粒子信号检测过程中，使上述按时间序列的光强度数据平滑化，将平滑化后的上述时序光强度数据中具有超过上述规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个上述发光粒子的光的信号。
20.根据权利要求11至19中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 还包括以下过程:根据检测出的上述发光粒子的个数，来决定上述样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
21.一种光分析用计算机程序，用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析用计算机程序的特征在于，使计算机执行以下步骤: 光检测区域移动步骤，使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内的平面内沿着第二路径移动，该第二路径的位置沿着第一路径移动； 时序光强度数据生成步骤，在上述光检测区域的位置移动的期间检测来自上述光检测区域的光，生成按时间序列的光强度数据；以及 发光粒子信号检测步骤，使用上述时序光强度数据，逐个检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号。
22.根据权利要求21所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 上述第一路径和上述第二路径是循环路径，沿着上述第二路径的上述光检测区域的位置的移动周期比沿着上述第一路径的上述第二路径的位置的移动周期短。
23.根据权利要求21或22所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 上述光检测区域的位置的移动周期τ 1、上述第二路径的位置的移动速度ν2以及上述光检测区域的直径d满足
ν2.τ I) d。
24.根据权利要求21至23中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 通过变更上述光学系统的光路来使上述光检测区域的位置沿着上述第二路径移动，通`过移动上述样本溶液的位置来使上述样本溶液内的上述第二路径的位置沿着上述第一路径移动。
25.根据权利要求21至23中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 上述第二路径是圆形或椭圆形，上述第一路径是圆形、椭圆形或直线。
26.根据权利要求21至25中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 在上述光检测区域移动步骤中，使上述光检测区域的位置以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。
27.根据权利要求21至26中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 还使计算机执行以下步骤:对逐个检测出的表示来自上述发光粒子的光的信号的个数进行计数来对在上述光检测区域的位置的移动中检测出的上述发光粒子的个数进行计数。
28.根据权利要求21至27中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 在上述发光粒子信号检测步骤中，在检测出表示具有大于规定阈值的强度的光的信号时，检测出一个发光粒子进入了上述光检测区域。
29.根据权利要求21至28中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 在上述发光粒子信号检测步骤中，使上述按时间序列的光强度数据平滑化，将平滑化后的上述时序光强度数据中具有超过上述规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个上述发光粒子的光的信号。
30.根据权利要求21至29中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 还使计算机执行以下步骤:根据检测出的上述发光粒子的个数，来决定上述样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
【文档编号】G01N21/64GK103733049SQ201280039905
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年7月11日 优先权日:2011年8月15日
【发明者】田边哲也, 山口光城 申请人:奥林巴斯株式会社