蛋白质唾液酸化的快速和准确分析的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及用于分析糖蛋白质的唾液酸化的方法和试剂盒。糖蛋白质样品在三个条件下分别孵育：含β-半乳糖苷酶，含β-半乳糖苷酶+α-唾液酸酶，不含酶。酶处理后，用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法（HPAEC?PAD）定量测定样品中总的半乳糖，非唾液酸化的半乳糖和在培养基中的外源半乳糖。所述值的测定可以推导出糖蛋白质的唾液酸化的百分比。
【专利说明】蛋白质唾液酸化的快速和准确分析
【技术领域】
[0001]本发明描述的是用于分析蛋白质唾液酸化的分析方法。
【背景技术】
[0002]许多蛋白质行使它们的生物学功能需要糖基化。通常，末端，“加帽”，糖基链的碳水化合物是唾液酸残基。唾液酸包括一个N-和O-连接的神经氨酸家族。N-连接的唾液酸通过将乙酰基或羟乙酰基部分连接到神经氨酸的氨基酸残基而形成，分别形成N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。如果神经氨酸的氨基被羟基基团取代，这会产生3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖-2-非酮糖(nonulosonic)酸(KDN)。O-连接的唾液酸是用甲基，乙酰基，乳酰基，硫酸，或磷酸基团取代Neu5Ac，Neu5Gc,或KDN的一个或多个羟基而形成。因此，存在大量且不同种类的唾液酸。
[0003]此外，一般来说，由于这些修饰的许多生物学功能，有相当大的兴趣来分析蛋白质唾液酸化作用。唾液酸化作用对药代动力学和蛋白质生物疗法的功效是重要的。因此，已研发了一些分析方法用来评估糖蛋白的唾液酸含量。例如，基于抗体的测定方法可用于确定特定的碳水化合物部分。末端唾液酸残留可以从目标糖蛋白进行酶分离并通过HPLC分析。然而，这些方法都有缺点且通常需要纯的样品或高的浓度。生物制药行业使用的常规方法的精确度低，数据可变性高，且由于基质干扰它们并不能应用于复杂的培养基。本发明所述的方法克服了这些缺点并提供了蛋白质唾液酸化作用的准确和可重复的定量。
[0004]总的来说，本发明所述的方法包括两个步骤:(1)使用酶促反应来水解来自糖蛋白的半乳糖和唾液酸残基；和(2)使用离子交换色谱方法来分离和定量半乳糖残基。该方法的酶促反应部分涉及在特 异性的外-糖苷酶，β - (1-4)-半乳糖苷酶(β -半乳糖苷酶)作用下暴露的(未加帽的)末端半乳糖残基的释放，而末端唾液酸残基在α -(2-3，6，8，9)唾液酸酶(α-唾液酸酶)作用下释放。消化之前，将样品至少分为三管。第一管，反应Α，是背景样品，并且仅包括酶促反应缓冲液。第二管，反应B，与能够切割所有未由唾液酸加帽的半乳糖残基的半乳糖苷酶反应。第三管，反应C，与唾液酸苷酶和半乳糖苷酶共同消化。唾液酸苷酶除去加帽的唾液酸并允许β_半乳糖苷酶切割所有暴露的半乳糖残基。高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAECPAD)用于测定三个样品中存在的半乳糖的量。未加帽的半乳糖(即，反应B)与总的半乳糖卿，反应C)的比值用来计算半乳糖残基的加帽百分比，同时也计量培养基(反应Α)中存在的任何游离半乳糖。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种用于分析蛋白质的唾液酸化的方法。
[0006]本发明也提供了一种用于测定蛋白质的唾液酸含量的方法，其包括:(a)制备用于分析的蛋白质；(b)酶处理制备的蛋白质，包括:将制备的蛋白质分成多个蛋白质样品，包括(i)至少一个蛋白质样品作为培养基样品(反应A) ;(ii)在至少一个蛋白质样品中加入至少半乳糖苷酶(反应B); (iii)在至少另一个蛋白质样品中加入至少β-半乳糖苷酶和α-唾液酸酶(反应C);并孵育多个蛋白质样品；以及(C)利用HPAEC-PAD色谱法分析多个蛋白质样品；(d)测定多个蛋白质样品的碳水化合物含量；和&)计算蛋白质的唾液酸化百分比。
[0007]本发明还提供了一种方法，其进一步包括:(f)利用HPAEC-PAD色谱法分析多个阳性和阴性对照；(g)利用HPAEC-PAD色谱法分析多个标准品；以及(h)将多个蛋白质样品与多个标准品和对照进行比较。
[0008]本发明也提供了用于测定蛋白质的唾液酸含量的HPAEC-PAD色谱法的应用，其包括:(a)制备用于分析的蛋白质；(b)酶处理制备的蛋白质，包括:将制备的蛋白质分成多个蛋白质样品，包括(i)至少一个蛋白质样品作为培养基样品(反应A) ;(ii)在至少一个蛋白质样品中加入至少β_半乳糖苷酶(反应B) ; (iii)在至少另一个蛋白质样品中加入至少β-半乳糖苷酶和α-唾液酸酶(反应C);并孵育多个蛋白质样品；以及(C)利用HPAEC-PAD色谱法分析多个蛋白质样品；(d)测定多个蛋白质样品的碳水化合物含量；以及(e)计算蛋白质的唾液酸化百分比。
[0009]本发明还提供了一种应用，其进一步包括:(f)利用HPAEC-PAD色谱法分析多个阳性和阴性对照；(g)利用HPAEC-PAD色谱法分析多个标准品；以及(h)将多个蛋白质样品与多个标准品和对照进行比较。
[0010]本发明还提供了一种用于测定任何蛋白质的唾液酸含量的试剂盒，其包括:包括含有预定量的半乳糖苷酶和唾液酸酶的多个容器的至少一个容器；任选地，容器含有至少一种缓冲液组合物，一种阳性对照样品，一种阴性对照样品，和碳水化合物标准品，以及记载了用于测定蛋白质的唾液酸含量的方法的说明书，包括如下记载:(a)制备用于分析的蛋白质；(b)酶处理制备的蛋白质，包括:将制备的蛋白质分成多个蛋白质样品，包括(i)至少一个蛋白质样品作为培养基样品(反应A);(ii)在至少一个蛋白质样品中加入至少β -半乳糖苷酶(反应B) ； (iii)在至少另一个蛋白质样品中加入至少β -半乳糖苷酶和α -唾液酸酶(反应C);并孵育多个蛋白质样品；以及(C)利用HPAEC-PAD色谱法分析多个蛋白质样品；(d)测定多个蛋白质样品的碳水化合物含量；以及(e)计算蛋白质的唾液酸化百分比。`
[0011]本发明还提供了一种试剂盒，其进一步包括:(f)利用HPAEC-PAD色谱法分析阳性和阴性对照；(g)利用HPAEC-PAD色谱法分析多个标准品；以及(h)将多个蛋白质样品的结果与多个标准品的结果进行比较。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为反应A，B和C的示意图，及每个相应的反应得到的数据。唾液酸化加帽百分比可以分别由反应C和B的差值与反应C和A的差值的商确定。见公式I。
[0013]图2为在反应C中消化的recAlpha-Ι样品的典型的色谱图。半乳糖洗脱时间的范围为约14到16分钟。
[0014]图3为用去离子水透析或者经IOkDa旋转过滤器离心的上游recAlpha_l样品的色谱图比较。杂质残留在透析的样品中，但几乎完全被IOkDa旋转过滤器去除。
[0015]图4表明recAlpha-Ι培养基中的上游赋形剂可以被检测到并且可以在半乳糖峰的附近共同洗脱。在A图中，在旋转过滤器纯化后的一些样品中显示出赋形剂峰在半乳糖峰旁边洗脱。对于反应B的样品，杂质峰是从半乳糖峰去除的基线且是不完整的。在B图中，为杂质峰与反应C的样品共同洗脱的过程。在这种情况下，杂质峰如上所示必须被分割以将其从整合入半乳糖峰的面积中排除。
[0016]图5为通过分析从糖蛋白衍生的中性单糖和氨基单糖的混合物来确认方法特异性。
[0017]图6为一种典型的半乳糖标准曲线的例子。
【具体实施方式】
[0018]可以使用本发明所述方法进行分析的蛋白质的一个例子是α 1-蛋白酶抑制剂(也称为α 1-抗胰蛋白酶)。α 1-蛋白酶抑制剂是保护细胞免受蛋白酶参与的凝血和炎症的天然存在的丝氨酸蛋白酶抑制剂糖蛋白。缺乏α-l蛋白酶抑制剂，α 1-抗胰蛋白酶缺乏，导致呼吸紊乱例如肺气肿和慢性阻塞性肺疾病(C0PD)。因此，可以使用α-1蛋白酶抑制剂作为一种生物治疗来治疗α -1蛋白酶抑制剂缺乏相关的疾病。重组α -1蛋白酶抑制剂(recAlpha-Ι)是由含有部分或完全由末端唾液酸(N-乙酰氨基酸)加帽的N-连接糖基碳水化合物结构的PerC6细胞系分泌的。末端唾液酸的量的减少已证明recAlpha-Ι的血清半衰期的减少。因此，在研究recAlpha-Ι作为治疗药物的功能或功效时，确定在recAlpha-1中由唾液酸加帽的半乳糖残基的百分比显得尤为重要。
[0019]实施例
[0020]实施例1:用于分析的样品的制备及酶消化
[0021]本实施例提供了一种用于测定糖蛋白的唾液酸含量的方法。该方法开始于用于碳水化合物部分的酶水解的蛋白质样品的制备。因此，该蛋白质必须被带入与酶促反应相容的条件中，包括调整蛋白质浓度，除去溶液组分例如溶解的盐类，缓冲液，其它蛋白质，糖类，赋形剂，等等，这些可能·会干扰酶。如本发明用到的，术语“制备”或短语“制备用于分析的蛋白质”描述了去除可能干扰酶水解的溶液组分和用去离子水稀释蛋白溶液至试验最佳浓度的过程。
[0022]至少有两种非限制性的典型方法可以用于制备来自用于分析的蛋白质的蛋白溶液成分:(1)用去离子水透析或者(2)离心过滤(也称为旋转过滤)。在这两种情况下，特定截留分子量(MWCO)的半透膜被用来除去低分子量物质同时保留目标蛋白分析物。有用的截留分子量范围包括 lkDa，2.5kDa，5kDa，10kDa，20kDa，50kDa，100kDa，250kDa，和 500kDa。在透析过程中，蛋白质被插入到透析膜中并在4°C下用过量的去离子水或合适的缓冲液和/或盐溶液透析至少4小时。
[0023]可替换地，除了透析，蛋白质样品可以通过离心过滤来制备以用于酶消化。在离心过滤时，用特定MWCO的半透膜将蛋白质溶液进行离心分离。分子量低于MWCO的溶液组分在离心过程中通过过滤器，而蛋白和较高分子量的物质被保留。通常情况下，由于水穿过半透膜，蛋白溶液在旋转过滤时得到浓缩。一般来说，作为一个非限制性的例子，在制备蛋白质样品时按照制造商的说明使用一个IOkDa的旋转过滤器。
[0024]在酶消化前，用去离子水将蛋白质样品稀释至1.0-1.5mg/ml的浓度，使得它们在试验的线性范围内。一旦样品被稀释，就确定了用于每个条件的至少一种反应(即，A、B、和C)。将制备的蛋白质溶液分成至少三个样品来进行酶促脱糖基化。参见图1。反应A是背景对照(对照外源性半乳糖)。该反应仅由酶促反应的缓冲液组成，并作为可能存在于包含蛋白质分析物的培养基中的碳水化合物的对照。反应B包含的β-半乳糖苷酶，水解非唾液酸化的碳水化合物基团，但不能水解那些被唾液酸基团“加帽”的碳水化合物基团。反应C同时含有α-唾液酸酶和β-半乳糖苷酶。在该反应中，α-唾液酸酶水解加帽的唾液酸部分，然后允许半乳糖苷酶水解所有的碳水化合物基团。在这个结合了 α-唾液酸酶和β -半乳糖苷酶的反应中，所有的糖基化(即唾液酸化和未唾液酸化的)从蛋白质中除去，而在半乳糖苷酶反应中，只有未加帽(未唾液酸化的)碳水化合物基团被除去。3个反应条件的组分如表1所示。
[0025]
【权利要求】
1.一种用于测定蛋白质的唾液酸含量的方法，其特征在于，该方法包括: (a)制备用于分析的蛋白质； (b)酶处理制备的蛋白质，包括:将制备的蛋白质分成多个蛋白质样品，包括 (i)至少一个蛋白质样品作为培养基样品(反应A)； (ii)在至少一个蛋白质样品中加入至少半乳糖苷酶(反应B)； (iii)在至少另一个蛋白质样品中加入至少半乳糖苷酶和α-唾液酸酶(反应C);并孵育多个蛋白质样品；以及 (c)利用HPAEC-PAD色谱法分析多个蛋白质样品； Cd)测定多个蛋白 质样品的碳水化合物含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，进一步包括: Cf)利用HPAEC-PAD色谱法分析多个阳性和阴性对照； (g)利用HPAEC-PAD色谱法分析多个标准品；以及 (h)将多个蛋白质样品与多个标准品和对照进行比较。
3.用于测定蛋白质的唾液酸含量的HPAEC-PAD色谱法的应用，其特征在于，包括: (a)制备用于分析的蛋白质； (b)酶处理制备的蛋白质，包括:将制备的蛋白质分成多个蛋白质样品，包括 (i)至少一个蛋白质样品作为培养基样品(反应A)； (ii)在至少一个蛋白质样品中加入至少半乳糖苷酶(反应B)； (iii)在至少另一个蛋白质样品中加入至少半乳糖苷酶和α-唾液酸酶(反应C);并孵育多个蛋白质样品；以及 (c)利用HPAEC-PAD色谱法分析多个蛋白质样品； (d)测定多个蛋白质样品的碳水化合物含量；以及 Ce)计算蛋白质的唾液酸化百分比。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，进一步包括: Cf)利用HPAEC-PAD色谱法分析多个阳性和阴性对照； (g)利用HPAEC-PAD色谱法分析多个标准品；以及 (h)将多个蛋白质样品与多个标准品和对照进行比较。
5.一种用于测定任何蛋白质的唾液酸含量的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括: 包括含有预定量的半乳糖苷酶和唾液酸酶的多个容器的至少一个容器； 任选地，容器含有至少一种缓冲液组合物，一种阳性对照样品，一种阴性对照样品，和碳水化合物标准品，以及 记载了用于测定蛋白质的唾液酸含量的方法的说明书，包括如下记载: (a)制备用于分析的蛋白质； (b)酶处理制备的蛋白质，包括:将制备的蛋白质分成多个蛋白质样品，包括 (i)至少一个蛋白质样品作为培养基样品(反应A)； (ii)在至少一个蛋白质样品中加入至少半乳糖苷酶(反应B)； (iii)在至少另一个蛋白质样品中加入至少半乳糖苷酶和α-唾液酸酶(反应C);并孵育多个蛋白质样品；以及 (c)利用HPAEC-PAD色谱法分析多个蛋白质样品；(d)测定多个蛋白质样品的碳水化合物含量；以及Ce)计算蛋白质的唾液酸化百分比。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，进一步包括:Cf)利用HPAEC-PAD色谱法分析阳性和阴性对照；(g)利用HPAEC-PAD色谱法分析多个标准品；以及(h)将多个蛋白质样品的结 果与多个标准品的结果进行比较。
【文档编号】G01N30/02GK103635590SQ201280033128
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年7月5日 优先权日:2011年7月14日
【发明者】王子豪, J·斯隆, K·维 申请人:基立福有限公司