使用荧光标记了的l-葡萄糖衍生物检测癌细胞的方法以及含有该衍生物的癌细胞的显像剂的利记博彩app
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种精度良好地检测癌细胞的方法。本发明的特征在于，使用荧光标记了的L-葡萄糖衍生物进行成像。通过使用本发明的方法和显像剂，与使用荧光标记了的D-葡萄糖衍生物进行成像的情形相比，在癌细胞与正常细胞之间会得到高的对比度。另外，由于诊断时无须进行绝食，所以能够不给患者添加负担地快速实施。
【专利说明】使用荧光标记了的L-葡萄糖衍生物检测癌细胞的方法以及含有该衍生物的癌细胞的显像剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及使用荧光标记了的L-葡萄糖衍生物检测癌细胞或有患癌可能的细胞的方法。本发明还涉及含有荧光标记了的L-葡萄糖衍生物的癌细胞或有患癌可能的细胞的显像剂。
【背景技术】
[0002]精度良好地检测癌对于癌症的发现或治疗是重要的。通常，癌组织并不是显示相同性质的细胞的集合，而是显示多种形态或功能的特征、分化程度的细胞的集合。另外，有时也混合存于在正常细胞中。因此，在癌诊断中，为了确定诊断，进行活检标本的病理诊断，有必要在细胞水平对异常细胞进行评价。但是，在活检标本的病理诊断中，特别越是早期癌症的情形，越可能忽视癌细胞或处于前癌细胞状态的细胞，即，存在错误地诊断为阴性(False Negative,假阴性）的可能性。特别是，当内科诊断时仅取出组织的极少一部分进行活检时，得到这样的假阴性诊断后，随病症的发展如何在开始降低担心的危险性已成为课题。同样的问题在手术后复发的有无的评价中也成为一个大的课题，在面对不断增加的癌症患者的多数临床科室中，需要一种不太依赖主治医师的经验或熟练度而能够可靠诊断的方法。
[0003]活检包括有在外科手术时以确认为目的而进行的情况，在使用内窥镜、支气管镜、放大镜、鼻镜、耳镜等的内科检查时从消化道、气管、膀胱、阴道、其它各种管腔内侧进行的情况，或者在观察部位附近的身体开一个小口并在开口部位插入腹腔镜或胸腔镜等从组织的外侧进行的情况等，但是由于是侵袭性操作，所以任何一种情况中准确选定活检部位成为非常重要的课题。内窥镜检查等中，如果发现显示红肿或糜烂、白色突起、微血管结构异常的区域时，通过与扩大内窥镜并用的异型血管图像的精查等来选定活检部位。但是，因伴随活检会出血，在微小的癌症中，常常如果选错活检部位，则无法识别病变。另一方面，如果在大范围内将与正常无区别的 组织摘出，则侵袭度变高。在癌症的手术中，为了避免复发或再次手术而不必要地将正常部分大范围切除，成为兼顾Q0L(Quality of Life)改善的负面因素。因此，在外科手术中，为了研究摘出范围是否合适，从确实认为含有癌症的部分到距离一定距离的部分进行切除，对切割端进行快速病理诊断，而在手术中会多次重复上述过程。但是，在对切割端进行快速病理诊断，直到得到结果，每次需要数十分钟到I小时的时间，所以这成为缩短手术时间的阻碍因素之一。不仅在手术时，而且对于在内窥镜等检查时进行活检的情形，也在诊断中会对患者造成非常大的负担。因此，为了使检查尽早结束，显示何处应当进行精检、活检的成像法成为医疗现场的切实需要。另外，对于胆管癌、巴雷特食道癌等通过检查而发现的时间已经太晚的情形居多的癌症而言，期待通过早期发现能够改善生存率，这就需要能够准确、简便地发现较小的癌症的成像法。另外，一旦发现患有癌症的情况下，准确判定内腔表层稀薄地存在的癌症扩散到何处而存在（称为侧向进展或水平进展等），有必要进行治疗，但是通过内窥镜以细胞单位进行以上操作，即使是熟练的专家也是困难的（非专利文献I)。
[0004]现在，对于内窥镜而言，为了能够更清楚地捕捉观察癌症的特征，开发了高分辨率内窥镜、利用光的散射?吸收变化的Narrow Band Imaging(NBI)、将细胞的自身荧光(Autofluorescence)成像的内窥镜（AFI)、利用 Optical Coherence Tomography (OCT)这一新原理的内窥镜等。其中，发现NBI的有用性，其得到快速普及。但是，NBI主要是通过将血管像可视化来间接判断癌症的进展的方法，与如上述例示的其它方法相同，不适合于直接观察每一个细胞。另一方面，由于共聚焦内窥镜Confocal Laser Endomicroscopy (非专利文献2)通过将荧光素等荧光分子进行静脉注射，利用组织发出的荧光得到断层像，由此能够观察到每个细胞的形态特征，所以如果灵敏度提高可期待能够将非典型增生、恶性程度的区别在细胞单位进行判定。将其用于手术时也是可能的。但是，由于荧光素等的细胞内摄入并不是癌细胞特异性，因此在从显微镜的视野范围来看可以说广大的组织区域所包含的几乎全部的细胞会发出荧光，如果要以荧光精密观察在内窥镜或其它检查时显示异常的癌细胞，则需要花费大量的时间。因此，需求能够迅速发现癌细胞或处于前癌状态的细胞，也可以识别由炎症等癌症以外的原因引起的细胞异常的适当的造影剂（非专利文献3和非专利文献4)。
[0005]作为能够进行癌症诊断成像的造影剂，目前最多使用的造影剂之一有以18F放射性标记的2-脱氧-D-匍萄糖的衍生物[18F] 2-氟-2-脱氧-D-匍萄糖（FDG),广泛使用将其与阳离子断层法（PET)组合的临床图像诊断（非专利文献5)。FDG法是利用癌细胞与正常细胞相比能够更多地将D-葡萄糖摄入细胞内的性质将癌可视化的方法，但是，在测定方法上存在无法实时连续观察活的单个细胞将D-葡萄糖摄入的情形的缺点（非专利文献6)。这不利于正确诊断显示不同形态、功能、分化程度的而与正常细胞混合存在的癌，例如成为难以早期发现极小的癌细胞分散存在的情况或在消化器官粘膜上稀疏产生的癌的因素之一。另外，由于D-葡萄糖也被正常细胞摄入，所以具有因在癌组织周围存在的或有时在癌组织内存在的正常细胞对FDG的摄取而导致的背景信号会降低SN比这样的原理性问题。另外，在发生炎症的细胞中FDG容易富集，所以难以将其与癌症进行区别。
[0006]另一方面，本发明人等发现由作为荧光基团的7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基(NBD)标记的2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖（2-NBDG)通过哺乳动物细胞的葡萄糖转运体，以具有与放射性标记D-葡萄糖衍生物相当的动力学被摄入细胞内（非专利文献6)。以这些知识为背景，提出使用2-NBDG这类荧光标记了的D-葡萄糖衍生物代替FDG，将癌症在细胞水平进行成像（非专利文献7和专利文献I)。另外，作为对癌组织的活检或手术时摘出的标本使用2-NBDG进行的成像，报告了适用于口腔癌（非专利文献8)、乳腺癌（非专利文献9)以及巴雷特食道癌（非专利文献I)的例子。
[0007]但是，使用2-NBDG进行癌症诊断成像时，由于2-NBDG是D-匍萄糖的衍生物,所以与FDG同样，由正常细胞的摄入引起的背景信号会降低SN比，难以早期发现微小癌症。实际上，D-葡萄糖显示因血糖升高而被脂肪细胞或肌肉大量摄入的性质（非专利文献10)，所以显示与FDG同样的性质。因此，在使用FDG的PET检查中，为了提高SN比，在检查前需要进行长时间的绝食，另外，在事前的FDG摄入时间中（约30分钟~I小时左右）以及测定时间中（20~30分钟左右），需要不使肌肉运动地一动不动（说话也受到限制）。同样地，利用2-NBDG进行的癌症成像也需要绝食等（非专利文献11)。但是，即使进行绝食，也不能完全行抑制荧光标记的D-葡萄糖衍生物被正常细胞摄入，这就需要一种精密度更高的检测方法。最近有报告指出在人组织的活检标本中存在显示较弱的2-NBDG的摄入的轻度非典型增生细胞和较强摄入2-NBDG的高度非典型增生细胞（非专利文献I)，但是由于均摄入2-NBDG，所以两者的区别不得不成为连续的区别。另外，在炎症组织也发现了 2-NBDG的强摄入，使得对癌症的识别成为与FDG-PET法同样的课题（非专利文献I)。因此，不得不承认只要使用荧光标记了的D-葡萄糖衍生物就精度良好地判定是不是肿瘤细胞存在局限。另外，FDG法对糖尿病患者进行诊断是困难的，但是癌症易发年龄和糖尿病发病年龄存在重叠的问题，利用2-NBDG进行成像也同样存在受到制约的可能性。
[0008]另外，最近提出了一种介由连接体将荧光分子团键合到D型或L型葡萄糖I个位点而合成衍生物的方法，适用于正常细胞和特定肿瘤细胞通过荧光进行检测（专利文献3)。然而，专利文献3的实施例中，显示无论在肿瘤细胞和正常细胞中的哪一个，均检测到L型葡萄糖衍生物所致的充分的荧光强度的增加。
[0009]现有技术文献
[0010]专利文献
[0011]专利文献I :美国专利第6989140号说明书
[0012]专利文献2 ：W02010 / 016587公开公报
[0013]专利文献3 :美国专利申请公开第20090317829号公报
[0014]非专利文献
[0015]非专利文献I ：Thekkek et al.，Technol. Cancer Res. Treat. 10 :431-41, 2011
[0016]非专利文献2 ：Hsiung, PL. et al. , Nat. Med. 14 :454-8,2008
[0017]非专利文献3 ：Thekkek&Richards~Korturn, Nat. Rev. Cancer8 :725-31, 2008
[0018]非专利文献4 ：Goetz&ffang. , GastroenterOI. 138 :828-33, 2010
[0019]非专利文献5 Jadvar et al.，J. Neel. Med. 50 :1820-27，2009
[0020]非专利文献6 :Yamada et al.，J. Biol. Chem. 275 :22278-83, 2000
[0021]非专利文献7 :0' Neil et al. , Mol. Imaging Biol. 7 :388-92,2005.
[0022]非专利文献8 ：Nitin et al.，Int. J. Cancerl24 :2634-42, 2009
[0023]非专利文献9 :Langsner et al. , Biomed. Optics Express2 :1514-23, 2011
[0024]非专利文献10 ：Foley et al. , BioChemistry50 :3048-61, 2011
[0025]非专利文献11 :Sheth et al. , J. Biomed. 0pticsl4 :064014, 2009
[0026]非专利文献12 :Thompson RJ. et al.，Science312, 924-927，2006.
[0027]非专利文献13 ：Cheng et al. , Bioconjgate Chem. 17 :662-69, 2006
[0028]非专利文献14 ：Etxeberria et al.，J. Experimental Botany56 :1905-12. 2005
[0029]非专利文献15 ：Yamamoto et al.，Tetrahedron Lett. 49 :6876-78, 2008
[0030]非专利文献16 ：Yamada et al.，Nat. Protoc. 2 :753-762, 2007
【发明内容】
[0031]因此，本发明的目的在于提供通过成像精度良好地检测癌细胞或有患癌可能的细胞的方法以及用于该方法的显像剂。
[0032]鉴于上述问题，本发明人等进行了大量深入研究，结果发现发展的肿瘤细胞（其是指例如，发展到细胞块中大量含有呈现异常细胞核的细胞的程度的阶段的构成肿瘤块的细胞）活跃地将荧光标记了的L-葡萄糖衍生物摄入，从而完成本发明。[0033]本发明是使用分子内具有特定的荧光发色团（7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基）的L-葡萄糖衍生物检测靶细胞是癌细胞或有患癌可能的细胞并进行判定的方法。更具体而言，为如下所述的发明。
[0034](1) 一种检测方法，该方法为检测癌细胞或有患癌可能的细胞的方法，包括以下工序，
[0035]a.使含有L-葡萄糖衍生物的组合物与靶细胞（活体的或从活体分离的细胞或组织中的细胞）接触的工序，所述L-葡萄糖衍生物在分子内具有作为荧光分子团的7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基或其衍生物，以及
[0036]b.检测该靶细胞内存在的该L-葡萄糖衍生物的工序。
[0037](2)如上述（1)所述的检测方法，其中，所述L-匍萄糖衍生物是7_硝基苯并_2_氧杂-I，3-二唑基或其衍生物与L-葡萄糖键合而成的物质或者是与由氨基和/或氟原子取代羟基的L-葡萄糖键合而成的物质。
[0038](3)如上述（2)所述的检测方法，其中，所述L-匍萄糖衍生物是7_硝基苯并_2_氧杂-1，3- 二唑基或其衍生物与L-葡萄糖的2位、4位或6位键合而成的物质或者是与由氨基和/或氟原子取代羟基的L-葡萄糖的2位、4位或6位键合而成的物质。
[0039](4)如上述（3)所述的检测方法，其中，所述L-匍萄糖衍生物是2-[N_(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑-4-基）氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖。
[0040](5)如上述（1)~（4)中任一项所述的检测方法，其中，所述工序a中的检测是通过将靶细胞成像而进行的。
[0041](6)如上述（1)所述的检测方法，其中，所述工序a的组合物进一步含有在分子内具有磺基罗丹明的L-葡萄糖衍生物，且所述工序b为检测在靶细胞中存在的分子内具有作为荧光分子团的7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基或其衍生物的L-葡萄糖衍生物的工序。
[0042](7)如上述（6)所述的检测方法，其中，所述组合物含有2-[N_(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基）氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖以及在2位以磺胺键键合了磺基罗丹明101或磺基罗丹明B的2-氨基-2-脱氧-L-葡萄糖。
[0043](8)如上述（6)或（7)所述的检测方法，其中，所述工序b中的检测是以成像的细胞的荧光色调的经时变化为指标进行的。
[0044](9)如上述（5)~（8)中任一项所述的检测方法，其中，进一步包含以下工序，
[0045]c.以所述荧光色调的变化为基础，判定靶细胞是否是癌细胞或有患癌可能的细胞的工序。
[0046](10)如上述（1)~（9)中任一项所述的检测方法，其中，在30分钟内进行上述全
部工序。
[0047](11)如上述（1)~（4)中任一项所述的检测方法，其中，所述L-葡萄糖衍生物为放射性标记的L-葡萄糖衍生物，且检测靶细胞内部存在的L-葡萄糖衍生物的工序至少包括PET成像。
[0048](12)如上述（1)~（11)中任一项所述的检测方法，其中，所述组合物进一步含有在分子内具有荧光发色团的荧光标记了的D-葡萄糖衍生物。
[0049](13) 一种靶细胞的显像剂，该显像剂是用于通过将荧光标记了的L-葡萄糖衍生物摄入祀细胞（活体细胞、或从活体分离的细胞或组织中的细胞）内而将祀细胞成像的显像剂，该显像剂含有L-葡萄糖衍生物，所述L-葡萄糖衍生物在分子内具有作为荧光分子团的7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基或其衍生物。
[0050](14)如上述（13)所述的显像剂，用于检测癌细胞或有患癌可能的细胞。
[0051](15)如上述（14)所述的显像剂，其中，所述L-葡萄糖衍生物是7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基或其衍生物与L-葡萄糖键合而成的物质或者与由氨基和/或氟原子取代羟基的L-葡萄糖键合而成的物质。
[0052](16)如上述（15)所述的显像剂，其中，所述L-葡萄糖衍生物是7_硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基或其衍生物与L-葡萄糖的2位、4位或6位键合而成的物质或者与由氨基和/或氟原子取代羟基的L-葡萄糖的2位、4位或6位键合而成的物质。
[0053](17)如上述（16)所述的显像剂，其中，所述L-葡萄糖衍生物是2-[N_(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖。
[0054](18)如上述（14)~（17)中任一项所述的显像剂，其中，所述显像剂进一步含有在分子内具有磺基罗丹明的L-葡萄糖衍生物。
[0055](19)如上述（18)所述的显像剂，其中，所述显像剂进一步含有在2位以磺胺键键合了磺基罗丹明101或磺基罗丹明B的2-氨基-2-脱氧-L-葡萄糖。
[0056](20)如上述（13)~（17)中任一项所述的显像剂，其中，所述L-葡萄糖衍生物为放射性标记的L-葡萄糖衍 生物。
[0057](21)如上述（14)~（20)中任一项所述的显像剂，其中，进一步含有在分子内具有荧光发色团的荧光标记了的D-葡萄糖衍生物。
[0058](22) 一种试剂盒，用于检测癌细胞或有患癌可能的细胞，含有上述（14)~（20)中任一项所述的显像剂。
[0059](23) 一种诊断方法，是通过使用上述（I)~（12)中任一项所述的检测方法检测癌细胞或有患癌可能的细胞，从而诊断靶细胞的来源组织为癌或处于前癌状态（即，置之不管早晚成为癌症的可能性高的状态、被诊断为高度非典型增生的状态）。
[0060]本发明能够提供一种能够以高对比度地识别癌细胞或有患癌可能的细胞的方法以及用于该方法的显像剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0061]图I是表示在实施例2中对将肿瘤细胞（C6神经胶质瘤）移植到右后肢根部的皮下的小鼠给予2-NBDLG并每隔I分钟进行成像的结果的照片。箭头表示给予2-NBDLG的时刻。
[0062]图2是表示该实施例中给予2-NBDG并进行成像的结果的照片。箭头表示给予2-NBDG的时刻。
[0063]图3是表示该实施例中分别给予2-NBDLG和2-NBDG后的肿瘤细胞的移植部分（右后肢根部的圆、图表的菱形、Tumor+Glc)和脖子附近背侧脂肪细胞富集的部分（颈部的圆、图形的四角形、BG+Glc)中各自的累积值的经时变化的图表。[0064]图4是实施例3中对由小鼠胰岛瘤细胞（MIN6)构成的肿瘤细胞块给予2-NBDLG并通过实时激光扫描共聚焦显微镜获得的图像。
[0065]图5是实施例4中对由小鼠胰岛瘤细胞（MIN6)构成的肿瘤细胞块给予由100微摩尔2-NBDLG和20微摩尔2-TRLG组成的混合溶液之前通过实时激光扫描共聚焦显微镜获得的图像。
[0066]图6是该实施例中给药结束经过2分钟后获得的图像。
[0067]图7是该实施例中给药结束经过4分钟后获得的图像。
[0068]图8是该实施例中给药结束经过2分钟后的绿色通道图像、红色通道图像以及DIC图像重叠而成的图像。
[0069]图9是该实施例中给药结束经过4分钟后的绿色通道图像、红色通道图像以及DIC图像重叠而成的图像。
[0070]图10是观察抑制剂对2-NBDG和2-NBDLG向小鼠胰岛瘤（MIN6)细胞内的摄入的影响的结果。
[0071]图11是实施例6中对由小鼠胰岛瘤细胞（MIN6)构成的肿瘤细胞块给予由100微摩尔2-NBDLG和20微摩尔2-TRLG组成的混合溶液之前通过实时激光扫描共聚焦显微镜获得的图像。
[0072]图12是该实施例中给药时获得的图像。
[0073]图13是该实施例中给药结束经过2分钟后获得的图像。
[0074]图14是该实施例中给药结束经过10分钟后获得的图像。
[0075]图15是该实施例中给药结束经过22分钟后获得的图像。
【具体实施方式】
[0076]本发明是使用荧光标记了的L-葡萄糖衍生物检测癌细胞或有患癌可能的细胞的方法以及用于该方法的显像剂。根据本发明，以含有有效量的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物（分子内具有作为荧光分子团的7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基或其衍生物的L-葡萄糖衍生物）的组合物（以下有时称为“本发明的组合物”或“本发明的显像剂”）作为试剂，通过与靶细胞进行接触，能够判定靶细胞是不是癌细胞（或有患癌可能的细胞）。根据本发明，另外通过使本发明的组合物与含有靶细胞的组织进行接触并进行成像，能够检测组织中的癌细胞或有患癌可能的细胞。根据本发明，进一步通过将本发明的组合物给予活体并进行成像，能够检测癌细胞（或有患癌可能的细胞）或含有这些细胞的组织，该方法作为检测癌症的方法是有用的。荧光标记了的L-葡萄糖衍生物，除了巨噬细胞或小胶质细胞这类发挥吞噬作用的特殊细胞以外，在正常细胞中，例如给药开始后20分钟以内的短时间内没有被摄入或即使摄入也是极少的，因此，根据本发明可以在短时间（例如，给药开始后15分钟以内等）实施成像，而且在癌细胞或有患癌可能的细胞、与正常细胞或构成并没有发展到核中出现异常的肿瘤细胞块的细胞之间能够得到高的对比度。
[0077]给予荧光标记的D-葡萄糖时，以降低向脂肪细胞或肌肉的摄取为目的，在给予前通常进行绝食，但是一旦进行绝食，半通道（gap junction / hemichannel)会打开,会引起介由半通道的D-葡萄糖的摄入，存在因脏器的不同导致对比度出现降低的可能性（非专利文献12)。另外，绝食时，肌肉、肝脏、胰脏、肾脏等的正常细胞会启动自噬（Autophagy)。所谓自噬是指正常细胞将其自身消化的现象，如果多种细胞产生自噬，则不能否定伴随自噬荧光标记了的D-葡萄糖衍生物被癌细胞以外的正常细胞非特异性摄入的可能性。这样进行绝食有时成为对利用成像确定癌细胞的负面效应。即使在体外适用于活细胞的评价时，不添加葡萄糖这样的能够成为能源的糖类而将细胞维持一定的时间，也有可能发生同样的非特异性摄入。另外，将D-葡萄糖或D-葡萄糖与荧光基团结合的衍生物与正常细胞长时间（具体为30分钟以上）持续接触，则有可能出现这些衍生物与存在于正常细胞细胞膜的葡萄糖转运体或葡萄糖受体等膜蛋白结合地移动到细胞内的现象（internalization)(非专利文献13)或发生非特异性内吞（非专利文献14)。与此相对，本发明在活体不进行绝食情况下短时间（例如，给药开始后15分钟以内等）内就能够实施成像，根据本发明，与使用标记了的D-葡萄糖衍生物进行成像的情形相比，在癌细胞（或有患癌可能的细胞）与正常细胞之间能够得到高对比度。另外，由于在检测?判定时没有进行绝食的必要，所以不会给患者强加负担，且能够立即实施检查。
[0078]本说明书中所谓的“癌细胞或有患癌可能的细胞”是指，显示细胞形态异常（结构异型）的细胞、或这类细胞与构成肿瘤块的细胞、显示核形态异常（核异型）或核分裂异常的细胞、或发展为这类细胞的可能性高的细胞，通常是指被分类为恶性肿瘤诊断为癌症的细胞或构成这样的细胞集团的细胞，或发展为这样的细胞集团的可能性高的细胞。
[0079]尽管不是癌细胞但具有通过吞噬作用等非特异性地将本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物摄入细胞内的可能性的细胞、例如巨噬细胞或小胶质细胞等细胞也存在于活体内。尽管这些细胞不是癌细胞（或有患癌可能的细胞）或细胞膜不发生破裂，但是仍存在摄入荧光标记了的L-葡萄糖衍生物的可能性。这些细胞除了通过形态进行识别之外，同时给予2-TRLG时将其摄入细胞内或使用特异标记物例如CD14、CDllb，在本发明的方法中判定为拟阳性之后，也能够确定这些细胞的种类。
[0080]本发明的方法中能判定的癌细胞的种类无特别限制，例如可例举出眼睑或泪腺等眼科领域的癌、外耳或中耳等耳的癌、鼻腔或副鼻窦等鼻癌、肺癌、口腔内癌、喉头癌、咽喉癌、食管癌、胃癌、小肠、大肠癌等消化器官癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、输卵管癌等妇科领域的癌症、生殖器癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、肛门癌、皮肤癌、骨癌、肌肉癌（肉瘤）、白血病等血液癌、恶性淋巴瘤、末梢及中枢神经的癌、以及胶质的癌等的癌细胞。
[0081]作为本发明中使用的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物，可例举为分子内具有7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基（NBD)及其衍生物的L-葡萄糖衍生物。L-葡萄糖衍生物中与NBD键合的位置无特别限制，具体可例举为L-葡萄糖的I位、2位、3位、4位或6位，优选为2位、4位或6位，更优选为2位或6位，最优选为2位。另外，NBD与L-葡萄糖的键合可以是介由胺直接键合，也可以是介由间隔基团（7~一寸一）例如-NH-(CH2)n-NH-(此处，η为2~20，优选为2~10，亚甲基的一部分也可以被0、NH、S、或C=O取代）进行键合。分子内具有发出绿色荧光的7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基及其衍生物的L-葡萄糖衍生物的荧光最大波长在530~580nm左右。
[0082]本发明中使用的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物是指，键合有荧光发色团的L-葡萄糖或其衍生物（由氨基和/或氟原子取代羟基的L-葡萄糖等），也可以是盐酸盐这类盐的形式。另外，本发明中7-硝基苯并-2-氧杂-I，3-二唑基及其衍生物是指包含在7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基基础上在不损害荧光特性的范围内添加或变更取代基而成的物质，例如可例举为7- (N, N- 二甲基氨基磺酰基）-2-氧杂-I，3- 二唑基（DBD基）。
[0083]能够用于本发明的荧光标记了的L-葡萄糖衍生物具体为分子内具有发出绿色荧光的7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑基的L-葡萄糖衍生物（最大荧光波长为530nm~580nm左右），例如可例举为2-[N-(7-硝基苯并_2_氧杂-1，3- 二唑-4-基）氨基]_2_脱氧-L-葡萄糖（2-NBDLG)、4-脱氧-4-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基）氨基]-L-葡萄糖（4-NBDLG)或6-脱氧_[N_(7_硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基）氨基]-L-葡萄糖出-NBDLG)等。另外，分子内具有作为NBD衍生物的发出黄色~费绿色荧光的（N，N-二甲基氨基磺酰基）苯并-2-氧杂-1，3-二唑基的L-葡萄糖衍生物，例如可例举为2-脱氧-2-[N-7-(N’，N’ - 二甲基氨基磺酰基）苯并-2-氧杂-I，3-二唑-4-基）氨基]-L-葡萄糖（2-DBDLG)等。
[0084]这些化合物中的几个记载于与本发明人等先期的研究成果相关的W02010 /016587公开公报中（专利文献2)。其中2-NBDLG与以下所示的2-NBDG(2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-I，3-二唑-4-基）氨基]-2-脱氧-D-葡萄糖）成镜像异构体的关系，认为其不会通过葡萄糖转运体GLUT (非专利文献15、专利文献2)。2-NBDG是为了进行活体哺乳动物细胞的D-葡萄糖动态的摄入过程的研究而本发明人等提出的化合物，现在，在该研究领域内已经达到不可或缺的地位（非专利文献16)。在专利文献2中提出的D-葡萄糖向细胞内的特异性摄入的评价方法中，2-NBDG也作为荧光标记了的D-葡萄糖衍生物而使用。
[0085]
【权利要求】
1.一种检测方法，该方法为检测癌细胞或有患癌可能的细胞的方法，包括以下工序， a.使含有L-葡萄糖衍生物的组合物与靶细胞接触的工序，所述L-葡萄糖衍生物在分子内具有7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基或其衍生物作为荧光分子团，以及 b.检测该靶细胞内存在的该L-葡萄糖衍生物的工序。
2.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述L-葡萄糖衍生物是7-硝基苯并-2-氧杂-I，3-二唑基或其衍生物与L-葡萄糖键合而成的物质或者是与由氨基和/或氟原子取代羟基而得的L-葡萄糖键合而成的物质。
3.如权利要求2所述的癌细胞检测方法，其中，所述L-葡萄糖衍生物是7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基或其衍生物与L-葡萄糖的2位、4位或6位键合而成的物质或者是与由氨基和/或氟原子取代羟基而得的L-葡萄糖的2位、4位或6位键合而成的物质。
4.如权利要求3所述的癌细胞检测方法，其中，所述L-匍萄糖衍生物是2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-I，3- 二唑-4-基）氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖。
5.如权利要求1~4中任一项所述的检测方法，其中，所述工序a中的检测是通过将靶细胞成像而进行的。
6.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述工序a的组合物进一步含有在分子内具有磺基罗丹明的L-葡萄糖衍生物，且所述工序b为检测在靶细胞中存在的分子内具有作为荧光分子团的7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基或其衍生物的L-葡萄糖衍生物的工序。
7.如权利要求6所述的检测方法，其中，所述组合物含有2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-I，3- 二唑-4-基）氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖以及在2位以磺胺键键合了磺基罗丹明101或磺基罗丹明B的2-氨基-2-脱氧-L-葡萄糖。
8.如权利要求6或7所述的检测方法，其中，所述工序b中的检测是以成像的细胞的荧光色调的经时变化为指标进行的。
9.如权利要求5~8中任一项所述的检测方法，其中，进一步包含以下工序， c.以所述荧光色调的变化为基础，判定靶细胞是癌细胞或是损伤细胞的工序。
10.如权利要求1~9中任一项所述的检测方法，其中，在30分钟内进行所述全部工序。
11.如权利要求1~4中任一项所述的检测方法，其中，所述L-葡萄糖衍生物为放射性标记的L-葡萄糖衍生物，且检测靶细胞内部存在的L-葡萄糖衍生物的工序至少包括PET成像。
12.如权利要求1~11中任一项所述的检测方法，其中，所述组合物进一步含有在分子内具有荧光发色团的荧光标记了的D-葡萄糖衍生物。
13.—种靶细胞的显像剂，该显像剂是用于通过将标记的L-葡萄糖衍生物摄入靶细胞内而将靶细胞成像的显像剂，该显像剂含有L-葡萄糖衍生物，所述L-葡萄糖衍生物在分子内具有作为荧光分子团的7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基或其衍生物。
14.如权利要求13所述的显像剂，用于检测癌细胞。
15.如权利要求14所述的显像剂，其中，所述L-葡萄糖衍生物是7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基或其衍生物与L-葡萄糖键合而成的物质或者与由氨基和/或氟原子取代羟基而得的L-葡萄糖键合而成的物质。
16.如权利要求15所述的显像剂，其中，所述L-葡萄糖衍生物是7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑基或其衍生物与L-葡萄糖的2位、4位或6位键合而成的物质或者与由氨基和/或氟原子取代羟基而得的L-葡萄糖的2位、4位或6位键合而成的物质。
17.如权利要求16所述的显像剂，其中，所述L-葡萄糖衍生物是2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-I，3- 二唑-4-基）氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖。
18.如权利要求14~17中任一项所述的显像剂，其中，所述显像剂进一步含有在分子内具有磺基罗丹明的L-葡萄糖衍生物。
19.如权利要求18所述的显像剂，其中，所述显像剂进一步含有在2位以磺胺键键合了磺基罗丹明101或磺基罗丹明B的2-氨基-2-脱氧-L-葡萄糖。
20.如权利要求13~17中任一项所述的显像剂，其中，所述L-葡萄糖衍生物为放射性标记的L-葡萄糖衍生物。
21.如权利要求14~20中任一项所述的显像剂，其中，进一步含有在分子内具有荧光发色团的荧光标记了的D-葡萄糖衍生物。
22.—种试剂盒，用于检测癌细胞，含有权利要求14~20中任一项所述的显像剂。
23.—种诊断方法，是通过采用权利要求1~12中任一项所述的检测方法检测癌细胞，从而诊断靶细胞的来源组织是癌。`
【文档编号】G01N33/48GK103502465SQ201280015126
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年3月29日 优先权日:2011年3月31日
【发明者】山田胜也, 尾上浩隆, 丰岛正, 山本敏弘 申请人:国立大学法人弘前大学, 多肽研究所公司