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【专利摘要】本发明涉及新的诊断测定以诊断淀粉状变性，特别是阿尔兹海默病，及涉及相关方面。本发明特别提供了单克隆抗体和抗体测定。
【专利说明】诊断性抗体测定
[0001]本发明涉及新的诊断测定及相关方面，所述测定用于诊断淀粉状变性(amyloidosis),这是一组与淀粉样蛋白相关的失调和异常,如阿尔兹海默病(Alzheimer’sdisease)。本发明特别提供了抗体测定。
[0002]淀粉状变性不是一个单一疾病，而是一组不同的进行性疾病，特征在于蜡样、淀粉样蛋白质(称作淀粉样蛋白)的胞外组织沉积，其在一或多个器官或身体系统中积聚。随着淀粉样沉积物的积聚，其开始干扰器官或身体系统的正常功能。有至少15种不同类型的淀粉状变性。主要形式是无已知先例(antecedent)的原发淀粉状变性，在一些其它病症之后发生的继发淀粉状变性，以及遗传性淀粉状变性。
[0003]继发淀粉状变性发生在慢性感染或炎症疾病期间，如肺结核，称作家族性地中海发热的细菌感染、骨感染(骨髓炎)、类风湿性关节炎、小肠炎症(肉芽肿性回肠炎)、霍奇金病和麻风病。
[0004]淀粉样沉积物包括淀粉样蛋白P (五角形)成分(AP)，其是与正常血清淀粉样蛋白P(SAP)相关的糖蛋白，及硫酸化粘多糖(GAG)，其是结缔组织的复杂碳水化合物。淀粉样蛋白质原纤维，其占淀粉样物质的大约90%，包含一些不同类型的蛋白质之一。这些蛋白质能折叠成所谓的“β_折叠”原纤维，这是一种独特的蛋白质构型，呈现出刚果红结合位点，导致所述淀粉样蛋白质的独特的染色性质。
[0005]许多老年性疾病基于淀粉样蛋白质或者与其相关，其特征部分在于导致发病以及疾病的进展的淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样材料的胞外沉积。这些疾病包括但不限于神经失调如轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)或者家族性阿尔兹海默痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性，路易体痴呆(Lewy body dementia),与淀粉状蛋白相关遗传性脑出血(荷兰型)；Guam Parkinson-Dementia综合征。基于淀粉样蛋白质或与其相关的其它疾病是进行性核上性麻痹，多发性硬化症；海绵状脑病，帕金森氏症，HIV-相关的痴呆，ALS (肌肉萎缩性侧索硬化症)，成人型糖尿病；老年性心脏淀粉状变性；内分泌性肿瘤等,包括黄斑变性。
[0006]尽管这些疾病的发病机制可以不同，但是其特征性沉积物通常含有许多共有的分子成分。在明显程度上，这可归因于促炎途径的局部激活，从而导致激活的补体成分、急性期反应物、免疫调节物及其它炎症中介物的同时沉积(McGeer et al.，Tohoku J ExpMed.174 (3): 269-277 (1994))。
[0007]近年来，越来越多的迹象证实阿尔兹海默病中N-末端修饰的A β肽变体的参与作用。针对性的活组织检查显示Αβ 1-40和Αβ 1-42不仅存在于阿尔兹海默病患者的脑中，也存在于未受影响的个体的衰老斑中。然而，N-末端截短的和焦谷氨酸(pyroGlu)修饰的A β Ν3ρΕ-40/Α β Ν3ρΕ_42几乎唯一存在于阿尔兹海默病患者的斑内，使得这种A β变体成为合适的诊断标记和药物开发的潜在目标。
[0008]目前，一些商业生产者提供了ELISA试剂盒，可以在较低的皮克(pg)范围检测A β 1-40/1-42 和 A β Ν3ρΕ-40/Α β Ν3ρΕ_42。
[0009]阿尔兹海默病(AD)患者的脑部的形态学特征是存在神经原纤维缠结及新皮质脑结构中 Αβ 月太的沉积(Selkoe，D.J.& Schenk，D.Alzheimer’s disease:molecularunderstanding predicts amyloid-based therapeutics.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.43, 545-584 (2003)) ο Αβ肽在β-和Y -分泌酶相继裂解之后从淀粉样前体蛋白(APP)中释放。Y-分泌酶裂解导致Αβ 1-40和Αβ 1-42肽产生，它们在C-末端不同并呈现出不同的聚集、原纤维形成和神经毒性潜力(Shin，R.W.etal.Amyloid beta-protein (Abeta)l_40but not Abeta1-42contributes to theexperimental formation of Alzheimer disease amyloid fibrils in rat brain.J.Neurosc1.17，8187-8193 (1997) ；Iwatsuboj T.et al.Visualization of Abeta42 (43)and Abeta40in senile plaques with end-specific Abeta monoclonals: evidencethat an initially deposited species is Abeta42 (43).Neuronl3，45-53(1994)；Iwatsubo，T.，Mann,D.M.，Odaka，A.，Suzuki ,N.& Ihara，Y.Amyloid betaprotein (Abeta) deposition: Abeta42(43)precedes Abeta 40in Down syndrome.Ann.Neurol.37，294-299(1995) ;Hardy，J.A.& Higgins,G.A.Alzheimer’s disease: theamyloid cascade hypothesis.Science256，184-185(1992) ;Ro β ner，S.，Ueberham，IL，Schliebs, R., Perez-Poloj J.R.& Biglj V.The regulation of amyloid precursor proteinmetabolism by cholinergic mechanisms and neurotrophin receptor signaling.Prog.Neurobiol.56，541-569(1998)).[0010]弥漫性斑中沉积的大多数Αβ肽是N-末端截短的或者修饰的。Piccini和Saido的研究显示出衰老斑和血管沉积物的核心结构由50%焦谷氨酸(pyroGlu)修饰的肽组成(Piccini et al., J Biol Chem.20050ct7; 280 (40):34186-92 ；Saido etal., Neuron.1995Feb ；14(2):457-66)。焦谷氨酸修饰的肽比其它A β种类具有更强的细胞毒性，并且对氨基妝酶是稳定的(Russo et al., J Neurochem.2002Sep; 82 (6): 1480-9)。因此，焦谷氨酸A β具有较长的半衰期，从而这些物质的累积及神经毒性寡聚体的形成和聚集是有益的(Saido, Neurobiol Aging.1998Jan_Feb; 19 (ISuppl): S69-75)。由于谷氨酸环化为焦谷氨酸，带电荷的氨基酸丧失，这样显著降低了肽的溶解性并且导致聚集倾向增加。体外研究表明与未修饰的肽相比，例如Αβ 3(pE)的初始寡聚化更快速(Schilling et al.,Biochemistry.20060ctl7;45(41):12393-9)。
[0011]由本发明人进行的研究示出Αβ 11(ρΕ)与Αβ3(ρΕ)相比具有较高的聚集潜力和更低的溶解性。 Naslund J.等研究小组(Proc.Natl.Acad.Sc1.Neurobiology, Vol.91pp.8378-8382)通过质谱分析检测了散发性AD患者脑中大多数著名的截短的变体A β ρΕ (11-42)。迄今为止，NIslund J.等的研究是检验斑块中A β 11(ρΕ)沉积的几个研究之一。
[0012]所有事实均提示焦谷氨酸Αβ是起始原纤维形成的一种起源。在新近的研究中(Piccini et al.，2005，supra),具有斑块沉积但无AD特异性病变的志愿者由于A β物种的特征性量而可以与AD患者区分开。从而N-末端截短的焦谷氨酸修饰的肽的量显著高于AD患者脑中的相应量。
[0013]在Αβ肽的位置3或11的焦谷氨酸翻译后形成意味着N-末端谷氨酸残基的环化。谷氨酰胺酰基环化酶(QC)在焦谷氨酸肽的产生中起重要作用。QC广泛分布于植物和动物界及其它事物中，参与肽激素的成熟。通过氨的释放而使谷氨酰胺环化及通过水的释放使谷氨酸环化为焦谷氨酸均是通过QC进行的。与谷氨酰胺环化相反，谷氨酸环化不是自发发生的。QC催化有效的(不希望的)从谷氨酸至焦谷氨酸的副反应。产生的焦谷氨酸残基保护蛋白质免于蛋白酶降解。有一些参考文献示出QC在焦谷氨酸Aβ的产生中起重要作用:
[0014]1.在一些研究中，示出QC在Αβ的N末端催化从谷氨酸形成焦谷氨酸残基(Cyniset al., Biochim Biophys Acta.20060ct;1764(10):1618-25, Schilling et al.,FEBSLett.2004Apr9;563(1-3):191-6)；
[0015]2.Αβ肽和QC在海马和皮质中均大量表达。这些脑部区域在AD中特别危险(Pohl et al., Proc Natl Acad Sci U S A.1991Novl5;88(22):10059-63, Selkoe, PhysiolRev.2001Apr;81(2):741-66)；
[0016]3.APP在转运至质膜期间被β -分泌酶裂解，从而可以产生具有游离谷氛酸残基的 Αβ 的 N 末端(Greenfield et al., Proc Natl Acad Sci U SA.1999Janl9;96(2):742-7)。在分泌小泡中，确定了加工的APP和QC的共定位。因此在小泡的轻度酸性环境中，可以发生加速谷氨酸残基修饰为焦谷氨酸。
[0017]4.其它神经变性疾病(家族性丹麦型(FDD)或英国型痴呆(FBD))也与N-末端焦谷氨酸修饰的肽如Bri2相关，但是相反其与A β在一级结构方面不相关(Vidal R.etal., 1999Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.97, 4920-4925)。
[0018]可能的是QC-催化的焦谷氨酸Aβ形成参与神经变性疾病的发生和进展。N-末端修饰的淀粉样肽的形成无疑代表了在Aβ聚集过程中的一个基本因素，及可以是疾病发病因素。通过抑制QC而阻抑焦 谷氨酸A β形成可以代表一种治疗方法。QC抑制剂能阻止焦谷氨酸Αβ形成，降低脑中焦谷氨酸A β浓度，因此延缓Αβ-肽的寡聚化。Schilling etal.示出QC表达在AD患者皮质中是被正调节的，及与焦谷氨酸-修饰的Αβ-肽的存在相关。在两个不同的AD转基因小鼠模型及在一个新的果蝇(Drosophila)模型中QC抑制剂的口服应用导致降低的焦谷氨酸修饰的A βρΕ (3-42)水平(Schilling et al., 2008Biol.Chem.(389), 983-991)。
[0019]路易体痴呆(LBD)是一种神经变性疾病，可发生在65岁以上年龄的人，典型导致认知(思维)损伤和异常的行为改变。症状可包括认知损伤神经迹象，睡眠失调和自主神经衰竭。认知损伤在大多数案例中是LBD的当前特征。患者具有进行性恶化的复发的混乱的经历。认知能力的波动通常与注意力和警觉力(alertness)的转移程度相关。认知损伤和思维波动可以在几分钟、几小时或者几天内变化。路易体是从磷酸化和非磷酸化神经丝蛋白中形成的；其含有突触蛋白α-突触核蛋白以及遍在蛋白，其参与损害的或异常的蛋白质的除去。除了路易体之外，也可以存在是神经细胞的细胞过程(cell processes)中的包涵体的Lewy神经突。淀粉样斑块可以在DLB患者脑中形成，然而其与阿尔兹海默病患者中可见数目相比趋于较少。神经原纤维缠结，AD的其它微病理学(micropathological)特点，不是LBD的主要特征，但是除了淀粉样斑块之外也是经常存在的。
[0020]肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)特征在于上和下运动神经元的变性。在一些ALS患者中，可以存在痴呆和失语症(ALS-D)。痴呆是最常见的额颞区(FTD)，许多这样的病例在齿状回和额叶和颞叶的表层的神经元中具有遍在蛋白阳性的、tau-阴性的包涵体。
[0021]包涵体肌炎(IBM)是一种严重损害身体的疾病，通常见于50岁以上的人，其中肌纤维发生炎症并开始萎缩，但是脑部除外(spared)，患者保留其全部智力。发现参与淀粉样_β蛋白产生的两种酶在老年人中具有这种最常见的进行性肌病患者的肌细胞内部增加，其中淀粉样_β蛋白也增加。
[0022]基于或与淀粉样蛋白质的累积和沉积相关的另一疾病是黄斑变性。黄斑变性是一种常见的眼病，导致黄斑退化，黄斑是视网膜的中心区域(在眼后面的极薄组织，于此处光敏性细胞输送视觉信号至脑)。敏锐的、明亮的、“前向的(straight ahead)”视觉由黄斑加工。黄斑损害导致盲点产生及模糊或扭曲的视觉。年龄相关的黄斑变性(AMD)在美国是导致视觉损害的主要因素，对于白种人超过65岁的人是导致法定盲的因素。大约1.8百万的40岁及以上的美国人具有行进性AMD，另有7.3百万人具有中间状态AMD，处于视觉丧失的实际危险中。政府预计在2020年将有2.9百万人患有先进性AMD。AMD的受害者通常惊讶及失望地发现关于这种失明状况的原因和治疗知道的很少。
[0023]有两种形式的黄斑变性:干性黄斑变性和湿性黄斑变性。干性形式其中黄斑细胞缓慢开始损坏，在85%的黄斑变性病例中诊断。两眼通常均受干性AMD影响，但是一只眼可丧失视觉，而另 一只眼保持不受影响。玻璃膜疣，是在视网膜下的黄色沉积物，是干性AMD的常见早期迹象。发生进行性干性AMD或湿性AMD的危险随着玻璃膜疣的数目或大小增加而增加。对于干性AMD可能的是进行性及导致视觉丧失，而不转变为湿性形式AMD ;然而，也可能的是早期干性AMD突然转变为湿性形式。
[0024]湿性形式尽管仅占该病例的15%，但是导致90%的失明，被认为是进行性AMD (湿性AMD没有早期或中间阶段)。湿性AMD总是由该病的干性形式领先。随着干性形式恶化，一些人开始在黄斑后面具有异常的血管生长。这些血管非常脆弱，易渗液和出血(因此为“湿性”黄斑变性)，导致黄斑迅速损害。
[0025]干性AMD最初通常导致轻微的视力模糊。特别是视觉中心然后可变的模糊，这个区域随着疾病进展而扩大。如果只是一只眼受影响可无症状。在湿性AMD中，直线可出现波纹，可以迅速发生中心视力丧失。
[0026]黄斑变性的诊断典型包括散瞳检查，视敏度检测，及使用称作眼底镜检查的程序观察眼后面，以帮助诊断AMD，以及如果怀疑是湿性AMD，也可以进行荧光素血管造影术。如果干性AMD达到进展阶段，目前还没有治疗方法可以阻止视力丧失。然而，特定的高剂量抗氧化剂和锌配制物可延缓或阻止中间AMD免于进展为晚期阶段。Macugen? (pegaptanibsodium注射液)、激光凝固和光动力学治疗可控制黄斑内异常血管生长和出血，这可有助于患有湿性AMD的一些人；然而，这些技术不能恢复已经丧失的视力。如果视力已经丧失，低视力辅助存在可帮助改善生存质量。
[0027]年龄相关的黄斑变性(AMD)的最早的迹象之一是视网膜色素上皮(RPE)的基底层与Bruch’s膜(BM)之间的称作玻璃膜抚的胞外沉积物累积。由Anderson等进行的最近的研究证实玻璃膜疣含有淀粉样蛋白(Experimental Eye Research78 (2004) 243-256)。
[0028]本发明的目的是建立高敏性同时有力的检测技术，使得可以在生物样品如液体(liquor)或血清样品、优选血清样品中定量测定Αβ变体，特别是Αβ pGlu(ll-X)肽。这是一个极大的挑战，考虑到血液中低丰度的A β肽。然而，可利用这种检测技术的先决条件是在药物筛选程序中研究小分子抑制剂的效力。
[0029]本发明提供了新的方法和组合物，所述组合物包含高特异性和高有效性的抗体，包括嵌合抗体及其片段，包括部分或完全人源化抗体及其片段，所述抗体具有特异性识别及结合一系列β_淀粉样抗原、特别是Ai3pGlu(ll-X)肽的特定表位的能力，所述肽可以单体、二聚体、三聚体等或多聚体形式、以聚集体、纤维、细丝形式或者以斑块浓缩形式呈递给所述抗体。通过本发明教导可提供的抗体特别可用于诊断淀粉状变性，这是与淀粉样斑块形成相关的一组疾病或失调，包括继发淀粉状变性和年龄相关的淀粉状变性，包括但不限于神经失调如阿尔兹海默病(AD),路易体痴呆(Lewy body dementia),唐氏综合征,遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆综合征(Guam Parkinson-Dementiacomplex);以及基于或与淀粉样蛋白相关的其它疾病，如进行性核上性麻痹，多发性硬化症；CreutZfeld Jacob病，遗传性脑出血伴淀粉状变性荷兰型，帕金森氏症，HIV-相关的痴呆，ALS (肌萎缩性脊髓侧索硬化症)，成人型糖尿病；老年心脏淀粉状变性；内分泌性肿瘤，等等，包括黄斑变性，只是列举了一小部分。
[0030]发明概述
[0031]本发明特别涉及抗体或其变体,特征在于其以高亲和性结合APpGlu(ll-x)肽。所述高亲和性在本发明中是指亲和性Kd值为10_7M或更好，优选10_8M或更好，更优选Kd值为 KT9M 至 I (T12M。
[0032]特别地，所述抗体优选是单克隆抗体，选自Αβ 13-11-6，在后文称作克隆13。
[0033]本发明的抗体可特别用于诊断方法中以检测淀粉状变性，特别是阿尔兹海默病。
[0034]附图描述
[0035]图1:抗A β 11 ( ρΕ)抗体的筛选
[0036]分析在细胞融合及HAT培养基选择之后的26个杂交瘤细胞上清。针对部分含有EVHH序列的不同的经修饰Αβ肽来测试mAb。灰色标记的肽Aβ ρΕ(11-23)(见斑点10)含有在N末端具有焦谷氨酸的靶序列(pEVHH)。每个膜均用肽1-16点印。选择框起的膜(framed membranes)的杂交瘤细胞(n=9)用于再克隆。在再克隆后只有实线框内的膜的细胞是稳定的。
[0037]图2:用 Αβ (ρΕ11-30)包被 CM5 芯片
[0038]传感器芯片表面用EDC/NHS以10 μ I/分钟激活8分钟。使用如下材料进行通过胺偶联的配体固定化:Α)10μ g/ml Αβ (ρΕ11-30)于 IOmM KH2PO4, pH6 中；Β)50μ g/mlΑβ (ρΕ11-30)于IOmM乙酸钠，pH5中。以10 μ I/分钟速度注射肽5分钟(A)和20分钟(B)。然后，将反应基团(游离酯)用IM乙醇胺ρΗ8.5以10 μ I/分钟速度失活10分钟。未固定化的肽通过注射0.1MHCl (3 X 10 μ I)除去，然后将芯片用运行缓冲液漂洗过夜。最终，信号为1000RU。配体固定化在Biacore3000进行。
[0039]图3:抗A β 11 (ρΕ)抗体的SPR测量
[0040]通过Biacore3000分析来自克隆13的杂交瘤细胞培养上清。使用具有固定化的Αβ (ρΕ11-30)的CM5芯片，信号为1000RU(流动池4)。示出的是Αβ (ρΕ11-30)随着时间的实时结合图。样品在运行缓冲液中以1:100稀释，使用30 μ I/分钟速度在300秒内期间注射，记录300秒解离时间。来自未包被的流动池的信号从在具有固定化Αβ的流动池4中测量的信号中减去。
[0041]图4:抗Αβ 11(ρΕ)抗体的曲线
[0042]在Biacore3000通过SPR测量浓度为0.04-10 μ g/ml的纯化的抗体。曲线的线性范围是从0.040 μ g/ml直至1.25 μ g/ml抗体。抗体在运行缓冲液中稀释，以30 μ I/分钟速度在300秒期间注射。从解离期末选择SPR信号。来自未包被的流动池的信号从在具有Αβ的流动池测量的信号中减去。
[0043]图5:抗Αβ 11(ρΕ)抗体的标准曲线
[0044]在Biacore3000通过SPR测量已知浓度的纯化抗体。抗体的浓度范围是从0.040直至1.25 μ g/ml抗体。线性回归等式:y=3033.7x+50.099 (R2=0.991)。每个SPR信号从解离期末选择。来自未包被的流动池的信号从在具有固定化Αβ的流动池测量的信号中减去。
[0045]图6:细胞数和产生抗A β 11(ρΕ)抗体浓度的对比
[0046]在含有血清的培养基和无血清培养基(杂交瘤SFM)中于37°C和5%C02条件下培养的克隆13的杂交瘤细胞(细胞传代19代)，在使用前直接补加2mM L-谷氨酰胺和50 μ Μβ-巯基乙醇。将细胞在摇瓶中培养大约10天，定期取样以通过SPR确定细胞生长(A)和抗体浓度⑶。
[0047]图7:依赖于培养时间的比生长速率μ
[0048]在含有血清的培养基中和无血清培养基(杂交瘤SFM)中于37°C和5%C02条件下培养的克隆13的杂交瘤细胞(细胞传代19代)，在使用前直接补加2mM L-谷氨酰胺和50 μ Μβ -巯基乙醇。数据基于在摇瓶中培养10天的生长曲线。
[0049]图8:抗Αβ 11 (ρΕ)的浓度针对存活细胞的积分(integral)绘图
[0050]将克隆13的杂交瘤细胞(细胞传代19代)在含有血清的培养基中和无血清培养基(杂交瘤SFM)中在37° C和5%C02条件下培养，培养基中补加了 2mM L-谷氨酰胺和50 μ Μβ-巯基乙醇。数据基于在摇瓶中生长10天的生长曲线。存活细胞的积分得自依赖于时间的细胞数图，从而在5、24、48、72小时的数据点被积分(integrated)。抗体生产率得自曲线斜率(见线性函数)。R2=确定系数(coefficient of determination)。
[0051]图9:抗Αβ 11(ρΕ)纯化的层析图
[0052]在AktaTMPurifier上使用蛋白G HP柱(V=5ml)纯化1800ml杂交瘤(克隆
13)细胞培养上清。将该柱在4°C冷却，用IX结合缓冲液(20mMNa2HP04，pH7.0)平衡。将细胞上清在4°C以38400Xg离心30分钟，与2X结合缓冲液以1:1比率混合。使用
AktaTMPurifiers P-950栗。以1.5ml/分钟应用培养上清(冰冷却的)。A)在纯化期间
在280nm光吸收和传导率的层析图。用5个柱体积的0_2M NaCl-梯度洗涤，然后用IX结合缓冲液载体洗涤。用5个柱体积的0-2M KSCN-梯度(pH7.0)洗脱，反向流速为2.5ml/分钟。B)0-2M KSCN-梯度的较高的放大率和洗脱级分V=20ml。所示体积是技术系统流程，非实际体积。
[0053]图10:抗A β 11(ρΕ)抗体(克隆13)纯化的SDS-凝胶电泳图
[0054]预染色蛋白质梯:10_250kDa(Fermentas)。分析的纯化级分:泳道1,6:蛋白G纯化之前；泳道2，7:流经液；泳道3 ；8:洗涤级分；泳道4，9:用KSCN洗脱，使用30 μ g/ml抗体；泳道5:非还原样品缓冲液。抗体纯化使用蛋白G HP柱进行，用0-2M KSCN pH7.0洗脱。还原样品在具有β-巯基乙醇的SDS缓冲液(Roti?-Load 1，BioRad)中1:3稀释，在95°C温育10分钟。非还原样品在无巯基乙醇的样品缓冲液中1:4稀释，在30°C振荡30分钟。SDS-PAGE分离时间(12%，Imm SDS-凝胶):在100V分离10分钟，在200V分离35分钟。将凝胶用考马斯亮蓝-G250染色，用10%乙酸脱色。
[0055]图11:抗A β 11 (ρΕ)抗体的UV-光谱
[0056]使用通过蛋白G柱从杂交瘤细胞培养上清(克隆13)中纯化的抗体。在240nm-339nm之间测量光谱。在透析缓冲液(D_PBS，2mM EDTA, ρΗ7.13)中1:20稀释。探针的厚度为1cm，使用UV-光谱仪UVl测量在240-339nm之间的UV-光谱。
[0057]图12:抗A β 11 (ρΕ)抗体的UV-光谱
[0058]抗体稀释:在D-PBS、2mM EDTA中1:10稀释。在生物素化之前和之后使用UV-光谱仪UVl测量在240nm-339nm之间的光谱。探针厚度为1cm。
[0059]图13:抗A β 11 (ρΕ)抗体的CD-光谱
[0060]使用Jasco J-710spectro_polarimeter 在 20°C测量在 190_260nm 之间的生物素化和未生物素化的抗体的光谱。抗体浓度为在IOmM NaH2PO4(pH7.1)中0.13mg/ml。以20次累积(accumulation)、ls积分及1_厚的探针进行测量。
[0061]图14:抗Αβ 11(ρΕ)抗体的热稳定性
[0062]使用Jasco J-710spectro-poIarimeter 在 2CTC直至 8CTC温度测量在 190_260nm之间的CD-光谱。抗体浓度为在IOmM NaH2PO4 (ρΗ7.14)中0.13mg/ml。以5°C间隔、加热速率为30K/小时的10次累积、Is积分、及厚的探针进行测量，每次测量前平衡180秒。
[0063]图15:生物素化的抗Αβ 11(ρΕ)抗体的热稳定性
[0064]使用Jasco J-710spectro-poIarimeter 在 2CTC直至 8CTC温度测量在 190_260nm之间的CD-光谱。抗体浓度为在IOmM NaH2PO4 (ρΗ7.14)中0.13mg/ml。以5°C间隔、加热速率为30K/小时的10次累积、Is积分、及厚的探针进行测量，每次测量前将温度平衡180秒。抗体浓度为在IOmMNaH2PO4(pH7.14)中0.13mg/ml。间隔5°C测量，加热速率为30K/小时，10次扫描，I秒积分，Imm厚度的探针，每次测量前平衡180秒。
[0065]图16:AMpEll-18)-PEG 与抗 Αβ 11(ρΕ)抗体(克隆 13)的 ITC 滴定曲线
[0066]使用ITC MicroCalorimeter (MicroCal)。实验包括 30 次在 20 °C 注射(I 次2μ 1，29次10 μ I)，每次注射在ITC缓冲液ρΗ7.I中的81.78 μ MA β (pEll-18) -PEG，两次注射间隔4分钟(黑色线条)。上面的踪迹例证了 ITC缓冲液中Αβ (pEl 1-18)-PEG的稀释热。下面的踪迹示出了将Aβ (pEl 1-18)-PEG注射进含有在ITC缓冲液ρΗ7.I中的5.13 μ M抗体的样品池中(体积=1.405ml)。红色线条是基线。
[0067]图17:Αβ (pEll-18)-PEG 与抗 Αβ 11(ρΕ)抗体(克隆 13)的 ITC 结合曲线
[0068]抗体用蛋白G琼脂糖凝胶纯化，并用KSCN-梯度(pH7.0)洗脱。实验包括在20 V的30次注射(I次2 μ 1，29次10 μ I)，每次注射于ITC缓冲液ρΗ7.1中81.78 μ MΑβ (pEll-18)-PEG，两次注射间隔4分钟。样品池(体积=1.405ml)含有在ITC缓冲液PH7.1中的5.13 μ M抗体。Αβ (pEll-18)-PEG稀释进ITC缓冲液中的热从所有配体注射中减去。使用ITCMicroCalorimeter (MicroCal)。使用0rigin7.0确定热力学参数反应化学计量(N)、结合常数⑷、键j:含(binding enthalpy, ΔΗ)以及熵(AS)0
[0069]图18:Αβ (pEll-18)-PEG 与 Αβ 11(ρΕ)抗体(克隆 13)的 ITC 结合曲线
[0070]抗体用蛋白G琼脂糖凝胶纯化，并用0.1M甘氨酸-HCl盐酸(pH2.7)洗脱。实验包括在20°C的30次注射(I次2μ 1，29次10μ 1)，每次注射于ITC缓冲液pH7.1中686.31 μ MΑβ (pEll-18)-PEG，两次注射间隔4分钟。样品池(体积=1.405ml)含有在ITC缓冲液PH7.1中的32.85 μ M抗体。Αβ (pEll_18)-PEG稀释进ITC缓冲液中的热从所有配体注射中减去。使用ITC MicroCalorimeter (MicroCal)进行。使用0rigin7.0确定热力学参数反应化学计量(N)、结合常数(?、键洽(binding enthalpy, ΔΗ)以及熵(AS)0
[0071]图19:Αβ (pEl 1-18)-PEG与生物素化的抗A β 11(ρΕ)抗体(克隆13)的ITC结合曲线
[0072]所示实验包括在20°C的30次注射(I次2 μ I和29次10 μ I)，每次注射在ITC缓冲液ρΗ7.I中的101.8μΜ Αβ (pEll_18)_PEG，两次注射间隔4分钟。样品池(体积=1.405ml)含有在ITC缓冲液ρΗ7.I中的5.12 μ M生物素化的抗体。Αβ (pEl 1-18)-PEG的稀释进ITC缓冲液中的热从所有配体注射中减去。使用ITC MicroCalorimeter(MicroCal)进行。使用0rigin7.0确定热力学参数反应化学计算(N)、结合常数(K)、键j:含(binding enthalpy,ΔΗ)以及熵(AS).[0073]图20:抗Αβ 11(ρΕ)与抗Αβ3(ρΕ)抗体的交叉反应性
[0074]在Biacore3000上通过 SPR确定抗 Αβ 11 (ρΕ)抗体(克隆 13)与 Aβ ρΕ(11-30)和Aβ ρΕ(3-40)肽的交叉反应性。使用具有固定化的大约1000RU的ΑβρΕ(11_30)和1830RU的A β pE (3-40)的CM5芯片。以30 μ I/分钟的速度注射I μ g/ml抗体300秒，记录300秒解离时间，在运行缓冲液中稀释。在具有固定化的Αβ的流动池中测量的信号从未包被的流动池中测量的信号中减去。
[0075]图21:在自身-1g-ELISA中抗Αβ 11(ρΕ)抗体(克隆13)的标准曲线
[0076]将200ng/ml Aβ (ρΕ11_20)-生物素固定化在链霉抗生物素包被的微平板上(2小时，室温)。用200 μ I ELISA-Blocker (-Τ)在室温封闭I小时，随后进行洗涤循环(3X300 μ I/孔洗涤缓冲液)。将标准抗A β 11 (ρΕ)抗体(克隆13)在ELISA-Blocker (+Τ)中稀释，以根值除法(radix division)从3500pg/ml稀释至55pg/ml,在4°C温育2小时。进行一次洗涤循环，使用多克隆兔抗小鼠Ig' s HRP在4°C检测I小时。在洗涤循环之后加入ΤΜΒ/Η202，在室温温育30分钟(避光)，用IM H2SO4终止酶反应。在TECAN Sunrise测量在450/540nm的光吸收。
[0077]图22:直接 A β 11 (pE)ELISA (克隆 13)
[0078]将不同浓度的A βρΕ (11-30)肽在4°C包被过夜，然后用ELISA-Blocker (-T)在室温封闭2小时。将生物素化的抗A β 11(ρΕ)抗体(克隆13)与链霉抗生物素-HRP缀合物在室温预温育10分钟，在ELISA-Blocker (+T)中稀释。加入I μ g/ml抗体(克隆13)。用6X 300 μ I/孔TBS-T buffer在两次温育之间(除了在肽包被之后)进行洗涤循环。加入ΤΜΒ/Η202，在室温温育30分钟(避光)，用IM H2SO4终止酶反应。在TECAN Sunrise中测量在450/540nm的光吸收。
[0079]图23:直接 A β 11 (pE) ELISA (4G8)[0080]将不同浓度的A βρΕ (11-30)肽在4°C包被过夜，然后用ELISA-Blocker (-T)在室温封闭2小时。将生物素化的4G8与链霉抗生物素-HRP缀合物在室温预温育10分钟，在ELISA-Blocker (+T)中进行二基数稀释(radix two dilution)。加入 I μ g/ml4G8 抗体。用6X300 μ I/孔TBS-T在两次温育之间(除了在肽包被之后)进行洗涤循环。加入TMB/H2O2,在室温温育(避光)30分钟，用IM H2SO4终止酶反应。在TECAN Sunrise中测量在450/540nm的光吸收。
[0081]图24:人AD脑的β -淀粉样蛋白染色
[0082]使用抗Αβ 11(ρΕ)(克隆13)抗体进行免疫染色。AD脑切片是经石蜡包埋的。细胞核用苏木精染色。来自AD病例I和3的海马及来自AD病例2的额叶皮质的系列切片照相。AD病例I和2示出Αβ ll(pE)沉积的细胞外大斑块(见箭头和放大方图所示)。在AD病例2中示出细胞内Αβ 11 (ρΕ)沉积(见下右侧放大方图所示)，在AD病例3中示出Αβ 11(ρΕ)沉积(见箭头所示)。在左图和右图中的放大率是相似的。该图像由C.Lemere实验室(Havard Medical School, Boston)友好提供。
[0083]图25:APP/PS1小鼠脑的β -淀粉样蛋白染色
[0084]用抗Αβ 11(ρΕ)抗体对福尔马林固定的石蜡包埋的AD脑切片进行免疫染色。细胞核用苏木精染色。对转基因小鼠的海马进行系列切片。系列切片示出Αβ ll(pE)的血管沉积。褐色染色在脑血管中出现。图像由C.Lemere实验室(Havard Medical School, Boston)友好提供。
[0085]图26:自身-1g-ELISA 中抗 A β 11 (pE)IgG 和 Ig 水平
[0086]在抗ΑβΙΙ(ρΕ)自身抗体ELISA中关于总免疫球蛋白和IgG水平分析阿尔兹海默病(AD)和对照组(13个AD，30个对照)的EDTA-血浆。示出对照组和AD组的平均值和标准偏差。一式两份确定结果，样品在标准曲线内测量。
[0087]图27:自身-1g-ELISA 中抗 Αβ ll(pE)IgG2、IgG3、IgM 和 IgA 水平
[0088]在抗Αβ 11(ρΕ)自身抗体ELISA中，分析阿尔兹海默病(AD)和对照组(13个AD ；30个对照)的EDTA-血浆的IgG2、IgG3、IgM和IgA水平。示出对照组和AD组的平均值和标准偏差。一式两份确定结 果，样品在标准曲线内测量。
[0089]发明详述
[0090]定义
[0091]术语“抗体”以其最广泛的含义使用，特别涵盖完整的单克隆抗体，多克隆抗体，从至少两个完整抗体中形成的多特异性抗体(例如双抗体)，以及抗体片段，只要其呈现出希望的生物学活性即可。抗体可以是例如IgM, IgG(如IgGl, IgG2，IgG3或IgG4)，IgD, IgA或IgE。然而，优选抗体不是IgM抗体。
[0092]“抗体片段”包含完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。举例的抗体片段包括Fab，Fab’，F (ab’)2和Fv片段:双抗体，单链抗体分子，及从抗体片段中形成的多特异性抗体。
[0093]如本文所用，术语“单克隆抗体”是指得自一群基本同源的抗体的抗体，即该群包含的各个抗体除了以较少量存在的可能的天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体针对单一抗原性位点是高特异性的。此外，与“多克隆抗体”制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上一个单一决定簇，而多克隆抗体典型包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体。除了其特异性之外，单克隆抗体通常是有利的，其是通过杂交瘤培养合成的，不受其它免疫球蛋白污染。“单克隆”是指抗体得自基本同源的抗体群的特征，不是解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体。例如，本发明中使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法产生，所述杂交瘤方法首先由丨<6hlc「et al.，Nature, 256:495 (1975)描述。或者可以通过熟知的重组DNA方法产生。“单克隆抗体”也可以分离自噬菌体抗体文库，使用例如Clackson etal., Nature, 352:624-628 (1991)和 Marks et al., J.Mol.Biol., 222:581-597(1991)所述技术。
[0094]本发明中的单克隆抗体特别包括嵌合抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的相应序列是相同或同源的，同时所述链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的相应序列相同或同源，还包括这种抗体的片段，只要其呈现出希望的生物活性即可。
[0095]非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合的免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或片段(如Fv，Fab, Fab’，F (ab’) 2或者抗体的其它抗原结合亚序列)，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小的序列。对于大多数而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基由具有希望的特异性、亲和性和能力(capacity)的来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR置换。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基由相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体及在输入的CDR或构架序列中均未发现的残基。
[0096]产生这些修饰是为了进一步改善和优化抗体性能。通常地，人源化抗体包含基本上全部的至少一个及典型二个可变结构域，其中全部或基本上全部的⑶R区相应于非人免疫球蛋白的那些区域，全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的那些区域。人源化抗体理想地还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，典型为人免疫球蛋白的恒定区。进一步的详细描述见 Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986), Reichmann etal, Nature.332:323-329(1988)及 Presta, Curr.0p.Struct.Biel., 2:593-596(1992)所述。人源化抗体包括Primatized?抗体,其中抗体的抗原结合区衍生自通过用感兴趣的抗原免疫恒河猴产生的抗体。
[0097]“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一个多肽链中。通常地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的一个多肽接头，其使得sFv形成抗原结合希望的结构。关于sFv的回顾见Pluckthun in The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlagj NewYork, pp.269-315(1994)所述。
[0098]术语“双抗体(Diabodies) ”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一多肽链(VH-VD)中与轻链可变结构域(VD)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用非常短的以至于同一链上两个结构域之间不能配对的接头，使得所述结构域与另一链的互补结构域配对。双抗体在Hollinger et al., Proc.Natl.Acad.Sol.USA, 90:6444-6448(1993)中更充分描述。
[0099]“分离的”抗体是已经从其天然环境的成分中鉴别和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是干扰抗体的诊断或治疗性应用的材料，可包`括酶、激素及其它蛋白质样或非蛋白质样溶质。在优选的实施方案中，所述抗体被纯化为:(1)通过Lowry方法确定抗体95%重量以上,最优选99%以上；(2)通过使用spinning cup sequenator,足以获得N末端至少15个残基或者内部氨基酸序列的程度；或者(3)在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色，通过SDS-PAGE纯化为均质性。分离的抗体包括重组细胞内原位抗体，由于抗体天然环境的至少一种成分不存在。然而，通常分离的抗体是通过至少一个纯化步骤制备的。[0100]如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，所有这些名称均包括其后代。因此，术语“转化体”和“转化的细胞”包括原代对象细胞以及衍生自其中的培养物，无关于传代(transfers)次数。也应理解所有后代在DNA含量方面由于有意或无意的突变所致可以不是精确相等的。包括经筛选与在最初转化的细胞具有相同功能或生物活性的突变后代。在明确命名的情况中，从上下文可明了。
[0101]如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，定义为是指由通过肽键连接的氨基酸组成的生物分子。
[0102]如本文所用，术语“一个…”、“所述…”等定义为是指“一或多个”，除非根据上下文语境是不当的，则还包括多个。
[0103]短语“由淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样蛋白(amyloid-like proteins)导致或与其相关的疾病或失调”包括但不限于由于存在单体、原纤维或多聚体状态或者这三种状态的任意组合的淀粉样蛋白样蛋白或其活性所致的疾病或失调。这种疾病和失调包括但不限于淀粉状变性，内分泌肿瘤及黄斑变性。
[0104]术语“淀粉状变性”是指与淀粉样斑块形成相关的一组疾病和失调，包括但不限于继发淀粉状变性和年龄相关的淀粉状变性，例如包括但不限于神经失调如阿尔兹海默病(AD)，包括特征在于认知记忆能力丧失的疾病或病症，如轻度认知损伤(MCI)，散发性阿尔兹海默病，路易体痴呆(Lewy body dementia),唐氏综合征,遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆综合征(Guam Parkinson-Dementia),家族性阿尔兹海默病如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD);以及基于或与淀粉样蛋白质相关的其它疾病，如进行性核上性麻痹，多发性硬化症；CreutZfeld Jacob病，帕金森病，HIV-相关痴呆，ALS (肌萎缩性脊髓侧索硬化症)，包涵体肌炎(IBM)，成人型糖尿病，及老年性心脏淀粉状变性；以及各种眼病，包括黄斑变性，玻璃膜疣-相关的视神经病变，及由于β -淀粉样沉积所致白内障。
[0105]“淀粉样蛋白β、Αβ或者β_淀粉样蛋白”是本领域认可的术语，是指淀粉样β蛋白和肽，淀粉样蛋白β前 体蛋白(APP)，以及其修饰物、片段及任何功能等价物。特别地，本发明使用的淀粉样蛋白β是指通过APP的蛋白酶解产生的任何片段，但特别是参与淀粉状变性或与其相关的那些片段，包括但不限于Αβυ,Αβ这些Αβ肽的氨基酸序列如下示出:
[0106]Αβ 1-42 (SEQ ID N0.1):
[0107]Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-1le-1le-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-1le-Ala
[0108]Αβ 1-40 (SEQ ID N0.2):
[0109]Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-1le-1le-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
[0110]Αβ 1-38 (SEQ ID N0.3):
[0111]Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-1le-1le-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly
[0112]“pGlu-Αβ ”或“ΑβΝ3ρΕ”是指Αβ的N末端截短形式，其起自于在Aβ氨基酸序列第3位的谷氨酸残基，其中所述谷氨酸残基被环化形成焦谷氨酸残基。特别地，如本发明所用pGlu-Α β是指参与淀粉状变性或者与其相关的那些片段，包括但不限于pGlu-Α β 3_38，pGlu-Α β 3-40? P-Glu-A β 3_42。
[0113]Αβ的N-末端截短形式Aβ 3-38> Aβ 3-40> Aβ 3_42的序列如下示出:
[0114]A β 3-42 (SEQ ID N0.4):
[0115]Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-1le-1le-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-1le-Ala
[0116]A β 3-40 (SEQ ID N0.5):
[0117]Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-1le-1le-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
[0118]A β 3-38 (SEQ ID N0.6): [0119]Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-1Ie-1Ie-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly
[0120]“Ai3pGlu(ll)”、“Ai3 (pEll) ” 或“A β 11 (pE) ” 是指 A β 的 N_ 末端截短形式，其起自于Αβ氨基酸序列第11位的谷氨酸，所述谷氨酸残基被环化形成焦谷氨酸残基。特别地，本发明所用APpGlu(Il-X)是指参与淀粉状变性或者与其相关的那些片段，包括但不限于pGlu-Α β η_38、pGlu-Α β n_40> p-Glu-A β n_42。
[0121]Αβ 的N末端截短形式Aβ11_38、Aβ11_4(l、Aβ11_42的序列如下示出:
[0122]Αβ 11-42 (SEQ ID N0.7):
[0123]Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-1Ie-1Ie-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-1Ie-Ala
[0124]Αβ 11-40 (SEQ ID N0.8):
[0125]Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-1Ie-1Ie-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
[0126]Αβ 11-38 (SEQ ID N0.9):
[0127]Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-1Ie-1Ie-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly
[0128]特别地，本发明涉及如下项目:
[0129]1.抗体,特征在于其结合Αβ pGlu(ll)肽或其变体,优选以高亲和性结合。
[0130]2.条目I的抗体，其中所述高亲和性是指解离常数(Kd)值为IO-7M或者更好。
[0131]3.条目I或2的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
[0132]4.前述任一条目的抗体，其中所述抗体的轻链的可变部分具有SEQ ID N0:51的核苷酸序列或者SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
[0133]5.前述任一条目的抗体，其中所述抗体的重链的可变部分具有SEQ ID N0:53的核苷酸序列或者SEQ ID N0:54的氨基酸序列。[0134]6.前述任一条目的抗体，其中所述抗体的轻链的可变部分具有SEQ ID N0:51的核苷酸序列或者SEQ ID N0:52的氨基酸序列，及其中所述抗体的重链的可变部分具有SEQID NO:53的核苷酸序列或者SEQ ID N0:54的氨基酸序列。
[0135]7.前述任一条目的抗体，其中所述抗体是A β 13-11-6(保藏号DSM ACC3100)或者其功能变体。
[0136]8.条目7的抗体，其中所述抗体是Aβ 13-11-6(保藏号DSM ACC3100)。
[0137]9.前述任一条目的抗体，其中所述抗体是保留高亲和性的人源化或嵌合抗体、或者抗体片段。
[0138]10.前述任一条目的抗体，用于检测A PpGlu (11)肽或其变体
[0139]11.条目10的抗体，其中所述变体选自:
[0140]pGlu-Αβ n_38
[0141]pGlu-Αβ n-40
[0142]pGlu-Α β η_42,及
[0143]pGlu-Αβ η_χ 变体，
[0144]其中X是18-42之间的整数，更优选是30_42之间的整数。
[0145]12.前述任一条目的抗体，其是人抗体。
[0146]13.前述任一条 目的抗体,其是保留高亲和性的双抗体(diabody)或者单链抗体。
[0147]14.前述任一条目的抗体，其结合由条目11定义的抗体所结合的表位。
[0148]15.前述任一条目的抗体，其具有条目11所定义抗体的互补决定区。
[0149]16.前述任一条目的抗体，其中所述抗体的轻链可变部分具有一或多个如一个、两个或三个互补决定区，所述互补决定区与具有SEQ ID NO:51的核苷酸序列或SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链可变部分的抗体的一个或多个如一个、两个或三个互补决定区相同。
[0150]17.前述任一条目的抗体，其中所述抗体的轻链可变部分具有一或多个如一个、两个或三个互补决定区，所述互补决定区与具有SEQ ID NO: 53的核苷酸序列或SEQ ID NO: 54的氨基酸序列的重链可变部分的抗体的一个或多个如一个、两个或三个互补决定区相同。
[0151]18.前述任一条目的抗体，其是经标记的。
[0152]19.前述任一条目的抗体，其被固定化在固相上。
[0153]20.可得自杂交瘤细胞系DSM ACC3100的抗体。
[0154]21.包含前述任何条目的抗体的组合物。
[0155]22.条目21的组合物，用于治疗、预防或者延缓淀粉状变性。
[0156]23.条目21或22的组合物，其中所述淀粉状变性是神经变性疾病，所述神经变性疾病选自唐氏综合征中的神经变性、轻度认知损伤和阿尔兹海默病。
[0157]24.条目21或22的组合物，其中所述淀粉状变性是散发性阿尔兹海默病或者家族性阿尔兹海默痴呆。
[0158]25.条目24的组合物，其中所述家族性阿尔兹海默痴呆是家族性英国型痴呆或者家族性丹麦型痴呆。
[0159]26.杂交瘤细胞系 DSM ACC3100。
[0160]27.条目1-20任一项的抗体或者项目21-25任一项的组合物在诊断或治疗方法中的应用。[0161]28.条目27的应用，其用于诊断淀粉状蛋白相关疾病或病症。
[0162]29.条目28的应用，其中所述淀粉状变性是神经变性疾病，所述神经变性疾病选自唐氏综合征中的神经变性、轻度认知损伤和阿尔兹海默病。
[0163]30.条目28的应用，其中所述淀粉状变性是散发性阿尔兹海默病或者家族性阿尔兹海默痴呆。
[0164]31.条目28的应用，其中所述家族性阿尔兹海默痴呆是家族性英国型痴呆或者家族性丹麦型痴呆。
[0165]32.诊断淀粉状蛋白相关疾病或病症、特别是阿尔兹海默病的体外诊断方法，包括如下步骤:
[0166]将条目1-20任一项的抗体与来自怀疑患有所述疾病或病症的对象的样品接触，及
[0167]检测所述抗体与来自样品的A@pGlu(ll)蛋白的结合。
[0168]33.诊断试剂盒,包含条目1-20任一项的抗体及使用说明书、及任选存在的-(a)进一步的生物活性物质。
[0169]34.条目33的诊断试剂盒，其 中所述进一步的生物物质是谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂。
[0170]35.选自SEQ ID NO:26至50的寡核苷酸。
[0171]本发明的抗体可用于诊断淀粉状变性。
[0172]本发明的抗体可用作亲和性纯化剂。在这种方法中，使用本领域熟知的方法，将所述抗体固定化在固相支持物如Sephadex树脂或滤纸上。将固定化的抗体与含有待纯化的AiipGlu(Il)肽的样品接触，之后用合适的溶剂洗涤该支持物，基本上除去所述样品中除了 AiBpGlu(Il)-肽之外的所有材料，所述AiBpGlu(Il)-肽与固定化的抗体结合。最后，将该支持物用另一种合适的溶剂如甘氨酸缓冲液PH5.0洗涤，这样将从所述抗体中释放A β pGlu (11)-肽。
[0173]抗-Αβ pGlu(ll)-肽抗体也可用于Αβ pGlu(ll)-肽的诊断性测定,例如在特定的细胞、组织或血清中检测其存在。因此，所述抗体可用于诊断淀粉状变性，特别是选自如下一组的神经变性疾病:轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)，如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或者家族性阿尔兹海默痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，以及唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔兹海默病。
[0174]对于诊断性应用，抗体典型用可检测成分进行标记。许多标记可以利用，其通常可被分为如下类别:
[0175](a)放射性同位素,如 35S,14C,1251,3H和 1311。抗体可以使用如 Current Protocolsin Immunology, Volumesland2, Giitigen et al., Ed., Wiley-1nterscience.New York, NewYork.Pubs., (1991)中所述技术用放射性同位素标记，放射性可以通过使用闪烁计数器测量。
[0176](b)荧光标记如稀土金属螯合物(铕螯合物)或者荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、dansyl、Lissamine、藻红蛋白和Texas Red是可利用的。突光标记可以使用如Current Protocols in Immunology, supra中所述技术与抗体缀合。突光可以通过使用突光计量化。[0177](c)各种酶-底物标记是可利用的。所述酶通常催化生色底物的化学改变，这种改变可以通过使用各种技术测量。例如所述酶可催化底物中颜色改变，这种改变可以使用分光光度计测量。或者，所述酶可改变底物的荧光或化学发光性。量化荧光改变的技术在上文描述。化学发光底物通过化学反应变成电子激发的，然后可发射可测量的光(使用如化学发光测量仪测量)，或者将能量提供给荧光受体。举例的酶标记包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No，4，737，456)、萤光素、2，3- 二氢酞嗪二酮、苹果酸酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、O-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶。酶与抗体缀合的技术在 O，Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-AntibodyConjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym(ed Langone & H.VanVunakis), Academic Press, New York, 73:147-166 (1981)中描述。
[0178]举例的酶-底物组合包括例如:
[0179](i)辣根过氧化物酶(HRPO)与作为底物的过氧化氢酶，其中过氧化氢酶氧化染料前体(如邻苯二胺(orthophenylene diamine, 0PD)或者3, 3’，5，5’ -四甲基盐酸联苯胺(TMB))；
[0180](ii)碱性磷酸酶(AP)与作为生色底物的对硝基苯磷酸；以及
[0181](iii) β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(如ρ_硝基苯_ β _D_半乳糖苷酶)或者荧光底物4-甲基伞形酮-β -D-半乳糖苷酶。
[0182]本领域技术人员可利用许多其它酶-底物组合。
[0183]有时，标记与抗体间接缀合。技术人员已知许多实现这种缀合的技术。例如，抗体可以与生物素缀合，上述三种广谱标记的任何标记均可以与抗生物素蛋白缀合，或者反之亦然。生物素选择性结合抗生物素蛋白，因此标记可以与抗体以这种间接方式缀合。或者，为了实现标记与抗体的间接缀合，使抗体与小的半抗原(如地高辛)缀合，并将上述不同类型的标记之一与抗-半抗原抗体(如抗-地高辛抗体)缀合。由此，可以实现标记与抗体的间接缀合。
[0184]A β pGlu (I I) -抗体不需要被标记,其存在可以通过使用与A β pGlu (11)-抗体结合的标记的抗体检测。
[0185]本发明的抗体可用于任何已知测定方法中，如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定以及免疫沉淀测定。Zola, Monoclonal Antibodies A Manual ofTechniques, pp.147-158(CRC Press.1nc., 1987)。
[0186]竞争性结合测定依赖于标记的标准物与检测样品分析物竞争结合有限量的抗体的能力。测试样品中的Ai3pGlu(ll)肽的量与变为结合抗体的标准物的量成反比。为了便于确定变为结合抗体的标准物的量，抗体在竞争之前或之后通常被不溶解化，由此结合抗体的标准物和分析物与保持未结合的标准物和分析物可便利地分离。
[0187]夹心测定包括使用两种抗体，每种抗体均能结合待检测的蛋白质的不同的免疫原性部分或表位。在夹心测定中，检测样品分析物由固定在固体支持物上的第一种抗体结合，之后第二种抗体与该分析物结合，因此形成不溶的三部分复合物。第二种抗体自身可用可检测部分标记(直接夹心测定)，或者可以使用可检测部分标记的抗-免疫球蛋白抗体测量(间接夹心测定)。例如，一种优选的夹心测定类型是ELISA测定，其中所述可检测部分是酶。
[0188]对于免疫组织化学，组织样品可以是新鲜的或者是冷冻的，可以将其包埋在石蜡中并用防腐剂如福尔马林固定。
[0189]诊断试剂盒
[0190]为了方便起见，本发明的抗体可以在试剂盒中提供，即预定量试剂连同进行诊断测定的说明书的包装组合。在抗体是用酶标记的情况中，试剂盒将包括所述酶需要的底物和辅因子(如提供可检测的生色团或荧光团的底物前体)。此外，可包括其它添加剂如稳定剂，缓冲液(如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。不同试剂的相对量可以非常不同，以提供所述试剂溶液的浓度充分优化测定的敏感性。特别地，所述试剂可以作为干粉形式提供，通常是冻干的，包括赋形剂，当其溶解时提供具有适当浓度的试剂溶液。
[0191]本发明的诊断试剂盒可含有如下文所述的进一步的生物活性物质。特别优选用于所述诊断试剂盒中的是谷氨酰胺酰环化酶抑制剂。
[0192]本发明的诊断试剂盒可特别用于检测和诊断淀粉样物-相关的疾病和病症，特别是神经变性疾病，所述神经变性疾病选自轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔兹海默病。
[0193]本发明特别涉及抗体，其特征在于以高亲和性结合AiBpGlu(Il)-肽。本发明还涉及抗体，其特征在于以高亲和性结合A β pGlu (I I) -肽或其变体。所述高亲和性在本发明中是指亲和性Kd值为10_7M或更好，优选KD值为10_8M或更好，甚至更优选Kd值为10_9M至IO 12Mo从而，本发明的抗体以比先前已知的`抗体更高的亲和性结合A PpGlu (11)-肽。
[0194]特别地，所述抗体优选是单克隆抗体，是Αβ 13-11-6 (DSM ACC3100)。
[0195]本发明的抗体可特别用于诊断方法中，以检测淀粉状变性，特别是神经变性疾病，所述神经变性疾病选自轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔兹海默病。
[0196]根据本发明的一个优选实施方案，所述抗体可以是人源化抗体或者是嵌合抗体或者是人抗体。
[0197]此外，选自上述一组的抗体也可以是所述一组抗体的功能变体。
[0198]在本发明中，APpGlu(ll)肽的变体特别是:
[0199]pGlu-Αβ n_38，
[0200]pGlu-Αβ n_40，
[0201]pGlu-Αβ n_42。
[0202]A β pGlu (11)肽的进一步的变体是所有pGlu-Α β η_χ变体，其示出由于阿尔兹海默病的结果或者在阿尔兹海默病之前已经在脑中积累。X被定义为18-42之间的整数，如在pGlu-Α β η_42中，“ 42 ”是“ X ”表示的整数。
[0203]在本发明中，本发明抗体的“功能变体”是保留与pGlu-Αβ η_χ肽的结合能力、特别是高亲和性结合能力的抗体或其功能变体。这种功能变体的提供是本领域已知的，涵盖上述在抗体或其片段的定义下的可能性。[0204]在一个优选的实施方案中，抗体是如上文定义的抗体片段。
[0205]在进一步优选的实施方案中，本发明的抗体是结合由上文定义的抗体结合的表位的抗体，特别是抗体13-11-6。
[0206]在进一步优选的实施方案中，本发明的抗体是具有上文定义的抗体的互补决定区(CDR)的抗体。优选地，所述抗体可以被标记；可能的标记是上文提及的那些标记以及特别是抗体的诊断性应用领域技术人员已知的所有那些标记。
[0207]优选地，抗体被固定在固相支持物上。
[0208]本发明还涉及可得自杂交瘤细胞系13-11-6 (DSM ACC3100)的抗体。
[0209]本发明还涉及包含上述抗体的组合物。特别地，所述组合物是诊断性应用组合物，特别用于诊断神经变性疾病，所述神经变性疾病选自轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔兹海默病；通过是通过检测生物样品中的Αβ pGlu(ll)肽或其变体进行诊断。
[0210]在另一实施方案中，本发明的和如本文所述的抗体或其片段呈现出与A pGlu(Il)寡聚体、纤维、原纤维或丝状体的结合亲和性比与APpGlu(11)单体的结合亲和性高至少2倍，特别是至少4倍，特别是至少10倍，特别是至少15倍，更特别是至少20倍，但尤其是至少25倍。
[0211]在再一个实施方案中，提供了如前文所述的抗体或其片段或者嵌合抗体或其片段，或者人源化抗体或其片段，所述抗体充分结合哺乳动物、特别是人脑中聚集的A β，包括Αβ斑块，但是优选未示出与淀粉样前体蛋白(APP)的任何显著的交叉反应性。
[0212]在本发明的另一方面中，提供了如前文所述的抗体或其片段或者嵌合抗体或其片段，或者人源化抗体或其片段，所述抗体充分结合哺乳动物、特别是人脑中可溶的聚合的淀粉样物、特别是淀粉样蛋白β (Αβ)，包括Αβ单体，但是优选未示出与淀粉样前体蛋白(APP)的任何显著的交叉反应性。
[0213]本发明还涉及如上文定义的人源化形式的抗体，包含所述人源化抗体的组合物，以及所述组合物在治疗淀粉状变性、尤其是治疗哺乳动物特别是人的神经变性疾病中的应用。所述神经变性疾病特别选自轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性。优选所述神经变性疾病是阿尔兹海默病。
[0214]本发明还涉及杂交瘤细胞系13-11-6。
[0215]本发明还涉及如上文定义的抗体或者包含所述抗体的组合物在体外诊断方法中的应用。特别地，这种诊断方法涉及诊断神经变性疾病，所述神经变性疾病选自轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔兹海默病；尤其是通过检测生物样品中的AiipGlu(Il)肽或其变体而进行诊断。
[0216]优选地，所述样品是血清样品。
[0217]根据另一优选的实施方案，所述样品是液剂(liquor)或脑脊液(CSF)样品。
[0218]在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及如下方法:
[0219]体外或原位诊断方法，用于诊断淀粉样物相关的疾病或病症，优选阿尔兹海默病，所述方法包括如下步骤:
[0220]将本发明的抗体与来自怀疑患有所述病症或疾病的对象的样品接触，优选选自血清、液剂或CSF样品，最优选血清样品；或者与所述对象的特异身体部分或身体区域接触，及[0221]检测所述抗体与来自样品的A@pGlu(ll)肽的结合。
[0222]更特别地，本发明涉及诊断淀粉样物相关疾病或病症、优选阿尔兹海默病的方法，包括检测与样品中或原位的AiipGlu(Il)肽的抗体或其活性片段的免疫特异性结合，所述方法包括如下步骤:
[0223](a)将怀疑含有淀粉样蛋白的样品或特异身体部分或身体区域与本发明的抗体和/或其功能部分接触，所述抗体是如前文所述抗体、特别是本发明的单克隆抗体或者嵌合抗体或其片段或者人源化抗体或其片段，所述抗体结合A PpGlu (I I)肽；
[0224](b)使得所述抗体和/或其功能部分结合A PpGlu (I I)肽以形成免疫复合物；
[0225](c)检测所述免疫复合物的形成；以及
[0226](d)将所述免疫复合物的存在与否与样品或特异身体部分或区域中APpGlu(ll)肽的存在与否相关联。
[0227]本发明还包括一种确定组织和/或体液中成淀粉样斑块负荷(burden)程度的方法，所述方法包括:
[0228](a)获得待研究的组织和/或体液的代表性样品；
[0229](b)使用本发明的及如前文所述的抗体、特别是单克隆抗体或者嵌合抗体或其片段或者人源化抗体或其片段和/或其功能部分检测所述样品中淀粉样蛋白质的存在情况；
[0230](C)确定与所述蛋白质结合的抗体的量；及
[0231](d)计算组织和/或体液中斑块负荷(burden)。
[0232]本发明特别涉及一种确定组织和/或体液中成淀粉样斑块负荷(burden)的程度的方法，其中确定在步骤c)中免疫复合物的形成，由此所述免疫复合物的存在与否与淀粉样蛋白、特别是AiipGlu(Il)肽的存在与否相关联。
[0233]在再一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含治疗有效量的本发明的抗体，或者本发明的及如前文所述的嵌合抗体或其片段，或者人源化抗体或其片段，包括任何功能等价抗体或者任何衍生或功能部分，本发明特别涉及任选进一步包含药物可接受的载体的药物组合物。
[0234]在本发明另一实施方案中，所述组合物包含治疗有效量的抗体。
[0235]本发明进一步包含一种混合物，其包含治疗有效量的本发明的及如前文描述的抗体，特别是单克隆抗体或者嵌合抗体或其片段或者人源化抗体或其片段，包括其任何功能等价抗体或任何衍生或功能部分，以及任选进一步的生物活性物质和/或药物可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
[0236]特别地，本发明涉及一种混合物，其中进一步的生物活性物质是用于治疗淀粉状变性的化合物，所述淀粉状变性是与淀粉样物或淀粉样蛋白质如AiBpGlu(Il)蛋白的参与相关的一组神经变性疾病和失调，如轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)，如散发性阿尔兹海默病(SAD)或者家族性阿尔兹海默痴呆(FAD)，如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔兹海默病。[0237]在本发明另一实施方案中，所述其它生物活性物质或化合物也可以是可用于治疗由AiipGlu(Il)导致的淀粉状变性或者可用于治疗其它神经失调的治疗剂。
[0238]所述其它生物活性物质或化合物可通过与本发明的抗体相同或相似机制或者通过不相关的作用机制或者通过多种相关和/或不相关的作用机制发挥其生物学作用。
[0239]通常地，所述其它生物活性化合物可包括中子传输增强剂，精神神经疾病治疗药物，乙酰胆碱酯酶抑制剂，钙通道阻断剂，生物胺，苯并二氮镇定剂，乙酰胆碱合成、贮存或释放增强剂，乙酰胆碱突触后受体激动剂，单胺氧化酶-A或-B抑制剂，N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受体拮抗剂，非类固醇抗炎药物，抗氧化剂，及5-羟色胺受体拮抗剂。
[0240]更特别地，本发明涉及包含至少一种化合物及本发明的抗体以及任选药物可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂的混合物，所述化合物选自有效抗氧化的化合物，抗凋亡化合物，金属螯合剂，DNA修复抑制剂如哌仑西平(pirenzepin)及代谢物,3-氨基-1-丙磺酸(3-APS) ,1,3-丙二磺酸(I, 3PDS)，α -分泌酶激活物，β -和y-分泌酶抑制剂，tau蛋白，神经递质，β-折叠破坏剂(breakers),淀粉样β清除/耗竭细胞成分引诱剂，N-末端截短的淀粉样-β抑制剂包括焦谷氨酸化的淀粉样β 3-42，如谷氨酰胺酰环化酶抑制剂，抗炎分子，或者胆碱酯酶抑制剂(ChEIs)如他克林(tacrine),利斯的明(rivastigmine),多奈哌齐(donepezil)和/或加兰他敏(galantamine), Ml激动剂以及其它药物包括任何淀粉样或tau修饰药物及营养补充剂，以及营养补充剂。
[0241]本发明进一步涉及一种混合物，其中所述化合物是胆碱酯酶抑制剂(ChEIs)，特别是这样的混合物，其中所述化合物选自，利斯的明(rivastigmine),多奈哌齐(donepezil),加兰他敏(galantamine),烟酸和美金刚胺(memantine)。
[0242]在进一步的实施方案中，本发明的混合物可包含烟酸或美金刚胺(memantine)以及本发明的抗体，及任选包含药物可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
[0243]在进一步的实施方案中，本发明的混合物可包含一种谷氨酰胺酰环化酶抑制剂以及本发明的抗体，任选包含药物可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
[0244]优选的谷氨酰胺酰环化酶抑制剂在W02005/075436中描述，特别是在pp.31-40所示的实施例1-141中描述。实施例1-141的合成在W02005/075436的pp.40-48示出。W02005/075436关于实施例1-141、其合成及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
[0245]进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在W02008/055945中描述，特别是在pp.45-155示出的实施例1-473中描述。实施例1-473的合成在W02008/055945的pp.156-192描述。W02008/055945关于实施例1_473、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
[0246]进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在W02008/055947中描述，特别是在pp.53-118示出的实施例1-345中描述。实施例1-345的合成在W02008/055947的pp.119-133描述。W02008/055947关于实施例1_345、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
[0247]进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在W02008/055950中描述，特别是在pp.57-120示出的实施例1-212中描述。实施例1-212的合成在W02008/055950的pp.121-128描述。W02008/055950关于实施例1-212、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
[0248]进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在W02008/065141中描述，特别是在pp.56-59示出的实施例1-25中描述。实施例1-25的合成在W02008/065141的pp.60-67描述。W02008/065141关于实施例1_25、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
[0249]进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在W02008/110523中描述，特别是在pp.55-59示出的实施例1-27中描述。实施例1-27的合成在W02008/110523的pp.59-71描述。W02008/110523关于实施例1_27、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
[0250]进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在W02008/128981中描述，特别是在pp.62-65示出的实施例1-18中描述。实施例1-18的合成在W02008/128981的pp.65-74描述。W02008/128981关于实施例1_18、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
[0251]进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在W02008/128982中描述，特别是在pp.61-67示出的实施例1-44中描述。实施例1-44的合成在W02008/128982的pp.68-83描述。W02008/128982关于实施例1_44、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
[0252]进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在W02008/128983中描述，特别是在pp.64-68示出的实施例1-30中描述。实施例1-30的合成在W02008/128983的pp.68-80描述。W02008/128983关于实施例1_30、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
[0253]进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在W02008/128984中描述，特别是在pp.63-69示出的实施例1-36中描述。实施例1-36的合成在W02008/128984的pp.69-81描述。W02008/128984关于实施例1_36、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
[0254]进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在W02008/128985中描述，特别是在pp.66-76示出的实施例1-71中描述。实施例1-71的合成在W02008/128985的pp.76-98描述。W02008/128985关于实施例1_71、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
[0255]进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在W02008/128986中描述，特别是在pp.65-66示出的实施例1-7中描述。实施例1-7的合成在W02008/128986的pp.66-73描述。W02008/128986关于实施例1_7、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
[0256]在本发明的另一实施方案中，提供了包含“非典型抗精神病药”如氯氮平(clozapine)、齐拉西酮(ziprasidone)、利培酮(risperidone)、阿立哌唑(aripiprazole)或奥氮平(olanzapine)与本发明的及如前文所述的抗体、特别是单克隆抗体、嵌合抗体或其片段、人源化抗体或其片段的混合物，任选包含药物可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂，以治疗阳性和阴性精神病症状，包括幻觉，妄想，思维障碍(表现为明显的语无伦次，derailment,词不达意(tangentiality)),及离奇或混乱的行为，以及快感缺乏。[0257]在本发明的一特定实施方案中，本发明的及如前文所述的组合物和混合物包含治疗有效量的抗体和生物活性物质。
[0258]可适用于与本发明的抗体组合成的混合物中的其它化合物在W02008/065141 (特别见第37/38页)中描述，包括PEP-抑制剂(pp.43/44)，LiCl，二肽氨基肽酶的抑制剂，优选DP IV或DP IV-样酶的抑制剂(见pp.48/49);乙酰胆碱酯酶(ACE)抑制剂(见p.47)，PMT增强剂，β -分泌酶抑制剂(见p.41)，Y -分泌酶抑制剂(见pp.41/42)，中性肽链内切酶抑制剂，磷酸二酯酶抑制剂-4 (PDE-4)(见pp.42/43)，TNF α抑制剂，毒蕈碱Ml受体拮抗剂(见P.46)，NMDA受体拮抗剂(见pp.47/48)，σ -1受体抑制剂，组胺Η3拮抗剂(见p.43)，免疫调节剂，免疫抑制剂或者选自如下的制剂=Antegren (那他珠单抗(natalizumab)),Neurelan (氨卩比唳-SR), Campath (阿伦珠单抗(alemtuzumab)), IR208, NBI5788/MSP771 (替力莫妝(tiplimotide)),紫杉醇，Anergix.MS (AG284), SH636, Differin (CD271,阿达帕林(Adapalene) ),BAY361677(白细胞介素_4)，基质-金属蛋白酶抑制剂(如BB76163)，干扰素-tau (滋养层素)和SAIK-MS ; β -淀粉样抗体(见p.44)，半胱氨酸蛋白酶抑制剂(见P.44) ；MCP-1拮抗剂(见pp.44/45)，淀粉样蛋白沉积抑制剂(见P.42)和β淀粉样蛋白合成抑制剂(见P.42)，所述文献并入本文作参考。
[0259]在另一实施方案中，本发明涉及一种混合物，其包含治疗有效量的本发明的及如前文所述的抗体、特别是单克隆抗体或者嵌合抗体或其片段或者人源化抗体或其片段和/或生物活性物质。
[0260]本发明进一步涉及本发明的及如前文所述的抗体、特别是单克隆抗体、嵌合抗体或其片段或者人源化抗体或其片段和/或其功能部分和/或包含所述抗体和/或其功能部分的药物组合物或混合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗或减轻淀粉状变性的影响，所述淀粉状变性是与淀粉样斑块形成相关的一组疾病和失调，包括继发淀粉状变性和年龄相关的淀粉状变性，包括但不限于神经失调疾病如轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或者家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；路易体痴呆，遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆综合征；以及基于或与淀粉样蛋白相关的其它疾病如进行性核上性麻痹，多发性硬化症；CreutZfeld Jacob病，帕金森症，HIV相关痴呆，ALS(肌萎缩性侧索硬化症)，成人型糖尿病；老年性心脏淀粉状变性；内分泌肿瘤等，包括黄斑变性。
[0261]本发明还包含一种制备本发明的及如前文所述的抗体、特别是单克隆抗体、嵌合抗体或其片段或者人源化抗体或其片段和/或其功能部分和/或包含所述抗体和/或其功能部分的药物组合物或混合物的方法，特别以治疗有效量配制，用于预防、治疗或减轻淀粉状变性的影响，所述淀粉状变性是与淀粉样斑块形成相关的一组疾病和失调，包括继发淀粉状变性和年龄相关的淀粉状变性，包括但不限于神经失调疾病如轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或者家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；路易体痴呆，遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆综合征；以及基于或与淀粉样蛋白相关的其它疾病如进行性核上性麻痹，多发性硬化症；CreutZfeld Jacob病，帕金森症，HIV相关痴呆，ALS (肌萎缩性侧索硬化症)，成人型糖尿病；老年性心脏淀粉状变性；内分泌肿瘤等，包括黄斑变性，所述方法包括配制药物可接受形式的本发明的抗体、特别是单克隆抗体、嵌合抗体或其片段或者人源化抗体或其片段。
[0262]本发明进一步包括一种预防、治疗或减轻淀粉状变性的影响的方法，所述淀粉状变性是与淀粉样斑块形成相关的一组疾病和失调，包括继发淀粉状变性和年龄相关的淀粉状变性，包括但不限于神经失调疾病如轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或者家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；路易体痴呆，遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆综合征；以及基于或与淀粉样蛋白相关的其它疾病如进行性核上性麻痹，多发性硬化症；CreutZfeld Jacob病，帕金森症，HIV相关痴呆，ALS (肌萎缩性侧索硬化症)，成人型糖尿病；老年性心脏淀粉状变性；内分泌肿瘤等，包括黄斑变性，所述方法通过将本发明的抗体和/或其功能部分，特别是给予人源化抗体和/或其功能部分给予受这种失调病症困扰的动物或人，或者给予这种抗体和/或其功能部分的组合物或混合物而进行，包括给予治疗有效量的抗体。
[0263]本发明另一目的是提供一种通过将本发明的及如前文所述的抗体、特别是药物组合物给予所述动物、特别是哺乳动物或人而治疗淀粉状变性的方法，所述淀粉状变性是与淀粉样斑块形成相关的一组疾病和失调，包括继发淀粉状变性和年龄相关的淀粉状变性，包括但不限于神经失调疾病如轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或者家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；特别是特征在于丧失认知记忆能力的疾病或病症。
[0264]在本发明的一特定实施方案中，提供了一种通过给予所述动物、特别是哺乳动物或人本发明的及如前文 所述的抗体、特别是药物组合物，在患有记忆损伤的动物、特别是哺乳动物或人中保留或增加认知记忆能力、但特别是恢复认知记忆能力的方法。
[0265]本发明的再一目的是提供使用本发明的及如前文所述抗体治疗组合物和产生这种治疗组合物的方法，以及治疗淀粉状变性的方法，所述淀粉状变性是与淀粉样斑块形成相关的一组疾病或失调，包括继发淀粉状变性和年龄相关的淀粉状变性，包括但不限于神经失调疾病如轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或者家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；特别是特征在于丧失认知记忆能力的疾病或病症。
[0266]特别地，本发明涉及患有淀粉样物相关病症的动物、特别是哺乳动物或人的治疗，所述病症特征在于丧失认知记忆能力，通过治疗使得认知记忆能力得以保留。
实施例
[0267]1.材料和方法
[0268]1.1细胞培养技术
[0269]杂交瘤细胞和抗体筛选
[0270]产生抗Αβ种类的单克隆抗体(mAb)的鼠杂交瘤细胞由Biogenes GmbH(Berlin)提供。将雌性BALB/c小鼠用化学合成的Αβ (pEll-14)抗原免疫，所述抗原在C-末端半胱氨酸残基与钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)蛋白连接。KLH是潜在免疫原性的，用作疫苗载体蛋白。
[0271]使用经免疫的小鼠的脾细胞和鼠骨髓瘤细胞系SP2/0_Agl4进行细胞融合。在细胞融合后，使用次黄嘌呤氨蝶呤胸苷培养基(HAT)选择杂交瘤细胞。由此，HAT培养基使得可以选择杂交瘤细胞，其从B细胞中遗传获得次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)基因，并且从骨髓瘤细胞中获得致肿瘤性质。之后,筛选杂交瘤上清中抗A β (pEll-14)的特异性mAb的存在。检测mAb的结合不同的修饰的Αβ-肽的能力。因此，将Αβ-肽点印在羟基-纤维素膜上，与来自细胞培养上清的mAb —起温育，通过标记的抗体进行检测。选择产生抗N-末端修饰的Αβ 11 (ρΕ)肽的特异性mAb并且示出与其它修饰的A β -肽无显著交叉反应性的杂交瘤细胞进行再克隆(见表I)。通过限制稀释技术，克隆杂交瘤细胞，获得一个单独的克隆。
[0272]如下杂交瘤克隆在再克隆后是稳定的，由BioGenes提供:
[0273]pEVHH-5902513-ll_6(克隆 13)
[0274]本发明研究目的是成功培养杂交瘤细胞以在细胞培养上清中产生mAb。克隆的细胞培养上清中mAb的浓度应通过表面等离子体共振(SPR)确定。另外的目的是培养的优化，由此应将杂交瘤细胞从含有无血清培养基的血清中进行适应，以简化mAb的纯化。此外，所述mAb应该被纯化，经生物物理学鉴定并且用于测定或用于免疫染色中。
[0275]表1:Α β 11(ρΕ)和修饰的A β -肽的氨基酸序列
[0276]灰色标记的肽A βρΕ (11-23)含有在N-末端具有焦谷氨酸的靶序列
【权利要求】
1.抗体，特征在于其结合ΑβpGlu(ll)肽或其变体,优选以高亲和性结合。
2.权利要求1的抗体，其中所述高亲和性是指解离常数(Kd)值为KT7M或者更好。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
4.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体轻链的可变部分具有SEQID NO:51的核苷酸序列或者SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
5.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体重链的可变部分具有SEQID NO:53的核苷酸序列或者SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
6.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体轻链的可变部分具有SEQID NO:51的核苷酸序列或者SEQ ID NO: 52的氨基酸序列，及其中所述抗体重链的可变部分具有SEQ IDNO:53的核苷酸序列或者SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
7.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体是Aβ 13-11-6(保藏号DSM ACC3100)或者其功能变体。
8.权利要求7的抗体，其中所述抗体是Aβ 13-11-6(保藏号DSM ACC3100)。
9.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体是保留高亲和性的人源化或嵌合抗体、或者抗体片段。
10.前述任一项的 抗体，用于检测AiipGlU(Il)肽或其变体。
11.权利要求10的抗体,其中所述变体选自:
pGlu-Αβ n_38
pGlu-Αβ n_40
pGlu-Αβ n-42，及 pGlu-Αβ n_x 变体 其中X是18-42之间的整数，更优选是30-42之间的整数。
12.前述任一项权利要求的抗体，其是人抗体。
13.前述任一项权利要求的抗体，其是保留高亲和性的双抗体或者单链抗体。
14.前述任一项权利要求的抗体，其结合由权利要求11定义的抗体所结合的表位。
15.前述任一项权利要求的抗体，其具有权利要求11定义的抗体的互补决定区。
16.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体的轻链的可变部分具有一或多个如一个、两个或三个互补决定区，所述互补决定区与具有SEQ ID NO:51的核苷酸序列或SEQ IDNO:52的氨基酸序列的轻链可变部分的抗体的一或多个如一个、两个或三个互补决定区相同。
17.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体的轻链的可变部分具有一或多个如一个、两个或三个互补决定区，所述互补决定区与具有SEQ ID NO:53的核苷酸序列或SEQ IDNO:54的氨基酸序列的重链可变部分的抗体的一或多个如一个、两个或三个互补决定区相同。
18.前述任一项权利要求的抗体，其是经标记的。
19.前述任一项权利要求的抗体，其被固定化在固相上。
20.可得自杂交瘤细胞系DSMACC3100的抗体。
21.包含如前述任何权利要求定义的抗体的组合物。
22.权利要求21的组合物，用于治疗、预防或者延缓淀粉状变性。
23.权利要求21或22的组合物，其中所述淀粉状变性是神经变性疾病，所述神经变性疾病选自:唐氏综合征中的神经变性、轻度认知损伤和阿尔兹海默病。
24.权利要求21或22的组合物，其中所述淀粉状变性是散发性阿尔兹海默病或者家族性阿尔兹海默痴呆。
25.权利要求24的组合物，其中所述家族性阿尔兹海默痴呆是家族性英国型痴呆或者家族性丹麦型痴呆。
26.杂交瘤细胞系DSMACC3100。
27.权利要求1-20任一项的抗体或者权利要求21-25任一项的组合物在诊断或治疗方法中的应用。
28.权利要求27的应用，其用于诊断淀粉状蛋白相关疾病或病症。
29.权利要求28的应用，其中所述淀粉状变性是神经变性疾病，所述神经变性疾病选自唐氏综合征中的 神经变性、轻度认知损伤和阿尔兹海默病。
30.权利要求28的应用，其中所述淀粉状变性是散发性阿尔兹海默病或者家族性阿尔兹海默痴呆。
31.权利要求28的应用，其中所述家族性阿尔兹海默痴呆是家族性英国型痴呆或者家族性丹麦型痴呆。
32.用于诊断淀粉状蛋白相关疾病或病症、特别是阿尔兹海默病的体外诊断方法，包括如下步骤: 将权利要求1-20任一项的抗体与来自怀疑患有所述疾病或病症的对象的样品接触，及 检测所述抗体与来自所述样品的A β pGlu (11)蛋白的结合。
33.诊断试剂盒，包含权利要求1-20任一项的抗体及使用说明书，及任选存在的-(a)进一步的生物活性物质。
34.权利要求33的诊断试剂盒，其中所述进一步的生物物质是谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂。
35.选自SEQID NO:26至50的寡核苷酸。
【文档编号】G01N33/68GK103459421SQ201280013607
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年3月16日 优先权日:2011年3月16日
【发明者】M·克莱因施密特, S·席林, J-U·拉费尔德, H-U·德穆特, K·埃贝尔曼 申请人:前体生物药物股份公司