链霉亲和素结合磁性粒子及其制造方法

链霉亲和素结合磁性粒子及其制造方法
【专利摘要】本发明提供生物素结合能力高的链霉亲和素结合磁性粒子及其制造方法。链霉亲和素结合磁性粒子的特征在于，具有在磁性粒子上链霉亲和素彼此发生交联的结构。链霉亲和素结合磁性粒子的制造方法包含以下工序（1）制备含有表面具有氨基的磁性粒子的悬浮液的工序；和（2）在工序（1）中制备的悬浮液中、在链霉亲和素存在下添加戊二醛、使磁性粒子与链霉亲和素及戊二醛发生反应的工序。本发明的链霉亲和素结合磁性粒子及通过本发明的制造方法制造的链霉亲和素结合磁性粒子在临床诊断上是有用的。
【专利说明】链霉亲和素结合磁性粒子及其制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及链霉亲和素结合磁性粒子(链霉亲和素偶联磁性粒子)及其制造方法、使用该链霉亲和素结合磁性粒子制造的蛋白质结合磁性粒子(蛋白质偶联磁性粒子)及其制造方法、测定对象成分的测定方法以及测定对象成分的测定用试剂。
【背景技术】
[0002]在诊断药物中，为了检测激素、癌标记物、感染症标记物等检查对象物质，作为固相载体经常使用磁性粒子。在这种测定体系中，抗体或抗原(一次探针)等结合在磁性粒子上，与检体中的测定对象物质结合后，再通过与利用荧光物质或化学发光底物、酶等标记了的二次探针结合，定性地或定量地检测测定对象物质。
[0003]另外，近年来，因要对应于疾病的早期发现、检查的高精度化、高灵敏度微量标记物等，要求检查的高灵敏度化。进而，由于以患者服务为目的的检查结果的迅速输出、伴随检查中心化的大量处理化等,也要求检查的迅速性。
[0004]于是，作为实现这种使用了磁性粒子的测定体系的高灵敏度化和迅速化的手段，经常使用在液相中使一次探针和二次探针反应、接着使其结合在磁性粒子上的方法。代表性的例子有如下的方法:使在一次探针上结合有生物素而成的生物素标记一次探针与试样中的测定对象成分及二次探针发生反应，形成由生物素标记一次探针-测定对象成分-二次探针构成的复合体，接着使抗生物素蛋白结合磁性粒子作用，通过抗生物素蛋白-生物素相互作用，使该复合体结合在磁性粒子上。
[0005]对于这种抗生物素蛋白结合磁性粒子，使用了具有与抗生物素蛋白相同性质的链霉亲和素的链霉亲和素结合磁性粒子更为有用。链霉亲和素与抗生物素蛋白同样地与生物素非常强地结合，具有比抗生物素蛋白更耐变性的特性。另外，关于等电点，由于抗生物素蛋白为碱性、而链霉亲和素为弱酸性或中性，因此可知与其他蛋白质的非特异性结合很少这一优点。利用了该链霉亲和素的链霉亲和素结合磁性粒子在很多用途中被加以利用。
[0006]但是，能够结合于磁性粒子上的链霉亲和素的量有限，为了获得每I次测试的试剂所需的生物素结合能力，必须使用大量的链霉亲和素结合磁性粒子，具有耗费制造成本等问题。进而，在使用链霉亲和素结合磁性粒子的测定中具有以下的问题。
[0007](I)磁性粒子由于在静置条件下会沉淀，因此在使用时有必要使其分散，但如果粒子量很多，则为了分散需要花费时间和劳力
[0008](2)如果粒子量多，则在利用磁铁使其靠近容器的单侧时，其体积会增大，对在B/F分离及洗涤时被封闭在内部的反应液进行洗涤的效率会降低
[0009](3)在检测测定对象成分时，如果磁性粒子量多，则会因磁性粒子其本身的着色而导致浊度增加，例如在利用化学发光或荧光进行的检测中会由于光学性的遮蔽而使灵敏度降低。
[0010]另外，在抑制链霉亲和素结合磁性粒子的量、使生物素结合能力处于必要最小限的状态下，有可能因为与存在于检体中的生物素(维生素H)竞争而使测定中的反应受阻、无法获得正确的检查值。生物素有时作为营养剂进行服用、作为药剂进行给药，经常会被指出有这种问题。
[0011]另一方面，作为其解决手段提出了数个方法。一个是为了增加单位磁性粒子重量的表面积，有减小粒子粒径的方法。但具有下述问题:如果减小粒径，则利用磁铁回收粒子的时间大幅延长，或洗涤工序中的洗涤液的喷吐、吸引操作中粒子变得容易流动等。专利文献I记载了一种对检体中的检测对象物质进行分离的方法，其中，使用利用温度应答性高分子将表面修饰过的磁性粒子，即便是对于平均粒径为50?1，OOOnm的磁性粒子，也可以通过利用温度应答性高分子的粒子凝集而将磁性粒子从水溶液中回收。这种粒子具有因磁性粒子减小所带来的反应中的优点，但另一方面具有粒子表面被温度应答性高分子覆盖所导致的非特异性吸附，而且具有为了使其凝集而替换成特殊条件下的工序。
[0012]另外，还提出了为了增大不溶性载体的表面积而进行多孔质化的方法。例如，在专利文献2中记载了在磁性粒子的外层化学地形成多孔质的层的方法，该方法中，在抗原与抗体的免疫反应或者在DNA之间或DNA与RNA的杂交中，单位表面积的结合能提高，但孔内的反应效率差，难以获得所期待的性能。
[0013]现有技术文献
[0014]专利文献
[0015]专利文献1:日本特开2009-28711号公报
[0016]专利文献2:日本特开2006-307126号公报

【发明内容】

[0017]发明要解决的课题
[0018]本发明的目的在于提供生物素结合能力高的链霉亲和素结合磁性粒子及其制造方法。另外，本发明的其他目的在于提供使用生物素结合能力高的链霉亲和素结合磁性粒子制造的蛋白质结合磁性粒子及其制造方法、测定对象成分的测定方法以及测定对象成分的测定用试剂。
[0019]用于解决课题的手段
[0020]本
【发明者】们为了解决本课题而进行了深入研究，结果发现，通过在含有表面具有氨基的磁性粒子的悬浮液中在链霉亲和素存在下添加戊二醛，使磁性粒子与链霉亲和素及戊二醛反应，从而可获得生物素结合能力高的链霉亲和素结合磁性粒子，由此完成了本发明。即，本发明涉及以下的[I]?[12]。
[0021][I] 一种链霉亲和素结合磁性粒子，其特征在于，其具有在磁性粒子上链霉亲和素彼此发生交联的结构。
[0022][2]上述[I]所述的链霉亲和素结合磁性粒子，其通过包含以下工序的方法制造:
[0023](I)制备含有表面具有氣基的磁性粒子的悬浮液的工序；和
[0024](2)在工序(I)中制备的悬浮液中、在链霉亲和素存在下添加戊二醛、使磁性粒子与链霉亲和素及戊二醛发生反应的工序。
[0025][3]上述[2]所述的链霉亲和素结合磁性粒子，其通过还包含以下工序(3)的方法制造:
[0026](3)使工序(2)中制备的链霉亲和素结合磁性粒子与还原剂发生反应的工序。[0027][4] 一种蛋白质结合磁性粒子，其使用上述[I]?[3]任一项所述的链霉亲和素结合磁性粒子和生物素化蛋白质来制造。
[0028][5] 一种试样中的测定对象成分的测定方法，其特征在于，使用上述[4]所述的蛋白质结合磁性粒子。
[0029][6] 一种试样中的测定对象成分的测定方法，其特征在于，使用上述[I]?[3]任一项所述的链霉亲和素结合磁性粒子和生物素化蛋白质。
[0030][7] 一种试样中的测定对象成分的测定用试剂，其特征在于，含有上述[4]所述的蛋白质结合磁性粒子。
[0031][8] 一种试样中的测定对象成分的测定用试剂，其特征在于，含有上述[I]?[3]任一项所述的链霉亲和素结合磁性粒子和生物素化蛋白质。
[0032][9] 一种链霉亲和素结合磁性粒子的制造方法，其特征在于，包含以下工序:
[0033](I)制备含有表面具有氣基的磁性粒子的悬浮液的工序；和
[0034](2)在工序(I)中制备的悬浮液中、在链霉亲和素存在下添加戊二醛、使磁性粒子与链霉亲和素及戊二醛发生反应的工序。
[0035][10]上述[9]所述的制造方法，其还包含以下的工序(3):
[0036](3)使工序(2)中制备的链霉亲和素结合磁性粒子与还原剂发生反应的工序。
[0037][11] 一种蛋白质结合磁性粒子的制造方法，其特征在于，包含以下工序:
[0038](I)制备含有表面具有氣基的磁性粒子的悬浮液的工序；
[0039]( 2)在工序(I)中制备的悬浮液中、在链霉未和素存在下添加戍_fe以制备链霉未和素结合磁性粒子的工序；以及
[0040](3)使工序(2)中制备的链霉亲和素结合粒子与生物素化蛋白质发生反应的工序。
[0041][12] 一种蛋白质结合磁性粒子的制造方法，其特征在于，包含以下工序:
[0042](I)制备含有表面具有氣基的磁性粒子的悬浮液的工序；
[0043]( 2)在工序(I)中制备的悬浮液中、在链霉未和素存在下添加戍_fe以制备链霉未和素结合磁性粒子的工序；
[0044](3)使工序(2)中制备的链霉亲和素结合磁性粒子与还原剂发生反应的工序；以及
[0045](4)使工序(3)中制备的链霉亲和素结合磁性粒子与生物素化蛋白质发生反应的工序。
[0046]发明效果
[0047]通过本发明，可以提供生物素结合能力高的链霉亲和素结合磁性粒子及其制造方法、使用该链霉亲和素结合磁性粒子制造的蛋白质结合磁性粒子及其制造方法、测定对象成分的测定方法以及测定对象成分的测定用试剂。通过本发明的制造方法制造的链霉亲和素结合磁性粒子及蛋白质结合磁性粒子以及本发明的测定对象成分的测定方法及测定对象成分的测定用试剂在临床诊断上是有用的。
【专利附图】

【附图说明】
[0048]图1为表示本发明的链霉亲和素结合磁性粒子和市售的链霉亲和素结合磁性粒子中的磁性粒子上的链霉亲和素结构的SDS-PAGE的电泳图像。泳道I表示分子量标记物，泳道2表示链霉亲和素，泳道3表示生物素结合能力为2.61pmol/mm2的链霉亲和素结合磁性粒子，泳道4表示生物素结合能力为4.95pmol/mm2的链霉亲和素结合磁性粒子，泳道5表示生物素结合能力为6.76pmol/mm2的链霉亲和素结合磁性粒子，泳道6表示市售的链霉亲和素结合磁性粒子Dynabeads Tl (Dynal公司制),泳道7表示市售的链霉亲和素结合磁性粒子BE-M08/10 (Merck公司制)。条带A表示单体,条带B表示二聚体,条带C表示三聚体，条带D表示四聚体,条带E表示高级交联体。
[0049]图2为表示本发明的链霉亲和素结合磁性粒子的分散性的照片。上方表示静置状态的链霉亲和素结合磁性粒子，下方表示颠倒混合25次后的链霉亲和素结合磁性粒子的分散状态。
【具体实施方式】
[0050]1.链霉亲和素结合磁性粒子
[0051]本发明的链霉亲和素结合磁性粒子的特征在于，具有在磁性粒子上链霉亲和素彼此发生交联的结构。链霉亲和素取四聚体结构，单体之间通过非共价键结合。本发明的链霉亲和素结合磁性粒子中，在磁性粒子上，该四聚体结构的链霉亲和素彼此介由戊二醛发生共价键合而取交联结构。链霉亲和素介由戊二醛与磁性粒子的氨基键合。更详细地说，四聚体结构的链霉亲和素中的一部分介由戊二醛与磁性粒子的氨基键合。该链霉亲和素的交联结构例如可如下确认:将链霉亲和素结合磁性粒子置换成1%的SDS溶液，在60°C下处理I小时，从而使结合于磁性粒子上的链霉亲和素的子单元间的结合解离，利用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)、凝胶过滤HPLC等进行确认。SDS-PAGE是通过电泳依据大小对蛋白质进行分离的方法，是使用SDS将试样变性后将变性的蛋白质供至聚丙烯酰胺凝胶电泳、由所得的电泳图像进行蛋白质的分离、鉴定的方法。作为SDS-PAGE，只要是能够确认链霉亲和素的交联结构的方法则无特别限定，例如可举出*実験4 7 卜
K (生物实验画刊)5 (细胞工学增刊秀润社)所记载的方法等。
[0052]在SDS-PAGE中，四聚体结构的链霉亲和素通过SDS存在下的变性处理，其四聚体结构被拆开。如果磁性粒子上的链霉亲和素彼此未取交联结构，则通过SDS存在下的变性处理所获得的分解物仅变为链霉亲和素来源的单体。另一方面，如果磁性粒子上的链霉亲和素彼此取交联结构，则通过SDS存在下的变性处理，不仅获得链霉亲和素来源的单体，还获得与链霉亲和素的交联结构有关的二聚体、三聚体、进而高级的多聚体。因此，在通过SDS-PAGE可见链霉亲和素来源的单体、二聚体、三聚体及高级的多聚体所产生的条带时，即是在磁性粒子上形成了链霉亲和素的交联结构。
[0053]本发明的链霉亲和素结合磁性粒子由于具有在磁性粒子上链霉亲和素彼此发生交联的结构，因此生物素结合能力高。本发明链霉亲和素结合磁性粒子的单位粒子的生物素结合能力通常为0.5?10pmol/mm2,优选为2?9pmol/mm2,特别优选为4?8pmol/mm2。本发明的链霉亲和素结合磁性粒子还具有分散性良好的优异性质。链霉亲和素结合磁性粒子的分散性例如可通过将保存在比色皿中并沉降的状态的链霉亲和素结合磁性粒子颠倒混合后利用目视确认比色皿内的状态等来进行评价。
[0054]对于本发明的链霉亲和素结合磁性粒子的单位粒子的生物素结合能力，只要是可测定生物素结合能力的方法，则可利用所有方法进行测定，例如可以使进行了一定量的荧光标记的生物素与一定量的链霉亲和素结合磁性粒子反应，利用磁铁收集链霉亲和素结合磁性粒子后，采集一定量的上清，测定所采集的上清的荧光强度，通过使所得测定值与预先制作的表示荧光强度与生物素浓度的关系的标准曲线相比对来进行计算。
[0055]本发明的链霉亲和素结合磁性粒子中，链霉亲和素可以是天然来源者，也可以是基因重组体，优选基因重组体。
[0056]本发明的链霉亲和素结合磁性粒子中，固定链霉亲和素的磁性粒子是表面具有氨基的磁性粒子。本发明中的表面具有氨基的磁性粒子只要是可制造本发明的链霉亲和素结合磁性粒子的物质则无特别限定。作为本发明中的表面具有氨基的磁性粒子的粒子结构，例如可举出粒子的内部含有磁性体、外层由有机聚合物等构成的核-壳结构的磁性粒子；不含外层、磁性体不均匀地分散于有机聚合物而成的结构的磁性粒子；仅由磁性体构成的簇状磁性粒子等。作为表面具有氨基的磁性粒子的具体例子(市售品)，例如可举出氨基型Estapor磁性粒子(Merck公司制)等。
[0057]磁性粒子中含有的磁性体优选残留磁化少、超常磁性的磁性体微粒，例如可使用四氧化二铁(Fe304)、Y-二氧化二铁(Y-Fe2O3)等各种铁素体、铁、猛、钻、络等金属或这些金属的合金等。
[0058]有机聚合物和磁性体构成的磁性粒子中的磁性体的含量是，在磁性粒子整体重量中所占的比例优选为10重量％以上，更优选为30?60重量％。
[0059]作为磁性粒子的形状，例如可举出球状、针状等，优选球状。磁性粒子的粒径例如可举出0.1?5μηι等，优选为0.5?3 μ m。
[0060]2.链霉亲和素结合磁性粒子的制造方法
[0061]本发明的链霉亲和素结合磁性粒子的制造方法为含有以下工序的制造方法。
[0062](I)制备含有表面具有氣基的磁性粒子的悬浮液的工序；和
[0063](2)在工序(I)中制备的悬浮液中、在链霉亲和素存在下添加戊二醛、使磁性粒子与链霉亲和素及戊二醛发生反应的工序。
[0064]通过使用本发明的制造方法，可以制造本发明的链霉亲和素结合磁性粒子。
[0065]( I)制备含有磁性粒子的悬浮液的工序
[0066]含有表面具有氨基的磁性粒子的悬浮液可通过将表面具有氨基的磁性粒子添加至水性介质中或者通过在水性介质中添加表面具有氨基的磁性粒子来制备。作为表面具有氨基的磁性粒子，例如可举出前述的表面具有氨基的磁性粒子等。作为水性介质，只要是可悬浮表面具有氨基的磁性粒子的水性介质则无特别限定，例如可举出蒸馏水、精制水、缓冲液等。水性介质的PH通常为pH4.5?7，优选pH5?6。作为水性介质使用缓冲液时，优选使用对应所设定的PH的缓冲剂。作为缓冲液中使用的缓冲剂，例如可举出醋酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、琥珀酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、Good缓冲剂等。
[0067]作为Good缓冲剂，例如可举出2-吗啉代乙磺酸(MES)、双(2-羟基乙基)亚氨基三(羟基甲基)甲烷(Bis-Tris)、哌嗪-N，N’ -双(2-乙磺酸)(PIPES),N- (2-乙酰胺)_2_氨基乙磺酸(ACES)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、N, N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)、N-〔三(羟基甲基)甲基〕_2_氨基乙磺酸(TES)、2_〔4- (2-羟基乙基)-1-哌嗪基〕乙磺酸(HEPES)、3-〔N，N-双(2-羟基乙基)氨基〕-2-羟基丙磺酸(DIPS0)、N-〔三(羟基甲基)甲基〕-2-羟基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)等。[0068]另外，在水性介质中悬浮的表面具有氨基的磁性粒子还可以事先经洗涤。表面具有氨基的磁性粒子的洗涤例如可如下进行:在容器内将表面具有氨基的磁性粒子添加于分散液中，使表面具有氨基的磁性粒子分散后，通过磁铁收集表面具有氨基的磁性粒子，对残留于容器内的分散液进行吸引而将其除去。作为分散液，例如可举出含有表面活性剂的水溶液等。作为分散液的PH，通常为pH4.5?7，优选为pH5?6。作为水溶液中使用的水性介质，例如可举出前述的水性介质等。作为表面活性剂，只要是可分散磁性粒子则无特别限定，例如可举出阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性表面活性剂、非离子性表面活性剂等。表面活性剂在分散液中的浓度只要是可分散磁性粒子的浓度则无特别限定，例如为0.01?5.0%。
[0069](2)磁性粒子与戊二醛及链霉亲和素的反应工序
[0070]工序(2)是下述的工序:在含有工序(I)中制备的含有表面具有氣基的磁性粒子的悬浮液中，在链霉亲和素存在下添加戊二醛，使磁性粒子与链霉亲和素及戊二醛发生反应，从而形成在磁性粒子上链霉亲和素交联而成的结构。链霉亲和素交联而成的结构通过链霉亲和素彼此介由戊二醛进行共价键合而形成。这里，在链霉亲和素存在下添加戊二醛是指添加戊二醛时存在有链霉亲和素，还包含将链霉亲和素添加于磁性粒子的悬浮液中后连续地添加戊二醛的情形、将戊二醛和链霉亲和素同时添加至磁性粒子的悬浮液中的情形。
[0071]所添加的戊二醛的量只要是可制造本发明的链霉亲和素结合磁性粒子的量则无特别限定，通常相对于磁性粒子IOOmg为0.1?1.0mg,优选为0.35?0.6mg。
[0072]所添加的链霉亲和素的量只要是可制造本发明的链霉亲和素结合磁性粒子的量则无特别限定，通常相对于磁性粒子IOOmg为0.2?25mg,优选为10?15mg。
[0073]反应液中的磁性粒子的浓度只要是可制造本发明的链霉亲和素结合磁性粒子的浓度则无特别限定，通常为20?80mg/mL,优选为40?60mg/mL。
[0074]反应温度通常为O?40°C，优选为27.5?37.5°C，特别优选为35°C。反应时间通常为4?24小时，优选为8?20小时，特别优选为18小时。
[0075]工序(2)中获得的反应混合物其本身也可作为本发明的链霉亲和素结合磁性粒子使用，但通过磁铁收集工序(2 )所得反应混合物中的磁性粒子、将除磁性粒子以外的溶液除去后、利用洗涤液进行洗涤所获得的磁性粒子也可作为本发明的链霉亲和素结合磁性粒子使用。作为洗涤液，只要是能够洗涤除本发明的链霉亲和素结合磁性粒子以外的物质的洗涤液则无特别限定，例如可举出前述的水性介质等。另外，含有蛋白质或防腐剂的水性介质也可作为洗涤液使用。作为蛋白质，例如可举出牛血清白蛋白(BSA)等。作为防腐剂，例如可举出叠氮化钠等。另外，经洗涤的磁性粒子也可悬浮在保存用溶液中进行保存。作为保存用溶液，只要是能够稳定地保存本发明的链霉亲和素结合磁性粒子的溶液则无特别限定，例如可举出在中性?弱酸性的缓冲液中含有牛血清白蛋白(BSA)等蛋白质的水溶液等。
[0076]本发明的链霉亲和素结合磁性粒子的制造方法在工序(2 )之后还可以含有还原反应工序。该还原反应工序是工序(2)所制备的链霉亲和素结合磁性粒子与还原剂反应的工序。通过工序(2)，在磁性粒子上形成交联结构的链霉亲和素，但所形成的交联结构的链霉亲和素由于含有席夫碱(亚胺)，因此通过利用还原剂将该席夫碱(亚胺)还原，可制成更为稳定的交联结构。[0077]作为还原反应工序中的链霉亲和素结合磁性粒子，可以使用工序(2)的反应混合物本身，还可使用经洗涤的磁性粒子。链霉亲和素结合磁性粒子与还原剂的反应中使用的溶剂只要是可使还原反应进行的溶剂则无特别限定，例如可举出前述的分散液等。另外，含有有机溶剂的分散液也可作为还原反应的溶剂使用。作为有机溶剂，只要是在水中可溶性的、能够使还原反应进行的有机溶剂则无特别限定，例如可举出甲醇、乙醇、四氢呋喃等。作为还原剂，只要是将席夫碱(亚胺)还原、可保持交联结构的还原剂则无特别限定，例如可举出硼烷系的还原剂等。作为硼烷系的还原剂，例如可举出2-甲基吡啶硼烷、硼氢化钠等。还原剂的添加量通常为磁性粒子的0.0001?0.1 (w/w) %，优选为0.0005?0.05 (w/w) %，特别优选为0.001 (w/w) %。
[0078]还原反应的反应温度通常为30?50°C，优选为35?45°C，特别优选为40°C。还原反应的反应时间通常为2天?10天，优选为5天?8天，特别优选为6天。
[0079]还原反应后，磁性粒子可通过磁铁与除磁性粒子以外的溶液成分分离。经分离的磁性粒子例如可利用前述的分散液或经稀释的保存用溶液进行洗涤，进而悬浮在保存用溶液中进行保存。作为保存用溶液，只要是可稳定地保存本发明的链霉亲和素结合磁性粒子的溶液则无特别限定，例如可举出前述的保存用溶液等。
[0080]3.蛋白质结合磁性粒子的制造方法
[0081]本发明的蛋白质结合磁性粒子使用本发明的链霉亲和素结合磁性粒子和生物素化蛋白质来制造。通过磁性粒子上的链霉亲和素与结合于蛋白质的生物素的相互作用，蛋白质结合在磁性粒子上。
[0082]本发明的蛋白质结合磁性粒子例如可通过含有以下工序的方法进行制造。以下示出本发明的蛋白质结合磁性粒子的制造方法的具体方式。
[0083].蛋白质结合磁性粒子的制造方法I
[0084](I)制备含有表面 具有氣基的磁性粒子的悬浮液的工序；
[0085](2)在工序(I)中制备的悬浮液中、在链霉亲和素存在下添加戊二醛以制备链霉亲和素结合磁性粒子的工序；以及
[0086](3)使工序(2)中制备的链霉亲和素结合粒子与生物素化蛋白质发生反应的工序。
[0087]?蛋白质结合磁性粒子的制造方法2
[0088](I)制备含有表面具有氣基的磁性粒子的悬浮液的工序；
[0089]( 2)在工序(I)中制备的悬浮液中、在链霉未和素存在下添加戍_ fe以制备链霉未和素结合磁性粒子的工序；
[0090](3)使工序(2)中制备的链霉亲和素结合磁性粒子与还原剂发生反应的工序；以及
[0091](4)使工序(3)中制备的链霉亲和素结合磁性粒子与生物素化蛋白质发生反应的工序。
[0092]链霉亲和素结合磁性粒子与生物素化蛋白质的反应只要是蛋白质结合于磁性粒子上的条件则可以是任何条件。反应温度通常为25?50°C，优选为30?40°C。反应时间通常为30分钟?24小时，优选为2?18小时。
[0093]作为蛋白质，可以举出与测定对象成分结合的抗体、在抗原抗体反应中与测定对象成分竞争的竞争物质等。作为竞争物质，例如可举出测定对象成分、含有与测定对象成分结合的抗体所识别的表位的物质等。作为蛋白质的具体例子，可举出IgG、抗IgG抗体、IgM、抗IgM抗体、IgA、抗IgA抗体、IgE、抗IgE抗体、载脂蛋白Al、抗载脂蛋白Al抗体、载脂蛋白AU、抗载脂蛋白AII抗体、载脂蛋白B、抗载脂蛋白B抗体、载脂蛋白E、抗载脂蛋白E抗体、类风湿因子、抗类风湿因子抗体、D- 二聚物、抗D- 二聚物抗体、氧化LDL、抗氧化LDL抗体、糖化LDL、抗糖化LDL抗体、糖化白蛋白、抗糖化白蛋白抗体、三碘甲状腺原氨酸(T3 )、抗T3抗体、总甲状腺素(T4)、抗T4抗体、药剂(抗癫痫药等)、结合于药剂的抗体、C-反应性蛋白(CRP)、抗CRP抗体、细胞因子类、结合于细胞因子类的抗体、α -胎蛋白(AFP)、抗AFP抗体、癌胚抗原(CEA)、抗 CEA 抗体、CA19-9、抗 CA19-9 抗体、CA15-3、抗 CA15-3 抗体、CA-125、抗CA-125抗体、PIVKA-11、抗PIVKA-1I抗体、甲状旁腺素(ΡΤΗ)、抗PTH抗体、人体绒毛膜促性腺激素(hCG)、抗hCG抗体、促甲状腺激素(TSH)、抗TSH抗体、胰岛素、抗胰岛素抗体、C-缩氨酸、抗C-缩氨酸抗体、雌激素、抗雌激素抗体、成纤维细胞生长因子-23(FGF-23)、抗FGF-23抗体、谷氨酸脱羧酶(GAD )、抗GAD抗体、胃蛋白酶原、抗胃蛋白酶原抗体、B型肝炎病毒(HBV)抗原、抗HBV抗体、C型肝炎病毒(HCV)抗原、抗HCV抗体、成人T细胞性白血病病毒I型(HTLV-1)抗原、抗HTLV-1抗体、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、抗HIV抗体、流感病毒抗原、抗流感病毒抗体、结核菌抗原(TBGL)、抗结核菌抗体、支原体抗原、抗支原体抗体、血红蛋白Ale、抗血红蛋白Alc抗体、心钠素(ANP)、抗ANP抗体、脑钠素(BNP)、抗BNP抗体、肌钙蛋白T、抗肌钙蛋白T抗体、肌钙蛋白1、抗肌钙蛋白I抗体、肌酸激酶MB (CK-MB)、抗CK-MB抗体、肌红蛋白、抗肌红蛋白抗体、L-FABP、抗L-FABP抗体、H-FABP、抗H-FABP抗体、CCP抗原、抗CCP抗体、SP-D、抗SP-D抗体、结合于霉菌毒素类[脱氧瓜萎镰菌醇(DON)、瓜萎镰菌醇(NIV)、T-2毒素(T2)等]的抗体、结合于内分泌干扰物质类[双酚A、壬基苯酚、邻苯二甲酸二丁酯、多氯联苯(PCB)类、二噁英类、p，p’ - 二氯二苯基三氯乙烷、三丁基锡等]的抗体、结合于类固醇激素类(醛固酮、睾酮等)的抗体、大肠杆菌等菌类、结合于菌类来源的蛋白质的抗体、食物过敏物质、螨虫类等过敏物质、抗过敏物质抗体等。
[0094]另外，除了生物素化蛋白质之外，还可使用生物素化烃系化合物或生物素化核酸。通过使本发明的链霉亲和素结合磁性粒子与生物素化烃系化合物发生反应，可以制造烃系化合物结合磁性粒子。另外，通过使本发明的链霉亲和素结合磁性粒子与生物素化核酸反应，可制造核酸结合磁性粒子。
[0095]作为生物素化烃系化合物中的烃系化合物，例如可举出霉菌毒素类[脱氧瓜萎镰菌醇(DON)、瓜萎镰菌醇(NIV)、T-2毒素(Τ2)等]、内分泌干扰物质类[双酚Α、壬基苯酚、邻苯二甲酸二丁酯、多氯联苯(PCB)类、二噁英类、ρ，ρ’ - 二氯二苯基三氯乙烷、三丁基锡等]、类固醇激素类(醛固酮、睾酮等)等。
[0096]作为生物素化核酸中的核酸，例如可举出DNA、RNA、适配子、它们的衍生物等。
[0097]4.测定对象成分的测定方法
[0098]本发明的测定对象成分的测定方法的I个方式为使用本发明的链霉亲和素结合磁性粒子和生物素化蛋白质来测定试样中的测定对象成分的方法。另外，本发明的测定对象成分的测定方法的另一方式为使用本发明的蛋白质结合磁性粒子来测定试样中的测定对象成分的方法。本发明的测定方法只要是在通常的免疫学测定方法中使用的方法则可以使用任何方法，可以举出夹心法、竞争法等。
[0099]作为生物素化蛋白质及蛋白质结合磁性粒子中的蛋白质，例如可举出与测定对象成分结合的抗体、抗原抗体反应中与测定对象成分竞争的竞争物质等。作为竞争物质，例如可举出测定对象成分、含有与测定对象成分结合的抗体所识别的表位的物质等。作为蛋白质的具体例子，例如可举出前述的蛋白质等。
[0100]作为本发明中的试样，只要是使本发明的测定对象成分的测定成为可能的试样则无特别限定，例如可举出全血、血浆、血清、脑脊髓液、唾液、羊水、尿、汗、胰液等，优选血浆、
血清等。
[0101]作为测定对象成分，只要是可利用本发明的测定方法进行测定的物质则无特别限定，例如可举出IgG、IgM、IgA、IgE、载脂蛋白Al、载脂蛋白AU、载脂蛋白B、载脂蛋白
E、类风湿因子、D-二聚物、氧化LDL、糖化LDL、糖化白蛋白、三碘甲状腺原氨酸(T3)、总甲状腺素(T4)、药剂(抗癫痫药等)、C-反应性蛋白(CRP)、细胞因子类、α-胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA 19-9, CA 15-3, CA-125、PIVKA-1 I,甲状旁腺素(ΡΤΗ)、人体绒毛膜促性腺激素(hCG)、促甲状腺激素(TSH)、胰岛素、C-缩氨酸、雌激素、成纤维细胞生长因子-23(FGF-23)、抗谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体、胃蛋白酶原、B型肝炎病毒(HBV)抗原、抗HBV抗体、C型肝炎病毒(HCV)抗原、抗HCV抗体、成人T细胞性白血病病毒I型(HTLV-1)抗原、抗HTLV-1抗体、人免疫缺陷病毒(HIV)抗体、流感病毒抗原、抗流感病毒抗体、抗结核菌抗体、结核菌抗原(TBGL)支原体抗体、血红蛋白Ale、心钠素(ANP)、脑钠素(BNP)、肌钙蛋白T、肌钙蛋白1、肌酸激酶MB (CK-MB)、肌红蛋白、L-FABP、H-FABP、抗CCP抗体、SP-D、霉菌毒素类[脱氧瓜萎镰菌醇(DON)、瓜萎镰菌醇(NIV)、T-2毒素(T2)等]、内分泌干扰物质类[双酚A、壬基苯酚、邻苯二甲酸二丁酯、多氯联苯(PCB)类、二噁英类、ρ，ρ’ - 二氯二苯基三氯乙烷、三丁基锡等]、类固醇激素类(醛固酮、睾酮等)、大肠杆菌等菌类、食物过敏物质、螨虫类等过敏物质、抗过敏物质抗体等。
[0102](I)使用本发明的链霉亲和素结合磁性粒子和生物素化蛋白质的测定对象成分的测定方法
[0103](1-1)夹心法
[0104]作为利用夹心法测定试样中的测定对象成分的方法，例如可举出含有以下工序的
方法等。
[0105](I)使试样中的测定对象成分在水性介质中与本发明的链霉亲和素结合磁性粒子、在与测定对象成分结合的第I抗体上结合有生物素的生物素化第I抗体及与测定对象成分结合的第2抗体发生反应，在磁性粒子上生成由与测定对象成分结合的第I抗体、测定对象成分及与测定对象成分结合的第2抗体构成的免疫复合体的工序；
[0106](2)通过磁力集中工序(I)后的反应混合物中的磁性粒子，将通过磁力集中的磁性粒子与除其以外的成分分离的工序；以及
[0107](3)对测定工序(2)中分离出的磁性粒子上的免疫复合体进行测定的工序。
[0108]还可代替第I抗体、第2抗体而分别使用第I抗体片段、第2抗体片段。作为抗体的片段，例如可举出Fab、F (ab’)2、Fab，等。
[0109]作为水性介质，只要是能够进行抗原抗体反应的水性介质则无特别限定，例如可举出前述的水性介质等。
[0110]工序(I)中，试样中的测定对象成分在水性介质中与链霉亲和素结合磁性粒子、生物素化第I抗体及第2抗体发生反应，在磁性粒子上生成由第I抗体、测定对象成分及第2抗体构成的免疫复合体。
[0111]这里，试样中的测定对象成分与链霉亲和素结合磁性粒子、生物素化第I抗体及第2抗体的反应只要是在磁性粒子上生成由第I抗体、测定对象成分及第2抗体构成的免疫复合体，则可以是任何反应，例如可以使试样中的测定对象成分与链霉亲和素结合磁性粒子及生物素化第I抗体发生反应，在磁性粒子上生成第I抗体和测定对象成分的免疫复合体之后，使第2抗体发生反应；也可以使试样中的测定对象成分与链霉亲和素结合磁性粒子、生物素化第I抗体及第2抗体同时地发生反应。在磁性粒子上生成由第I抗体和测定对象成分的免疫复合体之后使第2抗体发生反应时，在生成该免疫复合体之后还可设置洗涤工序。生成第I抗体和测定对象成分的免疫复合体之后的磁性粒子的洗涤只要是能够将该免疫复合体保持于磁性粒子上的洗涤，则无特别限定，例如可举出从在磁性粒子上生成测定对象成分和第I抗体的免疫复合体后的反应混合物中将除磁性粒子以外的成分除去，将洗涤液添加至残留有磁性粒子的反应容器中对磁性粒子进行洗涤的方法；在反应后的反应混合物中添加洗涤液的同时将除磁性粒子以外的成分除去来对磁性粒子进行洗涤的方法等。除磁性粒子以外的成分的除去例如可如下进行:利用磁力集中磁性粒子，对剩余成分进行吸引，从而进行。作为洗涤液，例如可举出前述的水性介质、在前述的水性介质中添加有表面活性剂的水性介质等。作为表面活性剂，例如可举出吐温(Tween) 20等非离子性表面活性剂等。
[0112]工序(I)的抗原抗体反应中的反应温度只要是能够测定本发明的测定对象成分的温度则无特别限定，通常为O?50°C，优选为4?45°C，特别优选为20?40°C。反应时间只要是使本发明的测定对象成分的测定成为可能的时间则无特别限定，通常为5分钟?I小时，优选为5?20分钟。
[0113]工序(2)中，通过磁力将工序(I)后的磁性粒子、即结合有由第I抗体、测定对象成分及第2抗体构成的免疫复合体的磁性粒子集中，所集中的磁性粒子与除其以外的成分分离。用于集中磁性粒子的磁力只要是使本发明的测定对象成分的测定成为可能的磁力则无特别限定。通过磁力集中的磁性粒子与除其以外成分的分离只要是使本发明的测定对象成分的测定成为可能的分离则无特别限定。
[0114]另外，还可包含在工序(2)之后或者是与工序(2)的同时对结合有由第I抗体、测定对象成分及第2抗体构成的免疫复合体的磁性粒子进行洗涤的工序。磁性粒子的洗涤例如可通过前述的方法等进行。
[0115]工序(3)中，通过对利用工序(2)分离出的磁性粒子上的免疫复合体进行测定，可以测定试样中的测定对象成分。作为免疫复合体的测定方法，例如可举出以下的方法等。
[0116]( I)第2抗体未被标记化的情况
[0117]使在结合于第2抗体的第3抗体上结合有标记的标记化第3抗体与结合有由第I抗体、测定对象成分及第2抗体构成的免疫复合体的磁性粒子发生反应，在磁性粒子上形成由第I抗体、测定对象成分、第2抗体及第3抗体构成的免疫复合体，通过对该免疫复合体中的标记进行测定，可以测定分离出的磁性粒子上的免疫复合体。还可代替第3抗体而使用第3抗体片段。作为结合于第2抗体的第3抗体，例如可举出结合于第2抗体的Fe区域的抗体或其片段等。标记的测定只要是能够测定分离出的磁性粒子上的免疫复合体的方法，则无特别限定，例如可举出化学发光的测定、荧光的测定、吸光度的测定等。作为抗体的片段，例如可举出Fab、F (ab’)2、Fab，等。
[0118](2)与测定对象成分结合的第2抗体经标记化的情况
[0119]通过对形成于磁性粒子上的由第I抗体、测定对象成分及标记化第2抗体构成的免疫复合体中的标记进行测定，可以测定分离出的磁性粒子上的免疫复合体。标记的测定只要是能够测定分离出的磁性粒子上的免疫复合体的方法，则无特别限定，例如可举出化学发光的测定、荧光的测定、吸光度的测定等。
[0120](A)化学发光的测定
[0121]化学发光的测定可通过以下的方法等进行。
[0122](A-1)标记为酶的情况
[0123]在标记为酶的情况下，例如可通过使与该酶反应而生成光的底物作用于标记化抗体或片段，利用发光强度计等对所生成的光(h V)的强度进行测定来进行。作为酶，只要是可与该酶的底物反应生成光的物质则无特别限定，例如可举出碱性磷酸酶、过氧化物酶、β -D-半乳糖苷酶、荧光素酶等。
[0124]作为酶使用碱性磷酸酶时，作为与碱性磷酸酶反应生成光的碱性磷酸酶的底物，例如可举出3- (2’ -螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4- (3’ -磷酰氧基)苯基-1，2- 二氧杂环丁烧.纳盐(AMPI3D)、2-氣-5_ {4-甲氧基螺[1,2- _氧杂环丁烧_3，2' - (5’-氣)二环[3.3.1.13,7]烷]-4-基}苯基磷酸盐.二钠盐(CDP-Star?)、3- {4-甲氧基螺[1，2_ 二氧杂环丁烷-3，2’- (5’-氯)三环[3.3.1.13，7]癸烷]_4_基}苯基磷酸盐.二钠盐(CSPD?)、[10-甲基-9 (IOH)-吖啶叉]苯氧基甲基磷酸.二钠盐(Lumigen? APS_5)、9_ (4-氯苯基硫代磷酰氧基甲叉)-10-甲基二氢吖啶.二钠盐等。
[0125]作为酶使用过氧化物酶时，作为与过氧化物酶反应生成光的过氧化物酶的底物，例如可举出过氧化氢与发光化合物(例如鲁米诺化合物、光泽精化合物等)的组合等。
[0126]作为酶使用β-D-半乳糖苷酶时，作为与β-D-半乳糖苷酶反应生成光的β -D-半乳糖苷酶的底物，例如可举出Galacton-Plus[Galacton-Plus、AppliedBiosystems公司制]等。
[0127]作为酶使用荧光素酶时,作为与荧光素酶反应生成光的荧光素酶的底物,例如可举出虫萤光素、腔肠素等。
[0128](A-2)标记为发光物质的情况
[0129]在标记为发光物质的情况下，例如可通过利用发光强度计等测定因所生成的免疫复合体中的发光物质所引起的光的强度来进行。作为发光物质，只要是能够进行本发明的测定的发光物质则无特别限定，例如可举出吖啶鎗及其衍生物、钌络合物化合物、洛粉碱
坐寸ο
[0130](B)荧光的测定
[0131]荧光的测定可通过以下的方法等进行。
[0132](B-1)标记为酶的情况
[0133]在标记为酶的情况下，例如可通过利用荧光强度计等对使得与该酶反应生成荧光的底物作用于标记化抗体或片段而生成的荧光的强度进行测定来进行。作为酶，只要是能够与该酶的底物反应生成荧光的物质则无特别限定，例如可举出过氧化物酶、β -D-半乳糖苷酶、葡糖醛酸酶等。[0134]作为酶使用过氧化物酶时，作为与过氧化物酶反应生成荧光的过氧化物酶的底物，例如可举出过氧化氢与荧光化合物[例如4-羟基苯基醋酸、3- (4-羟基苯基)丙酸、香豆素等]的组合等。
[0135]作为酶使用β-D-半乳糖苷酶时，作为与β-D-半乳糖苷酶反应生成荧光的β -D-半乳糖苷酶的底物，例如可举出4-甲基伞形酮酰-β -D-半乳糖苷或其类似化合物
[0136]作为酶使用葡糖醛酸酶时，作为与葡糖醛酸酶反应生成荧光的葡糖醛酸酶的底物，例如可举出TokyoGreeir.+GluU (积水Medical公司制)等。
[0137](B-2)标记为荧光物质的情况
[0138]在标记为荧光物质的情况下，例如可通过利用荧光强度计等测定因所生成的免疫复合体中的荧光物质所引起的荧光的强度来进行。作为荧光物质，只要是能够进行本发明的测定的荧光物质则无特别限定，例如可举出FITC (异硫氰酸荧光素)、RITC (异硫氰酸若丹明 B)、quantum dot (Science, 281, 2016-2018，1998)、藻红蛋白等藻胆蛋白、GFP (绿色突光蛋白，Greenfluorescent Protein)、RFP (红色突光蛋白，Red fluorescent Protein)、YFP (黄色突光蛋白，Yellow fluorescent Protein)、BFP (蓝色突光蛋白，BluefluorescentProtein)等。
[0139](C)吸光度的测定
[0140]吸光度的测定可通过以下的方法等进行。
[0141](C-1)标记为酶的情况
[0142]在标记为酶的情况下，例如可通过使用分光光度计或多孔板酶标仪等对使得与该酶反应生成色素的底物作用于标记化抗体或片段而生成的色素的吸光度进行测定来进行。作为酶，只要是能够与该酶的底物反应生成色素的物质则无特别限定，例如可举出过氧化物酶等。
[0143]作为酶使用过氧化物酶时，作为与过氧化物酶反应生成色素的过氧化物酶的底物，例如可举出过氧化氢与氧化显色型色原体的组合等。作为氧化显色型色原体，例如可举出隐色型色原体、氧化偶联显色型色原体等。
[0144]隐色型色原体是在过氧化氢和过氧化物酶等过氧化活性物质的存在下单独变换成色素的物质。具体地说，可举出四甲基联苯胺、邻苯二胺、IO-N-羧甲基氨基甲酰基-3，7-双(二甲基氨基)-1OH-吩噻嗪(CCAP)UO-N-甲基氨基甲酰基_3，7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、10-N-(羧甲基氨基羰基)_3，7-双(二甲基氨基)_10H_吩噻嗪钠盐(DA-67)、N，N，N，，N，，N’’，N’’ -六(3-磺丙基)_4，4’，4’’ -三氨基三苯基甲烷(TPM-PS)、N-(羧甲基氨基羰基)_4，4’ -双(二甲基氨基)二苯基胺钠盐(DA-64)、4，4’ -双(二甲基氨基)二苯基胺、双〔3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基〕胺(BCMA)等。
[0145]氧化偶联显色型色原体是在过氧化氢和过氧化物酶等过氧化活性物质的存在下、2个化合物经氧化偶联而生成色素的物质。作为2个化合物的组合，可举出偶联剂和苯胺类(Trinder试剂)的组合、偶联剂和苯酚类的组合等。作为偶联剂，例如可举出4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮肼等。作为苯胺类,可举出N- (3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N- (2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(T00S)、N-乙基-N- (2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MA0S)、N-乙基-N- (2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N- (2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N，N- 二甲基-3-甲基苯胺、N，N-双(3-磺丙基)_3，5- 二甲氧基苯胺、N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N- (3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N- (3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N- (3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N- (3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基_N_(2_羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N_(3_甲基苯基)-N’ -乙酰基乙二胺、N-乙基-N- (2-羟基-3-磺丙基)-4-氟-3，5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)等。作为苯酚类，可举出苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-羟基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
[0146]基于生成在磁性粒子上的免疫复合体的测定中的测定值的试样中测定对象成分浓度例如可通过以下的方法确定。
[0147]使用已知浓度的测定对象成分，进行上述工序(I)?工序(3)，制作表示测定对象成分的浓度与测定值(标记来源的信息量)的关系的标准曲线，接着使用待测定的试样进行测定，将所得测定值与预先制作的标准曲线比对，确定待测定的试样中的测定对象成分浓度。
[0148](1-2)竞争法 I
[0149]作为利用竞争法测定试样中的测定对象成分的方法，例如可举出含有以下工序的方法等。
[0150](I)使试样中的测定对象成分在水性介质中与本发明的链霉亲和素结合磁性粒子、在结合于测定对象成分及竞争物质这两者的抗体上结合有生物素的生物素化抗体、以及在竞争物质上结合有标记的标记化竞争物质发生反应的工序；和
[0151](2)对工序(I)中生成的与测定对象成分结合的抗体和标记化竞争物质的免疫复合体中的标记进行测定的工序。
[0152]在工序(I)之后，还可设置对抗原抗体反应后的磁性粒子进行洗涤的工序。磁性粒子的洗涤例如可通过前述洗涤方法等来进行。
[0153]工序(2)中的标记的测定例如可通过前述方法等来进行。
[0154]基于生成在磁性粒子上的免疫复合体的测定中的测定值的试样中测定对象成分浓度例如可通过以下的方法确定。
[0155]使用已知浓度的测定对象成分，进行上述工序(I)及工序(2)，制作表示测定对象成分的浓度与测定值(标记来源的信息量)的关系的标准曲线，接着使用待测定的试样进行测定，将所得测定值与预先制作的标准曲线比对，确定待测定的试样中的测定对象成分浓度。
[0156](1_3)竞争法 2
[0157]作为利用竞争法测定试样中的测定对象成分的方法，例如可举出含有以下工序的方法等。
[0158](I)使试样中的测定对象成分在水性介质中与本发明的链霉亲和素结合磁性粒子、在竞争物质上结合有生物素的生物素化竞争物质、以及在结合于测定对象成分和竞争物质这两者的抗体上结合有标记的标记化抗体发生反应的工序；和
[0159](2)对工序(I)中生成的竞争物质和标记化抗体的免疫复合体中的标记进行测定的工序。
[0160]在工序(I)之后，还可设置对抗原抗体反应后的磁性粒子进行洗涤的工序。磁性粒子的洗涤例如可通过前述洗涤方法等来进行。
[0161]工序(2)中的标记的测定例如可通过前述方法等来进行。
[0162]基于生成在磁性粒子上的免疫复合体的测定中的测定值的试样中测定对象成分浓度例如可通过以下的方法确定。
[0163]使用已知浓度的测定对象成分，进行上述工序(I)及工序(2)，制作表示测定对象成分的浓度与测定值(标记来源的信息量)的关系的标准曲线，接着使用待测定的试样进行测定，将所得测定值与预先制作的标准曲线比对，确定待测定的试样中的测定对象成分浓度。
[0164](II)本发明的使用蛋白质结合磁性粒子的测定对象成分的测定方法
[0165](I1-1)夹心法
[0166]作为利用夹心法测定试样中的测定对象成分的方法，例如可举出在本发明的蛋白质结合磁性粒子中使用与测定对象成分结合的抗体作为蛋白质的包含以下工序的方法等。
[0167](I)使试样中的测定对象成分在水性介质中与固定化有与测定对象成分结合的第I抗体的磁性粒子及与测定对象成分结合的第2抗体发生反应，在磁性粒子上生成由与测定对象成分结合的第I抗体、测定对象成分及与测定对象成分结合的第2抗体构成的免疫复合体的工序；
[0168]( 2)通过磁力集中工序(I)后的反应混合物中的磁性粒子，将通过磁力集中的磁性粒子和除其以外的成分分离的工序；以及
[0169](3)对测定工序(2)中分离出的磁性粒子上的免疫复合体进行测定的工序。
[0170]还可代替第I抗体、第2抗体而分别使用第I抗体片段、第2抗体片段。作为水性介质，只要是能够使抗原抗体反应成为可能的水性介质则无特别限定，例如可举出前述的水性介质等。
[0171]在工序(I)中，试样中的测定对象成分在水性介质中与磁性粒子上的第I抗体及第2抗体反应，在磁性粒子上生成由第I抗体、测定对象成分及第2抗体构成的免疫复合体。
[0172]这里，试样中的测定对象成分与磁性粒子上的第I抗体及第2抗体的反应只要是在磁性粒子上生成由第I抗体、测定对象成分及第2抗体构成的免疫复合体，则可以是任何反应，例如可以使试样中的测定对象成分与磁性粒子上的第I抗体反应，在磁性粒子上生成由第I抗体和测定对象成分的免疫复合体之后，使第2抗体反应；也可以使试样中的测定对象成分与磁性粒子上的第I抗体及第2抗体同时地反应。在磁性粒子上生成第I抗体和测定对象成分的免疫复合体之后使第2抗体反应时，还可在生成该免疫复合体之后设置洗涤工序。生成第I抗体和测定对象成分的免疫复合体之后的磁性粒子的洗涤只要是能够将该免疫复合体保持于磁性粒子上的洗涤，则无特别限定，例如可举出前述的洗涤方法等。
[0173]工序(I)的抗原抗体反应的反应温度只要是能够测定本发明的测定对象成分的温度则无特别限定，通常为O?50°C，优选为4?45°C，特别优选为20?40°C。反应时间只要是能够测定本发明的测定对象成分的时间则无特别限定，通常为5分钟?I小时，优选为5?20分钟。[0174]工序(2)及工序(3)与前述(1-1)的工序(2)及工序(3)相同。
[0175]基于生成在磁性粒子上的免疫复合体的测定中的测定值的试样中测定对象成分浓度例如可通过与前述(1-1)的情况相同的方法来确定。
[0176](11-2)竞争法 I
[0177]作为利用竞争法测定试样中的测定对象成分的方法，例如可举出在本发明的蛋白质结合磁性粒子中使用结合于测定对象成分及竞争物质这两者的抗体作为蛋白质的包含以下工序的方法等。
[0178](I)使试样中的测定对象成分在水性介质中与固定化有结合于测定对象成分及竞争物质这两者的抗体的磁性粒子及在竞争物质上结合有标记的标记化竞争物质发生反应的工序；和
[0179](2)对工序(I)中生成的与测定对象成分结合的抗体和标记化竞争物质的免疫复合体中的标记进行测定的工序。
[0180]在工序(I)之后，还可设置对抗原抗体反应后的磁性粒子进行洗涤的工序。磁性粒子的洗涤例如可通过前述的洗涤方法等来进行。
[0181]工序(2)中的标记的测定例如可通过前述的方法等来进行。
[0182]基于生成在磁性粒子上的免疫复合体的测定中的测定值的试样中的测定对象成分浓度例如可通过与前述(1-2)的情况相同的方法来确定。
[0183](11_3)竞争法 2
[0184]作为利用竞争法测定试样中的测定对象成分的方法，例如可举出在本发明的蛋白质结合磁性粒子中使用在抗原抗体反应中与测定对象成分竞争的竞争物质作为蛋白质的包含以下工序的方法等。
[0185]( I)使试样中的测定对象成分在水性介质中与固定化有竞争物质的磁性粒子及在结合于测定对象成分及竞争物质这两者的抗体上结合有标记的标记化抗体发生反应的工序；和
[0186](2)对工序(I)中生成的竞争物质和标记化抗体的免疫复合体中的标记进行测定的工序。
[0187]在工序(I)之后，还可设置对抗原抗体反应后的磁性粒子进行洗涤的工序。磁性粒子的洗涤例如可通过前述的洗涤方法等来进行。
[0188]工序(2)中的标记的测定例如可通过前述的方法等来进行。
[0189]基于生成在磁性粒子上的免疫复合体的测定中的测定值的试样中测定对象成分浓度例如可通过与前述(1-3)的情况相同的方法来确定。
[0190]另外，还可代替生物素化蛋白质而使用生物素化烃系化合物来测定试样中的测定对象成分。作为测定对象成分，例如可举出构成生物素化烃系化合物的烃系化合物或结合于该烃系化合物的抗体等。作为烃系化合物，例如可举出前述的烃系化合物等。使用了生物素化烃系化合物的试样中的测定对象成分的测定例如可使用前述的夹心法(1-1)或(I1-1)的方法、竞争法(1-3)或(I1-3)的方法等来进行。此时，代替夹心法(1-1)及(I1-1)的第I抗体而使用烃系化合物，作为竞争法(1-3)或(I1-3)中的竞争物质使用烃系化合物。
[0191]进而，还可代替生物素化蛋白质而使用生物素化核酸来测定试样中的测定对象成分。作为测定对象成分，例如可举出结合于构成生物素核酸的核酸上的核酸或蛋白质等。作为蛋白质，例如可举出前述的蛋白质等。使用了生物素化核酸的试样中的测定对象成分的测定可举出通常的核酸测定方法或前述的测定方法等。
[0192]5.测定对象成分的测定用试剂
[0193]本发明的测定对象成分的测定用试剂的I个方式是含有本发明的链霉亲和素结合磁性粒子和生物素化蛋白质的试剂。另外，本发明的测定对象成分的测定用试剂的另一方式为含有本发明的蛋白质结合磁性粒子的试剂。本发明的测定对象成分的测定用试剂用于本发明的测定对象成分的测定方法中。作为生物素化蛋白质及蛋白质结合磁性粒子中的蛋白，例如可举出前述的蛋白质等。
[0194]另外，还可使用含有本发明的链霉亲和素结合磁性粒子和生物素化烃系化合物的试剂、或含有由本发明的链霉亲和素结合磁性粒子和生物素化烃系化合物制造的烃系化合物结合磁性粒子的试剂来测定试样中的测定对象成分。作为测定对象成分，例如可举出构成生物素化烃系化合物的烃系化合物或结合于该烃系化合物的抗体等。作为烃系化合物，例如可举出前述的烃系化合物等。
[0195]进而，还可使用含有本发明的链霉亲和素结合磁性粒子和生物素化核酸的试剂、或含有由本发明的链霉亲和素结合磁性粒子和生物素化核酸制造的核酸结合磁性粒子的试剂来测定试样中的测定对象成分。作为测定对象成分，例如可举出结合于构成生物素核酸的核酸上的核酸或蛋白质等。作为蛋白质，例如可举出前述的蛋白质等。
[0196]本发明的测定用试剂中还可根据需要含有通常的免疫学测定方法中使用的免疫学测定用试剂所含的成分。作为该成分，例如可举出水性介质、盐类、金属离子、糖类、防腐齐U、非特异性反应抑制剂、表面活性剂、酶稳定化剂等。作为水性介质，例如可举出前述的水性介质等。作为盐类，例如可举出氯化锂、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化铵、溴化锂、溴化钠、溴化钾、溴化钙、溴化镁、溴化铵等。作为金属离子，例如可举出镁离子、锰离子、锌离子等。作为糖类，例如可举出甘露醇、山梨糖醇等。作为防腐剂，例如可举出叠氮化钠、抗生素(链霉素、青霉素、庆大霉素等)、BiOAce、PrOClin300等。作为非特异性反应抑制剂，例如可举出牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FBS)、酪蛋白、BlockAce (大日本制药公司制)等。作为表面活性剂，例如可举出阳离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂、两性表面活性剂、非离子性表面活性剂等。作为酶稳定化剂，例如可举出过氧化物酶稳定化缓冲液、碱性磷酸酶稳定化缓冲液等。
[0197]以下通过实施例更为详细地说明本发明，但它们对本发明的范围没有任何限定。
[0198]实施例1
[0199](I)链霉亲和素结合磁性粒子的制造
[0200]磁性粒子使用氨基型Estapor磁性粒子EM2-100/40 (Merck公司制)。该磁性粒子是由核-壳结构构成、粒径为1.62μπκ内部核部分含有总质量比为41.2%的磁性体、由聚苯乙烯构成的壳部分在化学上被氨基以97 μ eq/g修饰的粒子。采集该磁性粒子2mg,添加含有1.0%的三甲基十八烧基氯化铵(Trimethylstearylammonium Chloride)(东京化成公司制)的pH5.5、10mmol/L醋酸缓冲液(以下称作分散液A)4mL使其分散。接着，在容器侧面配置强力磁铁，从而将磁性粒子收集，将分散液A吸引除去(以下将分散液的添加、磁性粒子的收集、吸引除去的一系列操作简称作“洗涤”)。继续进行该洗涤4次后，利用pH5.5、10mmol/L醋酸缓冲液使其悬浮,制备30mg/mL的磁性粒子的悬浮液。戍二醒是使用pH5.5、IOmmoI/L醋酸缓冲液稀释25%戊二醛水溶液(Nacalai Tesque公司制)，制备了 0.038%、0.063%,0.088%,0.113%的各溶液。作为链霉亲和素，使用基因重组体的链霉亲和素(Roche公司制)，以24.5mg/mL溶解在pH5.5、10mmol/L醋酸缓冲液中，从而制备链霉亲和素溶液，在冰冷中静置I小时以上。
[0201]接着，在粒子分散液66.7 μ L中添加链霉亲和素溶液30 μ L，接着添加0.038%的戊二醛溶液30 μ L，在35°C下用波形回转搅拌器搅拌20小时。对于戊二醛溶液的浓度为
0.063%、0.088%、0.113%的溶液，进行相同的操作。
[0202]用含1.0%的BSA、0.09%的叠氮化钠的50mmol/L的MES缓冲液(pH6.5)洗涤所得
粒子10次，获得链霉亲和素结合磁性粒子。
[0203](2)链霉亲和素结合磁性粒子的生物素结合能力的测定
[0204]对于上述(I)中获得的链霉亲和素结合磁性粒子及市售的链霉亲和素结合磁性粒子，通过以下的方法测定生物素结合能力。
[0205]将链霉亲和素结合磁性粒子以lmg/mL分散于0.1%BSA-PBS [PBS:含有0.15mol/L氯化钠的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.2)]中，利用对倍稀释法稀释至0.0156mg/mL的6个阶段(64倍稀释)。将该6个样品和空白(0.1%BSA-PBS)分别注入到96孔板中，每孔50 μ L。接着，利用 0.1%BSA_PBS将Biotin_Fluorescein(Thermo Scientific 公司制)稀释至 Iug/mL，分别注入到已注入有样品的孔中，每孔50μ L。利用振荡孵育器(Amalyte公司制)对注入有样品的板进行振荡，同时在37°C下孵育10分钟,利用突光酶标仪“Plate ChameleonV” (HIDEX公司制)对分散有粒子的状态下的荧光强度进行测定。
[0206]这里，当荧光标记生物素结合于磁性粒子上的链霉亲和素时，结合于链霉亲和素的荧光标记生物素彼此接近地存在，引起荧光的消光。每单位面积的荧光标记生物素对结合于磁性粒子上的链霉亲和素的结合量越大，则荧光的消光越高。利用该性质，生物素结合能力以已知的市售磁性粒子作为参照，通过预先评价该链霉亲和素的荧光减少率，来算出本发明的链霉亲和素结合磁性粒子的生物素结合能力。本实施例中，由链霉亲和素结合磁性粒子的稀释样品，通过直线近似算出荧光强度减少50%时的链霉亲和素结合磁性粒子浓度，与参照的链霉亲和素进行比较，从而算出生物素结合能力(pmol/mm2)。
[0207]将测定结果示于第I表。
[0208]第I 表
【权利要求】
1.一种链霉亲和素结合磁性粒子，其特征在于，具有在磁性粒子链霉亲和素彼此发生交联的结构。
2.根据权利要求1所述的链霉亲和素结合磁性粒子，其通过包含以下工序的方法制造: (1)制备含有表面具有氣基的磁性粒子的悬浮液的工序；和 (2)在工序(I)中制备的悬浮液中、在链霉亲和素存在下添加戊二醛、使磁性粒子与链霉亲和素及戊二醛发生反应的工序。
3.根据权利要求2所述的链霉亲和素结合磁性粒子，其通过还进一步包含以下工序(3)的方法制造: (3)使工序(2)中制备的链霉亲和素结合磁性粒子与还原剂发生反应的工序。
4.一种蛋白质结合磁性粒子，其使用权利要求1?3任一项所述的链霉亲和素结合磁性粒子和生物素化蛋白质来制造。
5.一种试样中的测定对象成分的测定方法，其特征在于，使用权利要求4所述的蛋白质结合磁性粒子。
6.一种试样中的测定对象成分的测定方法，其特征在于，使用权利要求1?3任一项所述的链霉亲和素结合磁性粒子和生物素化蛋白质。
7.一种试样中的测定对象成分的测定用试剂，其特征在于，含有权利要求4所述的蛋白质结合磁性粒子。
8.一种 试样中的测定对象成分的测定用试剂，其特征在于，含有权利要求1?3任一项所述的链霉亲和素结合磁性粒子和生物素化蛋白质。
9.一种链霉亲和素结合磁性粒子的制造方法，其特征在于，包含以下工序: (1)制备含有表面具有氣基的磁性粒子的悬浮液的工序；和 (2)在工序(I)中制备的悬浮液中、在链霉亲和素存在下添加戊二醛、使磁性粒子与链霉亲和素及戊二醛发生反应的工序。
10.根据权利要求9所述的制造方法，其还进一步包含以下的工序(3): (3)使工序(2)中制备的链霉亲和素结合磁性粒子与还原剂发生反应的工序。
11.一种蛋白质结合磁性粒子的制造方法，其特征在于，包含以下工序: (1)制备含有表面具有氣基的磁性粒子的悬浮液的工序； (2)在工序(I)中制备的悬浮液中、在链霉未和素存在下添加戍_ fe以制备链霉未和素结合磁性粒子的工序；以及 (3)使工序(2)中制备的链霉亲和素结合粒子与生物素化蛋白质发生反应的工序。
12.一种蛋白质结合磁性粒子的制造方法，其特征在于，包含以下工序: (1)制备含有表面具有氣基的磁性粒子的悬浮液的工序； (2)在工序(I)中制备的悬浮液中、在链霉未和素存在下添加戍_ fe以制备链霉未和素结合磁性粒子的工序； (3)使工序(2)中制备的链霉亲和素结合磁性粒子与还原剂发生反应的工序；以及 (4)使工序(3)中制备的链霉亲和素结合磁性粒子与生物素化蛋白质发生反应的工序。
【文档编号】G01N33/543GK103443626SQ201280009039
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2012年2月15日 优先权日:2011年2月15日
【发明者】荒井信之, 松冈泰弘, 守田和树 申请人:协和梅迪克斯株式会社