专利名称：一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法
技术领域：
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法。
背景技术：
可卡因(cocaine)，别名古柯碱，是一种从古柯叶中分离出来的的生物碱。可卡因是一种强效局部麻醉剂，脂溶性高，对神经组织亲和性良好，属中枢神经兴奋剂。因其毒性大并易于成瘾，近来已被其他局部麻醉剂所取代，长期吸食可卡因身体和心理都会产生依赖性，对身体和心理造成极大伤害。可卡因的快速检测具有重要的意义。传统检测方法有高效液相色谱法、气相-质谱联用法、薄层色谱法及高效毛细管电泳法等。基于适配体的检测方法，具有高分辨率与高亲和力，弥补了现有抗体的不足。适配体(aptamer)是一类由SELEX筛选技术(指数富集的配基系统进化技术)筛选产生的寡链核酸(DNA或RNA)。适配体能特异性地结合小分子，多肽，蛋白，乃至细胞，病毒或寄生虫等配体。它们可以折叠成功能化的三维结构，并形成口袋结构，并与特定配体结合。适配体可以通过SELEX的方式从单链寡核苷酸库中体外筛选得到。这一过程已经自动化了，目前筛选周期已经从几个月缩短到几天。适配体具有以下特点1)靶分子广，从小分子到蛋白及有机大分子到细胞层面；2)高分辨率，例如能分辨出分子结构上只有一个甲基差别的茶碱与咖啡因；3)高亲和力，筛得aptamer的解离常数可以达到nmol/L水平,甚至pmol/L水平4)可体外合成、易于修饰；5)筛选过程相对简便、经济。适配体的出现提供了一种高效识别的研究平台，展示了良好的应用前景。目前，已有可卡因适配体被筛选出来，并被应用于基于比色法(J. Am. Chem.Soc. 2002，124，9678-9679.)以及基于量子点(Anal. Chem.，2009，81，3051 - 3055)的检测方法中。石英晶体微天平(Quartz crystal microbalance,QCM)是一种利用单结晶石英的压电电效应的称重装置，当施加一个外部电场时，会产生机械振动，当晶片厚度为电极机械振荡波半波长的奇数倍时，发生共振。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种快速，实时检测的利用石英晶体微天平检测可卡因的方法。该方法采用夹心法的方式在石英晶体微天平的表面固定可卡因的适配体，同时采用表面引发聚合的方式增大信号，能有效的节约人力，有望实现高度自动化。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤步骤一、配制DNA浓度为O. 2 μ M的DNA组装液，然后采用DNA组装液孵育清洗干净的QCM芯片，得到表面自组装DNA的QCM芯片；所述DNA为巯基修饰DNA，DNA序列(SEQID NO. I)为5，-TCA CAG ATGAGT AAA AAA AAA ΑΑΑ-3’ ；步骤二、采用浓度为2μ M的巯基聚乙二醇的乙醇溶液孵育步骤一中所述表面自组装DNA的QCM芯片使芯片表面的多余位点封闭；步骤三、制备引发剂标记的DNA溶液；步骤四、采用适配体DNA溶液和步骤三中所述引发剂标记的DNA溶液共同孵育步骤二中封闭后的QCM芯片，用缓冲溶液冲洗孵育后的芯片表面，得到固定有适配体DNA的QCM芯片；将所述固定有适配体DNA的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入缓冲液，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率Fl ;所述适配体DNA的序列(SEQ ID NO. 2)为 ACT CAT CTG TGA ATC TCG GGA GACAAG GAT AAA TCC TTC AATGAA GTG GGT CTC CC ;所述缓冲液为O. IM pH值为7. O的PBS缓冲液；步骤五、将步骤四中装入石英晶体微天平的反应器中的QCM芯片取出，氮气吹干后置于表面引发聚合反应液中，并将整个反应体系移至手套箱中，室温下反应2h 4h后将QCM芯片从表面引发聚合反应液中取出，用PBS溶液冲洗QCM芯片，然后用氮气吹干； 步骤六、将步骤五中吹干后的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入缓冲液，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率F2，再向反应器中通入检测物，待石英晶体微天平频率变化曲线平稳后读取监测到的频率F3，计算频率F2和步骤四中所述频率Fl的差值，频率F2和频率F3的差值AF"，当AF" /ΛΓ彡30%时判定检测物中含有可卡因；所述缓冲液为O. IM pH值为7. O的PBS缓冲液。上述的一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法，步骤一中所述DNA组装液由DNA、NaCl和浓度为O. IM的pH值为7. 2的PBS缓冲液混合均匀制成，DNA组装液中NaCl的浓度为O. 2M。上述的一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法，步骤三中所述引发剂标记的DNA溶液的制备方法为将10 μ L浓度为10mg/mL新鲜配置的NHS-酰溴溶液与5 μ L浓度为IM的pH值为9的NaHC03/Na2C03溶液混合均匀，并加水稀释至40 μ L，随后加入3 μ L浓度为100 μ M的氨基修饰DNA，加水稀释至50 μ L，25°C下反应lh，随后将反应产物用含O. 2MNaCl的浓度为O. IM的PBS缓冲溶液稀释至600 μ L得到引发剂标记的DNA溶液。上述的一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法，所述氨基修饰DNA为5’氨基功能化 DNA, DNA 序列(SEQ ID NO. 3)为 5，-GTC TCCCGA GAT-3’。上述的一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法，步骤四中所述适配体DNA溶液为含100 μ M适配体DNA的O. IM的PBS溶液，适配体DNA溶液与引发剂标记的DNA溶液的体积比为I : 25。上述的一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法，步骤四中所述孵育的温度为25°C，孵育的时间为O. 5h 2h。上述的一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法，步骤五中所述表面引发聚合反应液的制备方法为配制去离子水与甲醇体积比为I : I的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2，2’-联卩比卩定、5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯和5mmol甲基丙烯酸_2_轻基乙酯，混合均匀后加入O. 004mmol的氯化铜和O. Imol氯化钠，得到淡蓝色溶液，对淡蓝色溶液除氧IOmin 30min,随后向每升除氧后的淡蓝色溶液中加入O. 004mmol抗坏血酸,保持氮气氛围，得到红色的表面弓I发聚合反应液。本发明与现有技术相比具有以下优点I、本发明采用石英晶体微天平为检测工具，将适配体固定在QCM芯片表面，同时接枝高分子，以放大信号，本发明基于QCM的固化水模型，采用高分子放大信号，提供了一种新的思路。2、本发明使用引发剂标记的DNA参与聚合反应，并且摸索了相应的条件。3、本发明采用石英晶体微天平为检测工具，具有实时检测等优势，所用方法适于大规模应用，同时，本方法所得芯片其性能能在长时间内得以保存。4、本发明采用夹心法的方式在石英晶体微天平的表面固定可卡因的适配体，同时采用表面引发聚合的方式增大信号，能有效的节约人力，有望实现高度自动化，也能够有效地降低成本。下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
具体实施例方式实施例I步骤一、将清洗干净的金基底的QCM芯片浸泡到100 μ L DNA组装液中孵育2h，然后将QCM芯片取出，用乙醇冲洗干净，氮气吹干，得到表面自组装DNA的QCM芯片；所述DNA组装液由DNA、NaCl和浓度为O. IM的pH值为7. 2的PBS缓冲液混合均匀制成，DNA组装液中NaCl的浓度为O. 2M，DNA的浓度为O. 2 μ M ;所述DNA为巯基修饰DNA，DNA序列(SEQ IDNO. I)为5，-TCA CAG ATG AGT AAA AAA AAA ΑΑΑ-3’ ；步骤二、在室温下，采用浓度为2μ M的巯基聚乙二醇的乙醇溶液孵育步骤一中所述表面自组装DNA的QCM芯片2h使芯片表面的多余位点封闭，然后将QCM芯片取出，用乙醇冲洗干净，氮气吹干；步骤三、将O. Imol (11. 5g) NHS溶于250mL 二氯甲烷中，在氮气氛围下磁搅拌，并缓慢加入28. ImL三乙胺，冰浴，待完全溶解后加入13. 9mL2-溴代异丁酰溴，反应45min后等待液体至室温，再加入150mL乙醚萃取，其中有机相使用150mL Na2CO3饱和溶液洗涤，并反复萃取2次，产物使用无水硫酸镁干燥后过滤，旋转蒸发后得到的白色固体NHS-酰溴；将制备的NHS-酰溴配制成浓度为10mg/mL的NHS-酰溴溶液，然后将IOyL浓度为10mg/mL新鲜配置的NHS-酰溴溶液与5 μ L浓度为IM的pH值为9的NaHC03/Na2C03溶液混合均匀，并加水稀释至40 μ L,随后加入3 μ L浓度为100 μ M的氨基修饰DNA，加水稀释至50 μ L, 25°C下反应lh，随后将反应产物用含O. 2M NaCl的浓度为O. IM的PBS缓冲溶液稀释至600 μ L得到引发剂标记的DNA溶液；所述氨基修饰DNA为5’氨基功能化DNA，DNA序列(SEQ IDNO. 3)为 5，-GTC TCC CGA GAT-3，；步骤四、将适配体DNA溶液和步骤三中所述引发剂标记的DNA溶液按照I : 25的体积比混合均匀后，在温度为25°C的条件下共同孵育步骤二中封闭后的QCM芯片2h，用缓冲溶液冲洗孵育后的芯片表面，得到固定有适配体DNA的QCM芯片；将所述固定有适配体DNA的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入O. IM pH值为7.0的PBS缓冲液，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率Fl ;所述适配体DNA的序列(SEQ ID NO. 2)为 ACT CAT CTG TGA ATC TCG GGAGAC AAG GAT AAA TCC TTC AAT GAA GTGGGT CTC CC ；步骤五、配制去离子水与甲醇体积比为I : I的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2，2’-联卩比卩定、5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯和5mmol甲基丙烯酸_2_轻基乙酯，混合均匀后加入O. 004mmol的氯化铜和O. Imol氯化钠,得到淡蓝色溶液,对淡蓝色溶液除氧IOmin 30min,随后向每升除氧后的淡蓝色溶液中加入O. 004mmol抗坏血酸,保持氮气氛围，得到红色的表面引发聚合反应液；将步骤四中装入石英晶体微天平的反应器中的QCM芯片取出，氮气吹干后置于表面引发聚合反应液中，并将整个反应体系移至手套箱中，室温下反应2h后将QCM芯片从表面引发聚合反应液中取出，用PBS溶液冲洗QCM芯片，然后用氮气吹干；步骤六、将步骤五中冲洗干净后的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入O. IM pH值为7. O的PBS缓冲液，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率F2，然后向反应器中通入序列与可卡因适配体完全互补的DNA溶液，待石英晶体微天平频率变化曲线平稳后读取监测到的频率F3，计算频率F2和频率Fl的差值△ Fi，频率 F2 和频率 F3 的差值 AF"，AF' =745.3Hz，AF" =643Hz, AF" /AF' =86. 3%, BP在芯片上修饰的DNA分子及高分子引起了 745. 3Hz的频率响应，而其中86. 3%的随着互补DNA的加入而解链掉落。 实施例2步骤一、将清洗干净的金基底的QCM芯片浸泡到100 μ L DNA组装液中孵育2h，然后将QCM芯片取出，用乙醇冲洗干净，氮气吹干，得到表面自组装DNA的QCM芯片；所述DNA组装液由DNA、NaCl和浓度为O. IM的pH值为7. 2的PBS缓冲液混合均匀制成，DNA组装液中NaCl的浓度为O. 2M，DNA的浓度为O. 2 μ M ;所述DNA为巯基修饰DNA，DNA序列(SEQ IDNO. I)为5，-TCA CAG ATG AGT AAA AAA AAA ΑΑΑ-3’ ；步骤二、在室温下，采用浓度为2μ M的巯基聚乙二醇的乙醇溶液孵育步骤一中所述表面自组装DNA的QCM芯片2h使芯片表面的多余位点封闭，然后将QCM芯片取出，用乙醇冲洗干净，氮气吹干；步骤三、将O. Imol (11. 5g) NHS溶于250mL 二氯甲烷中，在氮气氛围下磁搅拌，并缓慢加入28. ImL三乙胺，冰浴，待完全溶解后加入13. 9mL2-溴代异丁酰溴，反应45min后等待液体至室温，再加入150mL乙醚萃取，其中有机相使用150mL Na2CO3饱和溶液洗涤，并反复萃取2次，产物使用无水硫酸镁干燥后过滤，旋转蒸发后得到的白色固体NHS-酰溴；将制备的NHS-酰溴配制成浓度为10mg/mL的NHS-酰溴溶液，然后将IOyL浓度为10mg/mL新鲜配置的NHS-酰溴溶液与5 μ L浓度为IM的pH值为9的NaHC03/Na2C03溶液混合均匀，并加水稀释至40 μ L,随后加入3 μ L浓度为100 μ M的氨基修饰DNA，加水稀释至50 μ L, 25°C下反应lh，随后将反应产物用含O. 2M NaCl的浓度为O. IM的PBS缓冲溶液稀释至600 μ L得到引发剂标记的DNA溶液；所述氨基修饰DNA为5’氨基功能化DNA，DNA序列(SEQ IDNO. 3)为 5，-GTC TCC CGA GAT-3，；步骤四、将适配体DNA溶液和步骤三中所述引发剂标记的DNA溶液按照I : 25的体积比混合均匀后，在温度为25°C的条件下共同孵育步骤二中封闭后的QCM芯片O. 5h，用缓冲溶液冲洗孵育后的芯片表面，得到固定有适配体DNA的QCM芯片；将所述固定有适配体DNA的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入O. IM pH值为7.0的PBS缓冲液，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率Fl ;所述适配体DNA的序列(SEQ ID NO. 2)为 ACT CAT CTG TGA ATC TCGGGA GAC AAG GAT AAA TCC TTC AAT GAA GTGGGT CTC CC ；
步骤五、配制去离子水与甲醇体积比为I : I的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2，2’-联卩比卩定、5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯和5mmol甲基丙烯酸_2_轻基乙酯，混合均匀后加入O. 004mmol的氯化铜和O. Imol氯化钠,得到淡蓝色溶液,对淡蓝色溶液除氧IOmin 30min,随后向每升除氧后的淡蓝色溶液中加入O. 004mmol抗坏血酸,保持氮气氛围，得到红色的表面引发聚合反应液；将步骤四中装入石英晶体微天平的反应器中的QCM芯片取出，氮气吹干后置于表面引发聚合反应液中，并将整个反应体系移至手套箱中，室温下反应2h后将QCM芯片从表面弓I发聚合反应液中取出，用PBS溶液冲洗QCM芯片，然后用氮气吹干；步骤六、将步骤五中冲洗干净后的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入O. IM pH值为7. O的PBS缓冲液，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率F2，然后向反应器中通入10 μ M可卡因，待石英晶体微天平频率变化曲线平稳后读取监测到的频率F3，计算频率F2和频率Fl的差值AFi，频率F2和频率F3的差值 AF"，AF' = 721.6Hz, AF" =539. OHz, AF" /AF' =74. 7%，即在芯片上修饰的 DNA分子及高分子引起了 721. 6Hz的频率响应，而随后加入10 μ M的可卡因，使部分双链DNA解 链，其造成的频率变化为539. OHz,即可以认为10 μ M的可卡因造成74. 7%的高分子脱落，判定检测物中含有可卡因。实施例3步骤一、将清洗干净的金基底的QCM芯片浸泡到100 μ L DNA组装液中孵育2h，然后将QCM芯片取出，用乙醇冲洗干净，氮气吹干，得到表面自组装DNA的QCM芯片；所述DNA组装液由DNA、NaCl和浓度为O. IM的pH值为7. 2的PBS缓冲液混合均匀制成，DNA组装液中NaCl的浓度为O. 2M，DNA的浓度为O. 2 μ M ;所述DNA为巯基修饰DNA，DNA序列(SEQ IDNO. I)为5，-TCA CAG ATG AGT AAA AAA AAA ΑΑΑ-3’ ；步骤二、在室温下，采用浓度为2μ M的巯基聚乙二醇的乙醇溶液孵育步骤一中所述表面自组装DNA的QCM芯片2h使芯片表面的多余位点封闭，然后将QCM芯片取出，用乙醇冲洗干净，氮气吹干；步骤三、将O. Imol (11. 5g) NHS溶于250mL 二氯甲烷中，在氮气氛围下磁搅拌，并缓慢加入28. ImL三乙胺，冰浴，待完全溶解后加入13. 9mL2-溴代异丁酰溴，反应45min后等待液体至室温，再加入150mL乙醚萃取，其中有机相使用150mL Na2CO3饱和溶液洗涤，并反复萃取2次，产物使用无水硫酸镁干燥后过滤，旋转蒸发后得到的白色固体NHS-酰溴；将制备的NHS-酰溴配制成浓度为10mg/mL的NHS-酰溴溶液，然后将IOyL浓度为10mg/mL新鲜配置的NHS-酰溴溶液与5 μ L浓度为IM的pH值为9的NaHC03/Na2C03溶液混合均匀，并加水稀释至40 μ L,随后加入3 μ L浓度为100 μ M的氨基修饰DNA，加水稀释至50 μ L, 25°C下反应lh，随后将反应产物用含O. 2M NaCl的浓度为O. IM的PBS缓冲溶液稀释至600 μ L得到引发剂标记的DNA溶液；所述氨基修饰DNA为5’氨基功能化DNA，DNA序列(SEQ IDNO. 3)为 5，-GTC TCC CGA GAT-3，；步骤四、将适配体DNA溶液和步骤三中所述引发剂标记的DNA溶液按照I : 25的体积比混合均匀后，在温度为25°C的条件下共同孵育步骤二中封闭后的QCM芯片lh，用缓冲溶液冲洗孵育后的芯片表面，得到固定有适配体DNA的QCM芯片；将所述固定有适配体DNA的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入O. IM pH值为7.0的PBS缓冲液，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率Fl ;所述适配体DNA的序列(SEQ ID NO. 2)为 ACT CAT CTG TGA ATC TCG GGAGAC AAG GAT AAA TCC TTC AAT GAA GTGGGT CTC CC ；步骤五、配制去离子水与甲醇体积比为I : I的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2，2’-联卩比卩定、5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯和5mmol甲基丙烯酸_2_轻基乙酯，混合均匀后加入O. 004mmol的氯化铜和O. Imol氯化钠,得到淡蓝色溶液,对淡蓝色溶液除氧IOmin 30min,随后向每升除氧后的淡蓝色溶液中加入O. 004mmol抗坏血酸,保持氮气氛围，得到红色的表面引发聚合反应液；将步骤四中装入石英晶体微天平的反应器中的QCM芯片取出，氮气吹干后置于表面引发聚合反应液中，并将整个反应体系移至手套箱中，室温下反应2h后将QCM芯片从表面引发聚合反应液中取出，用PBS溶液冲洗QCM芯片，然后用氮气吹干；步骤六、将步骤五中冲洗干净后的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入O. IM pH值为7. O的PBS缓冲液，待基线平稳后，读取石英晶体微天平 监测到的频率F2，然后向反应器中通入I μ M可卡因，待石英晶体微天平频率变化曲线平稳后读取监测到的频率F3，计算频率F2和频率F I的差值AFi，频率F2和频率F3的差值AF"，AF' = 718.2Hz, AF" =332. 1Hz, AF" /AF' =43. 6%，即在芯片上修饰的 DNA 分子及高分子引起了 718. 2Hz的频率响应，而随后加入I μΜ的可卡因，使部分双链DNA解链，其造成的频率变化为332. IHz,即可以认为I μ M的可卡因造成43. 6%的高分子脱落，判定检测物中含有可卡因。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
权利要求
1.一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 步骤一、配制DNA浓度为0. 2 ii M的DNA组装液，然后采用DNA组装液孵育清洗干净的QCM芯片，得到表面自组装DNA的QCM芯片；所述DNA为巯基修饰DNA，DNA序列为5’ -TCACAG ATG AGT AAA AAAAAA AAA-3，； 步骤二、采用浓度为2 ii M的巯基聚乙二醇的乙醇溶液孵育步骤一中所述表面自组装DNA的QCM芯片使芯片表面的多余位点封闭； 步骤三、制备引发剂标记的DNA溶液； 步骤四、采用适配体DNA溶液和步骤三中所述引发剂标记的DNA溶液共同孵育步骤二中封闭后的QCM芯片，用缓冲溶液冲洗孵育后的芯片表面，得到固定有适配体DNA的QCM芯 片；将所述固定有适配体DNA的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入缓冲液，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率Fl ;所述适配体DNA的序列为 ACT CAT CTG TGA ATC TCG GGA GAC AAG GAT AAATCC TTC AAT GAA GTG GGT CTC CC ；所述缓冲液为0. IM pH值为7. 0的PBS缓冲液； 步骤五、将步骤四中装入石英晶体微天平的反应器中的QCM芯片取出，氮气吹干后置于表面引发聚合反应液中，并将整个反应体系移至手套箱中，室温下反应2h 4h后将QCM芯片从表面引发聚合反应液中取出，用PBS溶液冲洗QCM芯片，然后用氮气吹干； 步骤六、将步骤五中吹干后的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入缓冲液，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率F2，再向反应器中通入检测物，待石英晶体微天平频率变化曲线平稳后读取监测到的频率F3，计算频率F2和步骤四中所述频率Fl的差值AF'，频率F2和频率F3的差值AF"，当AF" /AF'彡30%时判定检测物中含有可卡因；所述缓冲液为0. IM pH值为7. 0的PBS缓冲液。
2.根据权利要求I所述的一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法，其特征在于，步骤一中所述DNA组装液由DNA、NaCl和浓度为0. IM的pH值为7. 2的PBS缓冲液混合均匀制成，DNA组装液中NaCl的浓度为0. 2M。
3.根据权利要求I所述的一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法，其特征在于，步骤三中所述引发剂标记的DNA溶液的制备方法为将IOuL浓度为lOmg/mL新鲜配置的NHS-酰溴溶液与5 u L浓度为IM的pH值为9的NaHC03/Na2C03溶液混合均匀，并加水稀释至40 ii L，随后加入3 ii L浓度为100 u M的氨基修饰DNA，加水稀释至50 u L，25°C下反应lh，随后将反应产物用含0. 2M NaCl的浓度为0. IM的PBS缓冲溶液稀释至600 u L得到引发剂标记的DNA溶液。
4.根据权利要求3所述的一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法，其特征在于，所述氨基修饰DNA为5’氨基功能化DNA，DNA序列为5’ -GTC TCC CGA GAT-3’。
5.根据权利要求I所述的一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法，其特征在于，步骤四中所述适配体DNA溶液为含100 u M适配体DNA的0. IM的PBS溶液，适配体DNA溶液与引发剂标记的DNA溶液的体积比为I : 25。
6.根据权利要求I所述的一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法，其特征在于，步骤四中所述孵育的温度为25°C，孵育的时间为0. 5h 2h。
7.根据权利要求I所述的一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法，其特征在于，步骤五中所述表面引发聚合反应液的制备方法为配制去离子水与甲醇体积比为I : I的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2, 2’ -联卩比唳、5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯和5mmol甲基丙烯酸-2-轻基乙酯,混合均勻后加入0. 004mmol的氯化铜和0. Imol氯化钠，得到淡蓝色溶液，对淡蓝色溶液除氧IOmin 30min，随后向每升除氧后的淡蓝色溶液中加入0. 004mmol抗坏血酸，保持氮气氛围， 得到红色的表面引发聚合反应液。
全文摘要
本发明公开了一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法，该方法为一、制备表面自组装DNA的QCM芯片；二、封闭芯片表面的多余位点；三、制备引发剂标记的DNA溶液；四、采用适配体DNA溶液和引发剂标记的DNA溶液共同孵育封闭后的芯片，装入石英晶体微天平的反应器中，通入缓冲液，读取频率F1；五、取出芯片进行表面引发聚合反应；六、将表面引发聚合反应后的芯片置于反应器中，通入缓冲液，读取频率F2，再通入检测物，读取频率F3，计算F2与F1及F2与F3的差值ΔF′和ΔF″，当ΔF″/ΔF′≥30%时，判定检测物中含有可卡因。本发明采用石英晶体微天平为检测工具，具有实时检测等优势。
文档编号G01N5/02GK102967523SQ20121046463
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月18日 优先权日2012年11月18日
发明者马宏伟, 朱志强, 汪杰 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所