专利名称：食用油中甾醇的电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱分析方法
技术领域：
本发明涉及一种食用油样品中甾醇的电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF MS)分析方法，进一步说是一种N-烷基吡啶同位素衍生化方法结合电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF MS)用于定性或定量分析食用油样品中的甾醇类化合物的方法，包括植物留醇和动物留醇。该分析方法快速、高效、灵敏的。由于经过反复使用，地沟油和其他回收利用的劣质油中常含有较多动物来源的留醇，因此，该方法 通过区分食用油中的植物留醇和动物留醇，为进一步测定和区分可能存在的地沟油和其他回收利用的劣质油奠定基础。
背景技术：
食用油的质量和安全性已经成为全社会关心的问题。地沟油，泛指在生活中存在的各类劣质油，如回收的食用油、反复使用的炸油等，长期食用可能会引发癌症，对人体的危害极大。由于存在不小的经济诱惑，仍有人铤而走险销售地沟油。地沟油主要成分仍然是甘油三酯，却又比真正的食用油多了许多致病、致癌的毒性物质。目前国内尚未有检测地沟油的统一标准。留醇是广泛存在于生物体内的一种重要的天然活性物质，按其来源分为动物性甾醇、植物性留醇和菌类留醇等三大类。动物性留醇以胆固醇为主，还包括胆留烷醇,脱氢胆固醇和羊毛留醇等；植物性留醇主要为谷留醇、豆留醇和菜油留醇等，而麦角留醇则属于菌类留醇。食用油中含有多种留醇类化合物，一般均为植物留醇。而地沟油和其他回收利用的劣质油中，由于经过反复使用，动物来源的留醇含量较高，因此我们可以通过确定食用油中留醇的种类确定可能存在的地沟油。目前食用油中留醇类化合物的分析方法主要是高效液相色谱-质谱(LC-MS)和气相色谱-质谱(GC-MS)，但前处理较复杂，需要分离纯化过程如薄层色谱，超临界流体萃取，固相萃取等，不能满足高通量筛选的需要(J Am OilChem Soc 2009，86:1047 - 1055，Commun. Mass Spectrom. 2006, 20:2433 - 2440, AnalyticalLetters,2009，42:1650-1661，Food Chemistry 2007，102，593 - 598)。另外，留醇类化合物物由于其较弱的质子亲和力和较弱的酸性，不易电离，油滴的基质又极其复杂，易包裹在油滴中，难以发生库仑爆炸并电离，在ESI中信号较弱，灵敏度较低，且易被其他易电离的物质抑制，很难测出食用油中微量的动物留醇，特别是当合格的食用油中混入少量劣质油时，更难检测。这些局限性都促使了新的分析方法的发展和应用。电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF MS)由于其高分辨率和高灵敏度而具有极大的优势，简化繁琐的样品处理步骤，高分辨率是我们能够检测复杂样本中质荷比十分接近的化合物。ESI-Q-TOF MS已被广泛应用于分析各种样本中物质的定性和定量分析
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种食用油样品中甾醇的电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF MS)分析方法，进一步说是一种N-烷基吡啶同位素衍生化方法结合电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF MS)用于定性或定量分析食用油样品中的植物留醇和动物留醇类化合物的方法，通过季铵化反应，将待测甾醇从油滴内部转化到油滴表面，提高离子化效率。是一种快速、高效、灵敏的分析方法。由于劣质油中常含有动物来源的留醇，因此通过区分食用油中的植物留醇和动物留醇，为进一步测定和区分可能存在的地沟油和其他回收利用的劣质油奠定基础。本发明方法涉及到的分析过程如附图
I所示。简述如下本发明的方法进一步描述是通过下述步骤(I) (4)进行(I)将食用油分成两等份，各约为20-50 μ L各加入l_2mL氢氧化钾乙醇(体积比I: I)，60-70°C皂化水解l-2h，分别加入2. 5_5mL的乙醚提取两次，有机层再加入水洗，合并有机层后加入KOH干燥，氮气吹干。 (2)将(I)获得的第一份样品20-50 μ L加入50-100 μ L 10-40%的吡啶二氯甲烷溶液，再与50-100μ L 10-40%的三氟甲磺酸酐二氯甲烷混合反应5-20分钟，(I)获得的第二份样品20-50 μ L加入50-100 μ L 10-40%的氘代吡啶二氯甲烷溶液，再与50-100 μ L10-40%的三氟甲磺酸酐二氯甲烷混合反应5-20分钟；(3) (2)获得的两份反应液混合后再加入甲醇稀释至l_2mL，进样O. 5_5 μ L，电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱进行一级质谱全扫描和二级质谱产物离子扫描分析；通过对比电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱分析结果，获得食用油中留醇类化合物的定性结果；(4)食用油样品按照(I)的步骤与吡啶反应获得的反应液，相同体积(Viga)的甾醇标准溶液以(I)步骤与氘代吡啶反应获得的反应液，两份反应液混合，进行电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱分析，样品中目标化合物的含量通过以下公式比较dQ/
七峰对的峰强度和标准物含量计算得到定量义^呢/就卜^^^^^^關为食
用油中待测物含量，(^#为标准物含量，Viga为标准溶液的体积，V#s为样品的体积，I0为ESI-Q-TOF图谱中留醇化合物经吡啶衍生后所得产物的峰强度，I5为ESI-Q-TOF图谱中标准物经氘代吡啶衍生化后所得产物的峰强度；分析过程中涉及到的这种N-烷基吡啶同位素季铵衍生化方法的反应过程如下
权利要求
1.一种食用油样品分析方法，其特征是所述的油样品经前处理分成两等份，分别与吡啶和氘代吡啶进行衍生化反应，再经电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱仪进行分析食用油中的甾醇类化合物。
2.如权利要求I所述的方法，其特征是所述的食用油样品是橄榄油、色拉油、芥花油、山茶油、油菜籽油、棉籽油、玉米油或葵花籽油。
3.如权利要求I所述的方法，其特征是通过下述步骤(I) (4)进行 (1)将经过前处理的食用油分成两等份，分别加入乙醚提取两次，合并有机层后，加入氢氧化钾干燥，氮气吹干； (2)将(I)获得的第一份样品20-50μL加入50-100μ L 10-40%的吡啶二氯甲烷溶液，再与50-100 μ L10-40%的三氟甲磺酸酐二氯甲烷混合反应5-20分钟；(I)获得的第二份样品20-50 μ L加入50-100 μ L10-40%的氘代吡啶二氯甲烷溶液，再与50-100 μ L 10-40%的三氟甲磺酸酐二氯甲烷混合反应5-20分钟；反应物与吡啶的比率范围10-1000。
(3)步骤(2)获得的两份反应液混合后加入甲醇稀释至l_2mL，进样O.5_5yL四极杆-飞行时间串联质谱分析；通过对比电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱分析结果，获得食用油中留醇类化合物的定性结果； (4)食用油样品按照(I)的步骤与吡啶反应获得的反应液，相同体积Visa的甾醇标准溶液以(I)步骤与氘代吡啶反应获得的反应液，两份反应液混合，进行电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱ESI-Q-TOF分析，样品中目标化合物的含量通过以下公式比较d0/d5峰对的峰强度和标准物含量计算得到定量= ('以Jfx手i CwpJj fT hh 5食用油待测物含量，CeiS标准物含量，Vga为标准溶液的体积，v#s为样品的体积，I0为ESI-Q-TOF图谱中留醇化合物经吡啶衍生后所得产物的峰强度，I5为ESI-Q-TOF图谱中标准物经氘代吡啶衍生化后所得产物的峰强度；所述的ESI-Q-TOF图谱I为电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱仪分析所得质谱图。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征是所述的留醇类化合物是胆固醇、豆甾醇、谷甾醇、胆留烷醇、脱氢胆固醇、羊毛留醇或油菜籽固醇。
5.如权利要求I所述的10-40%为体积百分数。
6.如权利要求3所述的分析方法，其特征是通过步骤(3)的电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱进行一级质谱全扫描分析及产物离子扫描分析，确定目标化合物的元素组成，所得的理论和测定的质荷比误差小于5ppm。
7.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征是所述的食用油样品前处理如下(5)将食用油l_2mL分成两等份，各加入I: I体积的l_2mL氢氧化钾乙醇，60_70°C皂化水解l_2h，分别加入2. 5-5mL的乙醚提取两次，有机层再加入水洗，合并有机层后加入KOH干燥，氮气吹干。
8.如权利要求3的方法，其特征是所述的步骤(4)中留醇标准溶液是将各种植物甾醇和动物留醇标准品溶解在油酸溶液中配制而成。
9.如权利要求3的方法，其特征是电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱仪进行分析的优选条件是毛细管温度300-350°C，毛细管电压4000V，干燥气8L/min，采集速率I.5spectra/s,扫描范围350 - 800m/z,数据采集均在正离子模式下进行。子离子扫描条件碰撞能10-30eV。之后图谱解析，进行定性及定量分析。
全文摘要
本发明涉及一种食用油样品的电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF MS)分析方法，进一步说是一种N-烷基吡啶同位素衍生化方法结合电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF MS)分析用于定性或定量分析食用油样品中的甾醇类化合物的方法。此方法包括下列步骤目标分析物经样本前处理；目标分析物上的醇羟基与吡啶或氘代吡啶反应；将标记后的样品溶液经稀释进行ESI-Q-TOF MS分析。该方法快速、高效、灵敏，通过区分食用油中的植物甾醇和动物甾醇为进一步测定和区分可能存在的不合格食用油奠定基础。
文档编号G01N27/62GK102967647SQ201210461660
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月15日 优先权日2012年11月15日
发明者郭寅龙, 汪航, 张立, 张菁, 王昊阳, 贺小双, 陆森森 申请人:中国科学院上海有机化学研究所