专利名称：牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的制备及其应用方法
牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的制备及其应用方法
技术领域：
本发明涉及家畜寄生虫病的诊断技术领域，具体涉及牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的制备及其应用方法。
背景技术：
血吸虫病是人畜共患的寄生虫病。当前我国尚有7省( 自治区)100多个县未达到血吸虫病的传播控制标准。牛是血吸虫病的重要传染源。由于受长江季节性洪水等自然因素及人畜流动频繁等社会因素的影响，近年来我国血吸虫病疫情又出现了反复，患病的人畜增加。我国一直来均将血吸虫病列为动物疫病监测及检疫的重要对象。因此，对调运家畜的血吸虫病的过境检疫、对现疫区家畜的血吸虫病普查及对历史上曾经发生过血吸虫病流行区的牲畜的监测是一项长期而艰巨的任务。因此，研究家畜血吸虫病快速检测的方法对防制和消灭血吸虫病具有重要意义。目前诊断家畜血吸虫病的方法主要有粪孵血吸虫毛蝴法、ELISA法、IHA法和金标免疫渗滤法。粪孵毛蝴法只有在动物感染血吸虫后5周以上才能粪孵出血吸虫毛蝴，并且粪便中的虫卵数量有波动，轻度感染的病畜尤易漏检，且用粪孵法检测一个样品需耗时5 6个小时，随着劳动力工资大幅上涨，该法在家畜血吸虫病的普查中已很少被采用。ELISA方法操作繁琐、时间长、酶试剂难以保存、影响因素多，检测需专用仪器设备、试验中使用的某些材料易造成环境污染，对人健康有害。IHA稳定性较差，敏感性不如ELISA法，实验所需时间也较长。ELISA法和IHA法都不能满足现场检疫的要求。金标免疫渗滤法具有检测速度快、操作简便不需特殊仪器等特点，适合于血吸虫病的现场检疫、诊断和普查。但其诊断试剂为液体，稳定性较差，保存要求高(需4°C冰箱保存)，保存期短(仅6个月)，试剂及反应板体积大，邮寄和航空运输受限，增加了保存、运输费用及运输所需的时间。金标免疫层析法可以克服金标免疫渗滤法的这些缺点。国内有数家单位对人血吸虫病金标免疫层析法进行过研究，但由于各种原因都没有批量生产和实践中推广开来。从理论上分析，胶体金与抗原或抗体的结合均是通过正负电荷的静电引力结合在一起的。这种结合的牢固程度容易受溶液PH值和其他离子强度的影响，因此其最适pH范围往往很小，检测的可重复性较差。胶体金与抗原或抗体的结合还可能被血液中或试剂中加入的称作为稳定剂的其它蛋白与胶体金之间竞争性结合的影响，使试剂较快失效或者出现假阳性。可以说这是金标方法本身具有的局限性。从理论上说，通过共价键使分子之间结合的牢固程度要强于由静电引力结合的强度。乳球免疫层析技术正是继免疫胶体金技术后新近发展起来的一种以共价键结合为特点的免疫标记新技术。本发明的检测试剂为乳胶微球标记的兔抗黄水牛IgG抗体，乳胶微球与兔抗黄水牛IgG抗体之间以共价键结合，所以该复合物稳定性好，且乳胶微球的直径比胶体金大10 20倍，信号强度大，可提高试剂的灵敏度和阳性样本的检出率。
发明内容
本发明目的是，针对牛日本血吸虫病ELISA和IHA诊断法存在操作步骤多、速度慢、不能满足现场检疫需求，和金标免疫渗滤法检测试剂系液体，保存期较短，不能空运或邮寄等缺陷，为牛日本血吸虫病的诊断、检疫和普查提供一种敏感、特异、安全、稳定性好、信号强度大，且为固体状态、没有污染的检测试纸条，及在5 15分钟内即可完成的快速，简便的检测方法。本发明的原理是采用有机化学方法使红色或其它颜色的聚苯乙烯乳胶微球羧基化后，使兔抗黄水牛IgG抗体蛋白的胺基与乳胶微球的羧基形成共价键，使该染色乳胶微球标记的兔抗黄水牛IgG抗体的结合物作为检测试剂(免疫探针)；再将该液状的乳胶微球-兔抗黄水牛IgG抗体结合物以喷雾法使之吸附在聚脂膜上，经烘干成固体状的免疫探针干片；另以硝酸纤维素膜作为层析膜，并用划膜喷金仪在该膜的不同位置上画出血吸虫卵可溶性抗原和羊抗兔IgG抗体两条直线，分别作为检测线(T线)和质控线(C线);然后按照样品垫、免疫探针干片、层析膜和吸水滤纸的顺序，以头尾部分重叠的形式装配在PVC基板上，再贴上箭头标签胶膜与手柄标签胶膜后，用切条机按设定宽度裁切后即成牛日本血吸虫病抗体检测试纸条。
检测时，将待检稀释血清滴在试纸条的样品垫上(或将裸露的样品垫插入待检稀释血清中10s)，血清液通过毛细管作用流经免疫探针干片，将吸附在聚酯膜上的乳胶微球-兔抗黄水牛IgG抗体结合物溶解成游离状，如果血样中存在有牛抗血吸虫抗体(即阳性牛血样)，则该血样中的抗体将会与部分游离状的乳胶微球-兔抗黄水牛IgG抗体结合物相结合，形成牛抗血吸虫抗体-兔抗黄水牛IgG抗体-乳胶微球的三联红色或其它颜色的复合物后，并沿着硝酸纤维素膜继续向前移行，当这种红色或其它颜色的复合物移行到预先锚固着血吸虫抗原的检测线(T线)上时，该血吸虫抗原将会与复合物中的牛抗血吸虫抗体相结合，而形成更大的四联复合物而使T线呈显红色或其它颜色的条带；而剩余的未与牛抗血吸虫抗体相结合的游离状乳胶微球-兔抗黄水牛IgG抗体结合物将继续往前移行，当与锚固在硝酸纤维素膜上的羊抗兔IgG抗体质控线(C线)相遇时，便形成羊抗兔IgG抗体-兔抗黄水牛IgG抗体-乳胶微球的三联红色复合物,使C线呈现红色条带；如果血样中不存在牛抗血吸虫抗体(即阴性牛血样)，则就不能形成牛抗血吸虫抗体-兔抗黄水牛IgG抗体-乳胶微球的三联复合物，而单纯的乳胶微球-兔抗黄水牛IgG抗体结合物是不能与T线上的血吸虫抗原相结合的，所以检测线(T线)不能呈现红色或其它颜色的条带，而只有质控线(C线)仍呈显红色或其它颜色的条带；如果检测线与质控线均没有出现红色条带，则说明该试纸条已失效或者检测操作有误。本发明目的通过以下技术方案予以实现I、一种检测牛日本血吸虫病抗体的试纸条，该试纸条由部件样品垫、免疫探针干片、层析膜、吸水纸、PVC基板及箭头标签胶膜与手柄标签胶膜组合而成；其中，免疫探针干片是以红色或其它颜色羧基化聚苯乙烯乳胶微球的羧基，与兔抗黄水牛IgG抗体蛋白的胺基形成共价键结合物后作为免疫探针的检测试剂液吸附于聚脂膜后制成；层析膜是以硝酸纤维素膜为膜基，用划膜喷金机将血吸虫卵可溶性抗原和羊抗兔IgG抗体分别在该膜上画出检测T线和质控C线而成；先将上述前四部件按头尾部分重叠粘合装配在PVC基板上，再将箭头标签胶膜粘贴在免疫探针干片上，另将手柄标签胶膜粘贴在吸水纸上后，用切条机按设定宽度裁切后即成牛日本血吸虫病抗体检测试纸条。
2、一种制备牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的方法，该方法按以下步骤进行(I)免疫探针干片的制备包括I)兔抗黄水牛IgG的制备①黄水牛IgG的制备采集健康黄牛、水牛血液,分别分离血清后取血清各5ml混合，加等量O. 85%NaCl，用30%硫酸铵沉淀法提取黄水牛IgG，沉淀的黄水牛IgG用原血清体积2倍量的O. 85%NaCl溶解，再用35%硫酸铵沉淀法重复提取2次，最后用5ml O. 85%NaCl溶解离心沉淀的黄水牛IgG，用透析法除去溶液中的NH4+及SO/—后，再用蒸馏水稀释或将透析袋放入PEG中浓缩的方法，调节蛋白浓度至10mg/ml后，于_20°C密封贮存备用；②黄水牛IgG免疫兔将黄水牛IgG与弗氏完全佐剂按体积3:7比例制成油乳剂，按黄水牛IgG 6mg/只兔用量，对体重2. 5kg的健康雄性家兔，在兔颈部皮下和兔双侧后足 踱垫皮下注射进行首次免疫；后除用弗氏不完全佐剂替代弗氏完全佐剂外，再按上述同样配比、方法，每隔两周进行一次加强免疫，共进行三次；第4次后10天，取耳静脉少量血分离血清，用琼脂扩散法测定免疫血清效价，当血清效价> 1:64时，即可心脏大量釆血、分离血清后，备用；③兔抗黄水牛IgG抗体的制备取兔抗黄水牛IgG血清10ml，以35%硫酸铵沉淀法提取兔抗黄水牛IgG抗体，以2倍于血清量的O. 85%NaCl溶解沉淀的兔抗黄水牛IgG抗体，如此反复提取3次后，将第3次硫酸铵沉淀的兔抗黄水牛IgG抗体的离心沉淀物以5mlO. 85%NaCl溶解，用透析法除去溶液中的NH4+及S042_ ;在蛋白测定仪上测定兔抗黄水牛IgG抗体蛋白含量后，用PH7. 200. IM的硼酸缓冲液稀释或将透析袋放入PEG中浓缩的方法，将蛋白浓度调节至4mg/ml后，于_20°C密封贮存备用；2)乳胶微球的洗涤将直径200nm红色或其它颜色的聚苯乙烯乳胶微球液，在10000rpm，4°C条件下离心lOmin，去上清液，沉淀物用高纯水还原为原体积，用超声波分散沉淀的乳胶微球成为均匀悬浮液后，再用上述相同的方法重复离心、重悬浮I 2次；3)乳胶微球羧基的激活将pH6. 50. Imol MES, 10%带色乳胶微球的悬液，20mg/mL的EDC .HCl和20mg/mL的NHS,按体积9:2:1:0. 75 ^比例混合、反应2hr ;然后在IIOOOrpm
4°C条件下离心25min，除去上清液，沉淀物以所用带色乳胶体积5倍量的pH7. 200. IM的硼酸缓冲液重悬，以超声波击打还原成均匀的悬浮液；用垂直混合仪混合15min，在IlOOOrpm, 4 °C条件下离心25min除去上清液，沉淀物以所用带色乳胶体积2. 5倍量的PH7. 200. IM的硼酸缓冲液重悬，以超声波击打还原成均匀的悬浮液，即为羧基活化的乳胶微球；4)乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG抗体往装有羧基活化乳胶微球悬浮液的离心管中加入等体积以PH7. 200. IM的硼酸缓冲液稀释成蛋白浓度为I 4mg/mL的兔抗黄水牛IgG抗体，在垂直混合仪上混合反应2hr以上；再加入总体积十分之一量的20%BSA振荡反应lhr，反应后的混合物以IlOOOrpm 4°C离心25min，除去上清液，沉淀物以含酪蛋白O. 2% O. 5%、蔗糖 5% 10%、NaN3 O. 02% O. 05% 的 ρΗ7· 20. 05Μ Tris-HCl 缓冲液构成的封闭液原体积重悬，超声波击打还原成均勻的悬浮液，在垂直混合仪上混合15min,再次以IlOOOrpm 4°C离心25min，除去上清液，沉淀物以相当于乳胶微球悬浮液和兔抗黄水牛IgG抗体两者总体积75%的同上封闭液重悬，超声波击打还原成均匀的悬浮液，该液即为红色或其它颜色的免疫探针检测试剂液；
5)免疫探针干片的制备将上述的免疫探针检测试剂液用划膜喷金机以2
5μ 1/cm的流速喷涂在已经过含酪蛋白O. 2% O. 5%，蔗糖5% 10%，NaN3O. 02% O. 05%, Tween-200. 2% O. 5%的pH7. 20. 05M Tris-HCl缓冲液构成的聚酯膜处理液预处理后的长300mmX宽8. 5mm的聚酯膜上，经37°C，Ihr烘干，即为免疫探针干片；(2)层析膜的制备I)血吸虫卵可溶性抗原的制备按体重2. 5 3kg的健康新西兰兔，每只接种血吸虫尾蝴2000条，实验感染兔于接种后45日屠宰取肝脏，分离和纯化血吸虫虫卵，经冷冻干燥后研磨破碎，用O. 85%NaCl溶液配成3% 5%悬浮液，2 8°C浸泡3日，再反复冻融10次，冰浴超声波破碎30min, 10000r/min离心lhr,取上清液,装透析袋,用pH7. 00. OlM PB透析16小时，每隔4小时换透析液I次，透析结束后，以IOOOOrp离心60min，上清液即为血吸虫卵可溶性抗原；检测其蛋白含量后，用PH8. 2 8. 50. 05M TBS稀释至I 7mg/mL浓度，即可用于层析膜上检测T线的绘制； 2)羊抗兔IgG的制备①兔IgG的制备以心脏采血法采集健康新西兰兔的血液,分离血清,取兔血清IOml，再加IOml O. 85%NaCl混匀，用35%硫酸铵沉淀法提取兔IgG，反复沉淀提取3次，沉淀物用5ml O. 85%NaCl溶解后，用透析法除去硫酸铵，并在蛋白测定仪上测定兔IgG的蛋白含量;②羊抗兔IgG抗体的制备用弗氏佐剂将兔IgG溶液配制成lmg/ml,用超声波制成乳浊液；按照每千克体重2mg的剂量皮下注射免疫羊，每间隔2周，再用弗氏不完全佐剂和兔IgG制备成相同浓度的乳浊液，以相同剂量与方法免疫羊，第3次免疫后IOd颈静脉采血分离血清，以琼脂免疫扩散法测定血清中羊抗兔IgG抗体效价> 1:32以上时，即可大量采集羊血并制取血清；分离羊抗兔IgG抗体先用30%硫酸铵沉淀法提取粗羊抗兔IgG抗体一次，再用45%硫酸铵沉淀法提取2次，离心沉淀物用5ml O. 85%NaCl溶解，用透析法除去溶液中的NH4+及S042-，3000rpm离心30min，检测上清液蛋白含量后，用pH8. 2 8. 50. 05M TBS将上清液稀释成O. I 2mg/mL的浓度，即可用于层析膜上质控C线的绘制；3)检测线和质控线的制作将长25mmX宽300mm的硝酸纤维素膜放在划膜喷金机的操作平台上，在该机1#泵的试剂瓶中加入血吸虫卵可溶性抗原，2#泵的试剂瓶中加入羊抗兔IgG，以I 3 μ 1/cm的流速，在硝酸纤维素膜上划出检测T线和质控C线，两线相距5 6mm,置室内晾干即为层析膜；(3)样品垫的制备将23mmX300mm玻璃纤维膜在由含酪蛋白O. 01% O. 05%,蔗糖 5% 10%、NaN30 . 02% O. 05% 和 Tween-200. 2% O. 5% 的 ρΗ7· 20. 04MTris_HCl 缓冲液构成的样品垫处理液中浸泡lhr，取出，37°C烘干即成；(4)吸水纸的制备CH37吸水纸裁成长300mmX宽28mm的纸条，置37°C烘干即成；(5) PVC基板的制备PVC板其结构为三层，第一层为保护纸，第二层为不干胶，第三层为PVC基板；在保护纸上刻有三条刻痕，分别位于距离一侧长边的20mm、27mm和53mm处；将PVC板按长300mmX宽80mm规格裁剪后备用；(6)标签胶膜的制备用不干胶贴纸印制而成；其中，I)箭头标签胶膜其规格为长300mmX宽18mm，在距一侧长边Imm处印有一条直线，在该直线的上方，每隔1.3_印有一条“一MAX”字样，箭头与直线垂直；指示试纸条样品垫可浸入待测溶液的最大深度不得超过这条直线；2)手柄标签胶膜其规格为长303mmX宽30mm，绿底白字，与长边呈15°夹角印有4列“SjAb”字样，SjAb为Schistosoma japonicum Antibody的缩写，表示该试纸条用于检测日本血吸虫抗体，该部位为试纸条拿取时的手柄部位；(7)试纸条各部件的组装、切条、包装和贮存I)试纸条各部件的组装试纸条以长300mmX宽80mm的PVC为基板，依次将300_X 23_的样品垫、300mm X 8. 5mm的免疫探针干片、300_X 25_的层析膜及300mmX 28mm的吸水纸，按头尾各有I 2mm的重叠连接、粘贴在带不干胶面的PVC基板上；再在吸水垫的尾部与免疫探针干片上粘贴上箭头标签胶膜；另在样品垫上粘贴上手柄标签胶膜；各部件压平，粘贴牢固即成试纸条大卡；
2)切条将试纸条大卡放在切条机上,按3mm宽度连续切割，即成宽3mmX长80mm的试纸条；3)包装与贮存试纸条抽检合格后，按包装规格要求装入铝箔袋中，放入I小包干燥剂后，封口，即成产品；在2 8°C保存，有效期为12个月。3、应用试纸条检测牛日本血吸虫病抗体的方法，该方法按以下步骤进行(I)血清稀释液的配制将Na2HP04、KH2PO4, NaCl与蒸馏水按重量体积O. 199g O. 082g Ig 200ml比例混合，37 40°C水浴加热溶解、冷却后即成血清稀释液；(2)待检牛血清的稀释将待检牛血清与血清稀释液按体积I: I 2比例混合稀释；(3)检测操作吸取稀释的待检血清O. 05ml滴在平放的试纸条的样品垫上，或将试纸条的样品垫端插入待检稀释血清中至箭头标签胶膜所印的直线条15s后，平放在操作台面上；(4)结果判定5 15min后观察结果，检测T线和质控C线均呈现红色或其它颜色的同色条带，则判为阳性；仅质控C线呈现I条红色或其它颜色的条带，则判为阴性；检测T线和质控C线均不呈现条带，则说明该试纸条已失效或试验操作有误。本发明的有益效果是(I)用本发明试纸条检测牛血吸虫病无需复杂仪器和专门知识技能，操作简便、快捷,5 15min就可得出结果。(2)本发明试纸条体积小、重量轻、全固态，可方便邮寄或航空托运。(3)试纸条有效期可达I年以上，比免疫金标渗滤法检测试剂的保存期长。(4)本发明试纸条的检测特异性与IHA和ELISA方法相当，重复性好，适合于工厂
化生产。(5)本发明用黄、水牛IgG免疫兔以制备兔抗黄水牛IgG抗体，与单纯使用黄牛IgG免疫兔的方法相比，①产生的兔抗黄水牛IgG抗体效价高4倍(l:64vs I : 16)，兔抗黄水牛IgG抗体效价高可以相对减少用量，降低成本使用黄、水牛IgG免疫兔制备的兔抗黄水牛IgG抗体可以提高血吸虫阳性水牛血清中抗体检测的敏感性。用兔抗黄牛IgG抗体制备的试纸条检测实验感染血吸虫尾蝴49天的2倍稀释水牛血清，呈现阳性反应，检测3倍稀释血清只呈现弱阳性反应(+)，但用兔抗黄水牛IgG抗体制备的试纸条检测同样3倍稀释血清，却呈现强阳性反应(+++)。所以用本发明的兔抗黄水牛IgG抗体制备免疫探针试剂液比使用通常的兔抗黄牛IgG抗体更具优势。
图I贴标签胶膜前试纸条的结构示意2贴标签胶膜后试纸条的结构示意图 其中，I样品垫、2免疫探针干片、3层析膜、4吸水纸、5PVC基板、6检测T线、7质控C线、8箭头标签胶膜、9手柄标签胶膜本发明以图2作为摘要附图。
实施方式通过以下实施例和试验例并结合附图对本发明作进一步的详细描述，但本发明的内容并不局限于此。实施例I :(检测牛日本血吸虫病抗体试纸条的制备I)I试纸条的制备I. I免疫探针干片制备I. I. I兔抗黄水牛IgG的制备⑴黄水牛IgG的提取①无菌操作采集健康黄牛及水牛血液，分别分离血清。②取黄牛及水牛血清各5ml混合，再加IOml O. 85%NaCl混匀，逐滴加入饱和硫酸铵(SAS) 8. 6ml使之达到30%饱和度，边加边搅拌，并用浓氨水调节pH值至7. O,置4°C过夜，取出室温平衡lhr，以3000r/min离心30min，弃上清，沉淀物加入20ml O. 85%NaCl溶解。再逐滴加入SAS 10. 8ml使之达到35%饱和度，边加边搅拌，用浓氨水调节pH值至
7.0，置4°C 3hr后取出，室温平衡lhr，以3000r/min离心30min，弃上清，沉淀物加入20ml0.85%NaCl溶解。用35%饱和度硫酸铵再重复提取一次。离心后沉淀物用5ml O. 85%NaCl溶解后，装入直径2cm的透析袋透析内密封。③在4°C条件下进行透析，开始先用蒸馏水透析8小时，换液4次，再用O. OlmolPH7. O磷酸盐缓冲液(PB)透析6小时，换液2次，以除去NH4+及S042。透析后的黄水牛IgG即可达到免疫兔的纯度要求。④用紫外分光光度法测得黄水牛IgG蛋白质浓度为5. 3mg/ml, PEG浓缩调整为
10mg/mlο⑵黄水牛IgG免疫兔①试验动物选体重2. 5kg健康雄性家兔2只。②黄水牛IgG的乳化首免的油乳剂由黄水牛IgG与弗氏完全佐剂按3:7比例混合，超声波击打使之乳化，直至将黄水牛IgG油乳剂滴于冷水表面，能较长时间保持完整而不分散，即可应用。2-4免的油乳剂由黄水牛IgG与弗氏不完全佐剂按3:7比例制成。③免疫首次免疫在兔头颈部皮下、兔双侧后足踱垫皮下各注射黄水牛Ig乳剂4ml (黄水牛IgG的蛋白总量为12mg)，两周后，每周用黄水牛IgG加强免疫I次，免疫黄水牛IgG的蛋白总量为12mg。如次重复3次，末次免疫10天后，耳静脉取少量血，分离出血清，用琼脂扩散法测定免疫血清的效价，待血清效价达I :64或以上时即心脏采血，分离血清。⑶兔抗黄水牛IgG抗体的提取①取兔抗黄水牛IgG血清IOml，加入等量的O. 85%NaCl混匀，逐滴加入SAS10. 8ml使之达到35%饱和度，边加边搅拌，并用浓氨水调节pH值至7. 0，置4°C过夜后取出，室温平衡I小时，以3000rpm离心30min，弃上清，沉淀物加入20ml O. 85%NaCl溶解。置40C 3hr后取出，室温平衡lhr，逐滴加入SAS10. 8ml使之达到35%饱和度，边加边搅拌，用浓氨水调节PH值至7. 0，置4°C 3hr后取出，室温平衡I小时，以35%饱和度硫酸铵再重复提取一次，离心后沉淀物用5ml O. 85%NaCl溶解后，装入直径2cm的透析袋内。⑷透析提纯透析在4 °C下进行，开始先用蒸馏水透析8小时，换液4次，再用
O.Olmol pH7. O磷酸盐缓冲液(PB)透析6小时，换液2次，以除去NH4+及SO42' (5)蛋白含量测定用紫外分光光度法测得兔抗黄水牛IgG的蛋白质浓度为5. Omg/ml，用pH7. 20. IM硼酸缓冲液稀释成含蛋白4mg/ml，-20°C贮存备用。1.1.2试剂配制(I) IN NaOH 称取 NaOH 2. OOOg,蒸馏水定容至 50ml。⑵pH6. 50. Imol MES称取MES O. 4881g,蒸馏水定容至25ml，滴加IN NaOH使溶液pH达到6. 5。(3) 20mg/ml NHS 称取 NHS O. 050g,加蒸馏水 2. 5ml 溶解。(4) 20mg/ml EDC · HCl 称取 EDC · HCl O. 050g,加蒸馏水 2. 5ml 溶解(5)0. IM硼酸溶液称取硼酸O. 6183g，用蒸馏水定容至100ml。(6) O. 025M硼砂溶液称取硼砂O. 4767g，用蒸馏水定容至50ml。(7) ρΗ7· 20. IM硼酸缓冲液取O. Imol硼酸溶液95ml加O. 025mol硼砂溶液5ml混
八
口 ο(8) O. 2M Tris 称取 Tris 12. 114g,用蒸馏水定容至 500ml。(9) O. IN HCl吸取12N浓盐酸4. 167ml，放入容量瓶，用蒸馏水定容至500ml(10) O. 05M Tris-HCl 缓冲液①ρΗ7· 20. 05Μ Tris-HCl 缓冲液取 O. 2Μ Tris 25ml 加 O. IN HCl 45ml 混合，再加蒸馏水至100ml。②ρΗ8· 20. 05Μ Tris-HCl 缓冲液取 O. 2Μ Tris 25ml 加 O. IN HCl 22. 5ml 混合，再加蒸馏水至100ml。(11) pH7. 2 封闭液称取酪蛋白 O. 500g、蔗糖 5. 00g、NaN3O. 020g 全部放入 IOOmlPH7. 20. 05M Tris-HCl缓冲液中，37 40°C水浴加热至完全溶解。即成含酪蛋白O. 5%，蔗糖5%，NaN3O. 02%的ρΗ7· 20. 05Μ Tris-HCl缓冲液构成的封闭液。(12) 2. Omg/ml兔抗黄水牛IgG抗体吸取兔抗黄水牛IgG (5mg/ml) 8ml加入到12mlpH7. 20. 05mol硼酸缓冲液中混合均匀。(13) 20%BSA溶液称取进口 BSA 2. OOOg,用IOml蒸馏水溶解。I. I. 3乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG结合物的制备⑴乳胶微球的洗漆红色乳胶微球，直径300nm,在IOOOOrpm, 4 °C条件下离心IOmin,去上清液，沉淀用适量的高纯水还原为原体积，用超声波分散沉淀的乳胶微球，使之成为均匀的悬浮液，再用上述相同的参数重复洗涤(即离心及重悬浮)I 2次。
⑵取I. 5ml塑料离心管24支，往每支离心管中加入O. 9ml pH6. 50. ImolMES, O. 2ml红色乳胶微球，混合均匀。再加入O. Iml EDC · HCl (20mg/ml)和O. 075mlNHS (20mg/ml)混合均匀。⑶在垂直混合仪上振荡混合2hr。(4) 10000rpm，4°C，离心lOmin，去上清，每支离心管的沉淀用Iml pH7. 20. IM硼酸缓冲液重悬，超声波(2sX5次)匀质。在垂直混合仪上振荡混合15min。(5)重复⑷的操作，只是每支离心管的沉淀用O. 5ml硼酸缓冲液重悬。(6)往每支离心管中加入蛋白含量lmg/ml的兔抗黄水牛IgGO. 5ml,在垂直混合仪上振荡混合2hr。(7)往每支离心管中加入20%BSA O. Iml,在垂直混合仪上振荡混合lhr。 (8) IlOOOrpm, 4°C，离心25min，去上清，每支离心管的沉淀用Iml封闭液重悬，超声波(2sX5次)勻质。在垂直混合仪上振荡混合15min。(9)重复(7)的操作，只是每支离心管的沉淀用0. 75ml pH7. 2封闭液重悬。超声波(2sX5次)匀质。最后得到的不透明红色悬浮液即为乳胶微球标记的兔抗黄水牛IgG结合物，即免疫探针检测试剂液。I. I. 4免疫探针干片的制备I. I. 4. I 聚酯膜处理液的配制 0. 2M Tris 125ml,0. IN HCl 225ml,酪蛋白 2. 5g,蔗糖25g，NaN3O. Ig混合，37°C水浴溶解，再加入吐温-201. Oml搅拌均匀，加蒸馏水至500ml混合均匀，即成含酪蛋白0. 5%，蔗糖5%, NaN3O. 02%,吐温-200. 2%的ρΗ7· 20. 05Μ Tris-HCl缓冲液构成的聚酯膜处理液。I. I. 4. 2聚酯膜的预处理将聚酯膜切成300mmX 17mm的小条，放入聚酯膜处理液中浸泡4hr，取出平放在搪瓷盆中，37°C烘干，装入封口塑料袋中，置4 8°C冰箱中冷藏保存备用。I. I. 4. 3免疫探针干片制作用划膜喷金机将乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG结合物以5μ Ι/cm的流速喷涂在已处理过的聚酯膜上，每条聚酯膜(300mmX17mm)以纵向中心线为轴，对称地喷2条乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG结合物条带，37 °C烘干，切成300mmX8. 5mm的小条，则成免疫探针干片。将免疫探针干片密封在塑料袋中，置4 8°C冰箱中冷臧保存，备用。I. 2层析膜的制备I. 2. I血吸虫抗原的制备I. 2. I. I血吸虫虫卵的制备I. 2. I. I. I血吸虫尾蝴接种兔将保存在4°C冰箱中的日本血吸虫阳性钉螺，用前取出200个，置25°C室温I 2hr后，放在装有脱氯水的IOOml烧杯内逸放尾蝴。兔腹部剃毛，使皮肤裸露。用接种环小心在液面挑取液体，置于载玻片上，在显微镜下对尾蝴计数后，将有尾蝴的载玻片贴于兔(体重2. 5 3kg的健康新西兰兔)腹部皮肤暴露处5 IOmin,完成感染，每只兔感染尾蝴约2000条。I. 2. I. I. 2血吸虫虫卵的分离将感染45d的兔取出肝脏，除去胆囊、胆管、血管及结缔组织，用4°C预冷的l%NaCl洗净血污，将肝脏剪成碎块，加l%NaCl, —并倒入捣碎机内快速捣碎(8000rpm)捣碎过程分4次,间隔进行,每次捣2min,停2min。捣碎的肝脏加l%NaCl稀释，用60、80、100和120目的标准筛过滤。滤液再用260目尼龙网过滤。将尼龙网上虫卵粗提物用l%NaCl洗脱。将洗脱液倒入50ml的消毒离心管内，以3500rpm离心lmin，弃去上、中层，下层金黄色虫卵反复用l%NaCl洗涤，离心，直至看不到灰褐色的肝组织为止。将获得的虫卵再用尼龙絹(140、260目)重叠过滤，除去残留的肝组织细胞，260孔尼龙絹上物，经离心沉淀反复除去白褐色絮状物，即得纯净的血吸虫卵。将纯净虫卵分装于I. 5ml Eppendorf管中，12000r/min离心30s,以进一步去除虫卵中的水分。I. 2. I. I. 2血吸虫虫卵的干燥和保存将虫卵置平血中，用冷冻干燥机冻干。密封，置-20°C保存。I. 2. I. 2血吸虫抗原的提取⑴取血吸虫虫卵Ig先用玻璃勻衆器研磨30min,再加少量O. 85%NaCl研磨30min,然后配成3%悬液，置4°C冰箱浸泡3d，-200C反复冻融10次，冰浴超声裂解30min (400W)， 13000rpm离心lhr，取上清即成未透析血吸虫可溶性抗原I。-20°C保存，或者直接进行下一步处理。⑵将⑴步骤离心沉淀物用5ml O. 85%NaCl重悬，冰浴超声裂解IOmin (400W)，垂直混合仪上作用15min, IOOOOrpm离心lhr,取上清即为未透析血吸虫可溶性抗原2。⑶取血吸虫虫卵Ig先用玻璃勻衆器研磨30min,再加少量O. 85%NaCl研磨30min,然后配成3%悬液，置4°C冰箱浸泡3d，_20°C反复冻融10次，冰浴超声裂解30min(400W)，10000r/min离心lhr,取上清即成未透析血吸虫可溶性抗原3。I. 2. I. 3血吸虫抗原的透析取血吸虫抗原适量，装入透析袋，用pH7. 00. OlM PB透析16hr，每隔4hr换透析液I次，透析结束后，以10000r/min离心60min,上清液即为已透析血吸虫抗原。测蛋白含量后，或按体积定量分装，放_20°C保存，或按蛋白量定量分装，冻干，-20°C保存备用，或直接配制生产用抗原。I. 2. I. 4抗原蛋白含量测定(蛋白测定仪的测定原理相同，已实现程序化和微量化测定)随机取已透析血吸虫抗原3瓶，用pH7. 00. OlmolPB作为稀释液和空白对照，于紫外分光光度计测定吸收值(A28CI&A26CI)。按公式蛋白含量(mg/ml)=(I. 45 X A280-O. 74 X A260) X稀释倍数，计算每Iml抗原的蛋白含量，取平均值。I. 2. I. 5生产用血吸虫抗原的配制I. 2. I. 5. I抗原稀释液的配制(I) O. 2mol Tris溶液配制称取Tris 2. 4228g，蒸馏水定容至100ml，即为O. 2MTris溶液。(2) O. IN HCl溶液配制吸取分析纯浓盐酸4. 167ml，蒸馏水定容至500ml。(3) ρΗ8· 20. 05Μ TBS 缓冲液配制 O. 2Μ Tris 溶液 25ml 和 O. IN HCl 22. 5ml 混合，加入NaCl O. 85g,溶解,再用蒸懼水加至IOOml即成。I. 2. I. 5. 2生产用血吸虫抗原的配制根据透析处理后抗原蛋白的含量，用pH8. 20. 05M TBS缓冲液将已透析的抗原稀释成含蛋白lmg/ml的生产用抗原。I. 2. 2羊抗兔IgG的制备
I. 2. 2. I 兔 IgG 的制备⑴兔血清的制备按无菌操作要求，用心脏采血法采集健康新西兰肉兔的血液，分
离血清。⑵兔IgG的提取取兔血清10ml，再加IOml O. 85%NaCl混匀，逐滴加入SAS 10. 8ml使之达到35%饱和度，边加边搅拌，并用浓氨水调节pH值至7. 0，置4°C过夜后取出，室温平衡I小时，以3000rpm离心30min，弃上清，沉淀物加入20ml O. 85%NaCl溶解。再用35%饱和度硫酸铵同法沉淀2次。只是4°C静置时间改为3hr。第3次离心后沉淀物用5ml O. 85%NaCl溶解后，装入直径2cm的透析袋透析内。⑶透析提纯透析于4°C条件下进行，开始先用蒸馏水透析8小时，换液4次，再用PH7. 00. OlM磷酸盐缓冲液(PB)透析6小时，换液2次，以除去以除去NH4+及SO广。⑷蛋白浓度测定用蛋白测定仪测得兔IgG蛋白质浓度为7. 7mg/ml，用PEG浓缩后·调整为10mg/ml。_20°C保存备用。I. 2. 2. 2 兔 IgG 免疫羊⑴实验动物选健康雄性波尔山羊2只，体重20kg/只。 (2)兔IgG的乳化首免兔IgG油乳剂由兔IgG与弗氏完全佐剂按3:7比例乳化，冰浴超声波击打至将兔IgG油乳剂滴于冷水表面，较长时间保持完整而不分散，即可应用。2-4免的IgG油乳剂由兔IgG与弗氏不完全佐剂按3:7比例制备。⑶免疫首次免疫在羊头颈部皮下、羊双侧后足踱垫皮下各注射兔IgG油乳剂
6.4ml (兔IgG的蛋白含量为19. 2mg)，两周后，每2周用兔IgG加强免疫I次，免疫兔IgG的蛋白总量为19. 2mg。如此重复3次，末次免疫8天后，耳静脉取少量血，分离出血清，用琼脂扩散法测定免疫血清的效价，待血清效价达1:32时即可釆血，分离血清。即为含羊抗兔IgG的血清。I. 2. 2. 3羊抗兔IgG的提取⑴羊抗兔IgG提取取羊抗兔IgG血清10ml，再加IOml O. 85%NaCl混匀，逐滴加入SAS 8.6ml使之达到30%饱和度，边加边搅拌，并用浓氨水调节pH值至7. O，置4°C过夜后取出，室温平衡I小时，以3000rpm离心30min，弃上清，沉淀物加入20ml O. 85%NaCl溶解。再逐滴加入SAS16. 4ml使之达到45%饱和度，边加边搅拌，用浓氨水调节pH值至7. O,置40C 3hr后取出，室温平衡lhr，以3000rpm离心30min，弃上清，沉淀物加入20ml O. 85%NaCl溶解。再用45%饱和度硫酸铵提取一次，离心后沉淀物用5ml O. 85%NaCl溶解后，装入直径2cm的透析袋透析内。⑵透析提纯透析于4°C条件下进行，开始先用蒸馏水透析8hr，换水4次，再用pH7. 00. OlM磷酸盐缓冲液(PB)透析6hr,换液2次。透析液3000rpm离心30min取上清液。即为羊抗兔IgG抗体溶液。⑶蛋白浓度测定用紫外分光光度法测得羊抗兔IgG抗体的蛋白质浓度为IOmg/ml, -20°C贮存备用。I. 2. 2. 4生产用羊抗兔IgG的配制⑴羊抗兔IgG稀释液的配制羊抗兔IgG稀释液与抗原稀释液相同，配制方法见
1.2. 1. 5. I ο⑵生产用羊抗兔IgG的配制
O. 5mg/ml羊抗兔IgG的配制蛋白含量lOmg/ml的羊抗兔IgG O. 5ml与ρΗ8· 20. 05MTBS缓冲液9. 5ml混合即成。I. 2. 3硝酸纤维素膜的裁剪和贴片选用的硝酸纤维素膜为伊能膜业有限公司的YN120BLF膜，先将膜裁剪成300mmX 25mm的小段，取PVC底板(300mmX80mm)，揭去中间一条保护纸，露出不干胶层，将硝酸纤维素膜有塑料膜背衬的一面粘贴在PVC底板上。1.2.4在硝酸纤维素膜上划出T线和C线将稀释后的血吸虫抗原和羊抗兔IgG抗体用划膜喷金机以3 μ 1/cm的流速，在已粘贴在PVC底板上的硝酸纤维素膜中间划检测T线和质控C线，其中血吸虫抗原划在靠近将来粘贴免疫探针干片一侧，羊抗兔IgG抗体划在靠近粘贴吸水纸一侧，两条线相距5 6mm ο1.2. 5烘膜与保存将已划好T线和C线的硝酸纤维素膜连同底板置室内晾干，装入密封塑料袋中置4 8°C冰箱中保存备用。I. 3样品垫的制作I. 3. I样品垫处理液的配制I. 3. I. 1ρΗ7. 2 样品垫处理液 O. 2M Tris IOOml, O. IN HCl 180ml,酪蛋白 O. 250g,蔗糖25. OOOg, NaN3O. IOOg混合，37°C水浴溶解，再加入I. Oml吐温-20搅拌均匀，加蒸馏水至500ml混合均匀，即成含酪蛋白O. 5%,蔗糖5%, NaN3O. 02%,吐温-200. 2%的ρΗ7· 20. 04ΜTris-HCl缓冲液构成的样品垫处理液。I. 3. 2样品垫的制作将玻璃纤维素膜切成23mmX300mm小条，用样品垫处理液浸泡lhr，取出，在37°C烘箱中烘干，即成样品垫。I. 4吸水纸的制作将吸水纸(型号CH37)裁剪成28mmX300mm的小条，在37°C烘箱中烘干即成。I. 5标签胶膜的制作I. 5. I箭头标签胶膜的制作箭头标签胶膜是一种300mmX 18mm的不干胶粘贴纸,在距一条长边Imm处有一条直线，紧挨着这条直线，每隔I. 3mm印有“一MAX”字样，箭头与直线垂直。其作用，一方面是指示试纸条插入待检样品液的最大深度；另一方面是保护免疫探针干片不被污染。I. 5. 2手柄标签胶膜的制作绿色标签保护贴纸由300mmX30mm的不干胶粘贴纸印制，与短边呈15°角，印有4排绿底白字的“SjAb”字样，表示用于检测血吸虫抗体，并保护吸水纸在手拿取时免受污染。I. 6试纸条大卡的组装I. 6. I取2. 2步骤已粘贴好层析膜的PVC底板，揭掉PVC板边上宽度最大的一块保护纸，露出不干胶层，将吸水纸粘贴上去，使之与层析膜重叠约I 2mm。I. 6. 2取手柄标签胶膜，揭去保护纸，露出不干胶层，将它粘贴在吸水纸上。I. 6. 3揭掉PVC板上层析膜边上一小条保护纸，露出不干胶层，将免疫探针干片(300mmX8. 5mm)粘贴在PVC板的不干胶上,使免疫探针干片与层析膜重叠约1_。I. 6. 4揭掉PVC板上在免疫探针干片边上的保护纸，露出不干胶层，将预处理过的样品垫粘贴上去，使之与聚酯膜重叠约I 2mm。I. 6. 5取箭头标签胶膜粘贴在免疫探针干片和与之相邻的部分样品垫上，使保护膜的空白侧紧贴在层析膜边缘重叠约1_，箭头侧紧贴样品垫，免疫探针干片完全被标签胶膜覆盖，各部件压平压实即组成大卡。I. 7切条、包装和贮存1.7. I 切条将试纸条大卡用切条机切成80mmX3mm的试纸条，即为本发明的牛日本血吸虫病抗体检测试纸条。1.7. 2 包装1.7. 3试纸条的包装 80mmX 3mm的试纸条按10条/包、20条/包或50条/包的规格，用铝箔袋密封包装。I. 7. 4 贮存试纸条在2 8°C贮存，有效期为12个月。15 30°C室温贮存，有效期为6个月。实施例2 (检测牛日本血吸虫病抗体试纸条的制备2)I试纸条的制作⑴免疫探针干片制备同实施例I中I. 1，但有5处不同①使用300nm蓝色乳胶微球。②在乳胶微球标记时所用兔抗黄水牛IgG蛋白含量为2mg/ml。③封闭液配制称取酪蛋白O. 500g、蔗糖10. OOOg、NaN3O. 020g全部放入IOOmlPH7. 20. 05M Tris-HCl缓冲液中，37 40°C水浴加热至完全溶解。即配制成含酪蛋白O. 5%，蔗糖10%，NaN3O. 02%的pH7. 20. 05M Tris-HCl缓冲液构成的封闭液。④聚酯膜处理液配制O. 2M Tris 125ml,O. IN HCl 225ml,酪蛋白2. 500g，蔗糖50. OOOg, NaN3O. IOOg混合，37 °C水浴溶解，再加入吐温-201. 5ml搅拌均匀，加蒸馏水至500ml混合均匀。即配制成含酪蛋白0. 5%,蔗糖10%，NaN3O. 02%,吐温-200. 3%的ρΗ7· 20. 05ΜTris-HCl缓冲液构成的聚酯膜处理液。⑤将乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG结合物喷涂在已处理过的聚酯膜上时，划膜喷金机设定的流速为4 μ 1/cm。⑵层析膜的制备同实施例I中I. 2，但有数处不同①稀释抗原和羊抗兔IgG抗体的缓冲液为pH8. 50. 05M TBS缓冲液，配制方法为0. 2mol Tris溶液25ml和0. IN HCl 15ml混合，加入NaCl 0. 850g，溶解，再用蒸馏水加至IOOml即成。②划线用血吸虫虫卵抗原的蛋白含量为3mg/ml。③划线用羊抗兔IgG抗体的蛋白含量为0. lmg/ml ο④血吸虫虫卵抗原和羊抗兔IgG抗体的划膜流速均为2 μ 1/cm。⑤样品垫处理液的配制0. 2M Tris 100ml,0. IN HCl 180ml，酪蛋白0. 250g，蔗糖50. OOOg, NaN3O. Ig混合，37°C水浴溶解，再加入I. Oml吐温-20搅拌均匀，加蒸馏水至500ml混合均匀。即配制成含酪蛋白0. 5%,蔗糖10%，NaN3O. 02%,吐温-200. 2%的pH7. 20. 04MTris-HCl缓冲液构成的样品垫处理液。
其余如样品垫制备、吸水纸制备、试纸条大卡的组装和切条等制作步骤均与实施例I相同。实施例3 (检测牛日本血吸虫病抗体试纸条的制备3)I试纸条的制作⑴免疫探针干片制备冋实施例I中I. I，但有4处不冋①在乳胶微球标记时所用兔抗黄水牛IgG蛋白含量为3mg/ml。②封闭液配制称取酪蛋白O. 300g、蔗糖5. OOOg、NaN3O. 030g全部放入IOOmlPH7. 20. 05M Tris-HCl缓冲液中，37 40°C水浴加热至完全溶解。即配制成含酪蛋白O. 3%，蔗糖5%，NaN3O. 03%的pH7. 20. 05M Tris-HCl缓冲液构成的封闭液。③聚酯膜处理液配制O. 2M Tris. 125ml,O. IN HCl 225ml,酪蛋白I. 500g,蔗糖 25. OOOg, NaN3O. 150g混合，37 °C水浴溶解，再加入吐温-202. Oml搅拌均匀，加蒸馏水至500ml混合均匀。即配制成含酪蛋白0. 3%,蔗糖5%，NaN3O. 03%,吐温-200. 4%的pH7. 20. 05MTris-HCl缓冲液构成的聚酯膜处理液。④将乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG结合物喷涂在已处理过的聚酯膜上时，划膜喷金机设定的流速为3 μ 1/cm。⑵层析膜的制备同实施例I中I. 2，但有数处不同①稀释抗原和羊抗兔IgG抗体的缓冲液为pH8. 50. 05M TBS缓冲液，配制方法见实施例2。②划线用血吸虫虫卵抗原的蛋白含量为5mg/ml。③划线用羊抗兔IgG抗体的蛋白含量为lmg/ml。④血吸虫虫卵抗原和羊抗兔IgG抗体的划膜流速均为I μ 1/cm。⑤样品垫处理液的配制0. 2M Tris 100ml,0. IN HCl 180ml，酪蛋白0. 150g，蔗糖25. OOOg, NaN3O. 250g混合，37°C水浴溶解，再加入2. Oml吐温-20搅拌均匀，加蒸馏水至500ml混合均匀。即配制成含酪蛋白0. 03%,蔗糖5%，NaN3O. 05%,吐温-200. 4%的pH7. 20. 04MTris-HCl缓冲液构成的样品垫处理液。其余如样品垫制备、吸水纸制备、试纸条大卡的组装和切条等制作步骤均与实施例I相同。实施例4:(检测牛日本血吸虫病抗体试纸条的制备4)I试纸条的制作⑴免疫探针干片制备同实施例I中I. 1，但有5处不同①使用200nm蓝色乳胶微球。②在乳胶微球标记时所用兔抗黄水牛IgG蛋白含量为4mg/ml。③封闭液配制称取酪蛋白0. 200g、蔗糖10. 000g、NaN3O. 050g全部放入IOOmlPH7. 20. 05M Tris-HCl缓冲液中，37 40°C水浴加热至完全溶解。即配制成含酪蛋白0. 2%，蔗糖10%，NaN3O. 05%的pH7. 20. 05M Tris-HCl缓冲液构成的封闭液。④聚酯膜处理液配制0. 2M Tris 125ml,0. IN HCl 225ml,酪蛋白l.OOOg，蔗糖50. 000g, NaN3O. 250g混合，37°C水浴溶解，再加入吐温-202. 5ml搅拌均匀，加蒸馏水至500ml混合均匀。即配制成含酪蛋白0. 2%,蔗糖10%，NaN3O. 05%,吐温-200. 5%的ρΗ7· 20. 05ΜTris-HCl缓冲液构成的聚酯膜处理液。。
⑤将乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG结合物喷涂在已处理过的聚酯膜上时，划膜喷金机设定的流速为2 μ 1/cm。⑵层析膜的制备同实施例I中I. 2，但有数处不同①稀释抗原和羊抗兔IgG抗体的缓冲液为pH8. 50. 05M TBS缓冲液，配制方法见实施例2。②划线用血吸虫虫卵抗原的蛋白含量为7mg/ml。③划线用羊抗兔IgG抗体的蛋白含量为2mg/ml。④血吸虫虫卵抗原和羊抗兔IgG抗体的划膜流速均为I μ 1/cm。⑤样品垫处理液的配制O. 2M Tris 100ml,O. IN HCl 180ml,酪蛋白O. 050g，蔗 糖50. OOOg, NaN3 O. 250g混合，37 °C水浴溶解，再加入2. 5ml吐温-20搅拌均匀，加蒸馏水至500ml混合均匀。即配制成含酪蛋白O. 01%,蔗糖10%，NaN3O. 05%,吐温-200. 5%的PH7. 20. 04M Tris-HCl缓冲液构成的样品垫处理液。其余如样品垫制备、吸水纸制备、试纸条大卡的组装和切条等制作步骤均与实施例I相同。实施例5 (应用试纸条检测牛日本血吸虫病抗体的方法)I待检血清I. I血吸虫阳性牛血清实验感染血吸虫尾蝴1000 1500条感染35 49d的2头牛血清6份，湖北自然感染血吸虫并经粪孵确诊的牛血清4份。I. 2血吸虫阴性牛血清采自血吸虫非疫区浙江金华健康牛血清10份，实验感染锥虫牛血清5份，自然感染肝片吸虫病牛血清5份。2试纸条本试验所用试纸条为实施例2工艺参数制备的试纸条。3检测步骤3. I血清稀释液的配制将Na2HP04、KH2PO4, NaCl与蒸馏水按重量体积O. 199g O. 082g Ig 200ml比例混合，37 40°C水浴加热溶解、冷却后即成血清稀释液；(2)待检牛血清的稀释取I. 5ml塑料离心管60支，编号，其中30支离心管每管加入血清稀释液O. 05ml，另30支管加入血清稀释液O. Iml,每支离心管中再加入待检血清
O.05ml，将待检牛血清与血清稀释液分别按体积I: I和1:2比例混合稀释；(3)检测操作取试纸条60支，平放在操作台上，吸取稀释后的待检血清O. 05ml滴在试纸条的样品垫上；(4)结果判定5 15min后观察结果，无论是待检牛血清与血清稀释液按体积I: I或1:2比例稀释，6份实验感染血吸虫病牛血清和4份自然感染牛血清，试纸条的检测T线和质控C线均呈现蓝色条带，判为阳性；而10份非疫区健康牛血清、5份锥虫病牛血清和5份肝片吸虫病牛血清，仅在试纸条的质控C线位置呈现I条蓝色条带，故判为阴性。本试验测试的试纸条按照试纸条的使用方法检测和判断结果，能够正确地检测出血吸虫病阳性牛血清，未见与锥虫病、肝片吸虫病牛血清有交叉反应。试验例I :(试纸条的敏感性试验)I试纸条本试验所用试纸条为实施例3工艺参数制备的试纸条。2待检血清样品用血吸虫尾蝴感染10头健康黄牛，每头感染尾蝴500 1000条，于感染前(Od)和感染后不同时间采血，制备血清。3检测操作待检血清用血清稀释液(配方见“应用试纸条检测牛日本血吸虫病抗体的方法”)2倍稀释，吸取O. 05ml稀释血清滴加到试纸条的样品垫上，进行免疫层析反应。5 15min根据T线和C线位置显现的颜色判定阴阳性，2条红线判阳性，I条红线判阴性。4检测结果见表I。表I试纸条的敏感性检测情况表
感染Iy验感￥血吸虫病巧I:编-'
□数 1丨2丨3|4丨5丨6|7丨8|9|10 λ 一一 一一 一一 一一 I 一一·
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49 + + + + + + + + I + +结果，试纸条检测感染前10头牛血清，全部为阴性反应。检验感染后28d牛血清，有2头牛血清检出阳性反应。实验感染35d 49d的10头牛血清全部检出血吸虫抗体(检出率100%)。据另外的试验，IHA法能够检出实验感染血吸虫35d以及35d以上的血样。说明试纸条的敏感性与IHA法相似或略高。但IHA法检测一个样品约需I 2hr，而用试纸条检测，操作更简单，5 15分钟就能得出结果。试验例2 (试纸条的特异性试验)I试纸条本试验所用试纸条为实施例I工艺参数制备的试纸条。2待检血清样品非疫区健康牛血清20份；血吸虫病阳性牛血清40份，其中实验感染血吸虫尾蝴35 49d牛血清20份，自然感染血吸虫并经粪孵毛蝴法证实阳性的牛血清20份；自然感染东毕吸虫，并经粪检确诊的牛血清20份；自然感染肝片吸虫，经粪检虫卵法证实的奶牛血清15份；实验感染锥虫牛血清15份。3检测操作与结果判定见“应用试纸条检测牛日本血吸虫病抗体的方法”。4检测结果见表2。表2试纸条的特异性检测情况表
血吸虫病 ~东Ψ吸虫病 U I—片吸虫病 I； ,-I1 /I - rfl >+- /作,...Ir/4- rfrl ,/(,… 维虫病牛血洽健康牛血 + -
牛血沾牛血沾牛血浦
ft ft 率数数率数数率数数率数数率(份)(份)(%)(份)(份)(%)(份)(份)(%)(份)(份)(%)(份)(份)(%)~4040IOO 20OO 15O O InO O20O(Γ~用试纸条检测实验感染和自然感染血吸虫病40头牛血清，均为阳性反应。检测东毕吸虫、肝片吸虫、锥虫病牛和健康牛的血清，均为阴性反应。说明该试纸条有较强的特异性，在所检测的样品中未见与其他寄生虫病有交叉反应。试验例3 :(试纸条批内批间可重复性试验)I试纸条本试验所用试纸条的批次为20091103、20091105、20091109、20091111、20091113。按照实施例2工艺参数制备。只是制作T线的血吸虫抗原，前2批所用血吸虫可溶性抗原是由5%虫卵悬液开始制备，而后3批可溶性抗原是由3%虫卵悬液开始制备。用于划线时的浓度均稀释成含蛋白3mg/ml。其他制备条件均相同。2待检血清血吸虫病阳性血清50份(实验感染血吸虫尾蝴500 1000条35 49d的牛血清30份，湖北、四川等疫区自然感染血吸虫并经粪孵法证实的牛血清20份)，血吸虫病阴性牛血清80份(浙江金华、衢州等地牛血清60份，采自浙江富阳屠宰场来自吉林、山东等省黄牛血清20份)。3检测操作待检血清前4次重复用血清稀释液作2倍稀释，第5次重复血清稀释液作3倍稀释，加样量为O. 05ml。各批次的试纸条重复检测5次，比较检测结果，观察试纸条批内批间检测结果的可重复性。4检测结果测定结果总结在表3中。表3试纸条的批间和批内的重复性测定结果情况表
权利要求
1.一种检测牛日本血吸虫病抗体的试纸条，其特征在于该试纸条由部件样品垫、免疫探针干片、层析膜、吸水纸、PVC基板及箭头标签胶膜与手柄标签胶膜组合而成；其中，免疫探针干片是以红色或其它颜色羧基化聚苯乙烯乳胶微球的羧基，与兔抗黄水牛IgG抗体蛋白的胺基形成共价键结合物后作为免疫探针的检测试剂液吸附于聚脂膜后制成；层析膜是以硝酸纤维素膜为膜基，用划膜喷金机将血吸虫卵可溶性抗原和羊抗兔IgG抗体分别在该膜上画出检测T线和质控C线而成；先将上述前四部件按头尾部分重叠粘合装配在PVC基板上，再将箭头标签胶膜粘贴在免疫探针干片上，另将手柄标签胶膜粘贴在吸水纸上后，用切条机按设定宽度裁切后即成牛日本血吸虫病抗体检测试纸条。
2.一种制备权利要求I所述牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的方法，其特征在于按以下步骤进行 (O免疫探针干片的制备包括 1)兔抗黄水牛IgG的制备 ①黄水牛IgG的制备采集健康黄牛、水牛血液,分别分离血清后取血清各5ml混合，加等量O. 85% NaCl，用30%硫酸铵沉淀法提取黄水牛IgG，沉淀的黄水牛IgG用原血清体积2倍量的O. 85% NaCl溶解，再用35%硫酸铵沉淀法重复提取2次，最后用5ml O. 85% NaCl溶解离心沉淀的黄水牛IgG，用透析法除去溶液中的NH4+及SO/—后，再用蒸馏水稀释或将透析袋放入PEG中浓缩的方法，调节蛋白浓度至10mg/ml后，于_20°C密封贮存备用； ②黄水牛IgG免疫兔将黄水牛IgG与弗氏完全佐剂按体积3:7比例制成油乳剂，按黄水牛IgG 6mg/只兔用量，对体重2. 5kg的健康雄性家兔，在兔颈部皮下和兔双侧后足踱垫皮下注射进行首次免疫；后除用弗氏不完全佐剂替代弗氏完全佐剂外，再按上述同样配t匕、方法，每隔两周进行一次加强免疫，共进行三次；第4次后10天，取耳静脉少量血分离血清，用琼脂扩散法测定免疫血清效价，当血清效价> 1:64时，即可心脏大量釆血、分离血清后，备用; ③兔抗黄水牛IgG抗体的制备取兔抗黄水牛IgG血清10ml，以35%硫酸铵沉淀法提取兔抗黄水牛IgG抗体，以2倍于血清量的O. 85% NaCl溶解沉淀的兔抗黄水牛IgG抗体，如此反复提取3次后，将第3次硫酸铵沉淀的兔抗黄水牛IgG抗体的离心沉淀物以5ml O. 85%NaCl溶解，用透析法除去溶液中的NH4+及S042_ ;在蛋白测定仪上测定兔抗黄水牛IgG抗体蛋白含量后，用PH7. 20 O. IM的硼酸缓冲液稀释或将透析袋放入PEG中浓缩的方法，将蛋白浓度调节至4mg/ml后，于-20°C密封贮存备用； 2)乳胶微球的洗涤将直径200nm红色或其它颜色的聚苯乙烯乳胶微球液，在10000rpm, 4°C条件下离心lOmin，去上清液，沉淀物用高纯水还原为原体积，用超声波分散沉淀的乳胶微球成为均匀悬浮液后，再用上述相同的方法重复离心、重悬浮I 2次； 3)乳胶微球羧基的激活将pH6.5 O. Imol MES, 10%带色乳胶微球的悬液，20mg/mL的EDC · HCl和20mg/mL的NHS,按体积9:2:1:0. 75 ^比例混合、反应2hr ;然后在11000 rpm4°C条件下离心25min，除去上清液，沉淀物以所用带色乳胶体积5倍量的pH7. 20 O. IM的硼酸缓冲液重悬，以超声波击打还原成均匀的悬浮液；用垂直混合仪混合15min，在11000rpm,4°C条件下离心25min除去上清液,沉淀物以所用带色乳胶体积2. 5倍量的pH7. 20O. I M的硼酸缓冲液重悬，以超声波击打还原成均匀的悬浮液，即为羧基活化的乳胶微球； 4)乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG抗体往装有羧基活化乳胶微球悬浮液的离心管中加入等体积以pH7. 20 O. IM的硼酸缓冲液稀释成蛋白浓度为I 4mg/mL的兔抗黄水牛IgG抗体,在垂直混合仪上混合反应2hr以上；再加入总体积十分之一量的20%BSA振荡反应lhr，反应后的混合物以11000 rpm 4°C离心25min，除去上清液，沉淀物以含酪蛋白O. 2% O. 5%、蔗糖 5% 10%、NaN3 O. 02% O. 05% 的 ρΗ7· 2 O. 05Μ Tris-HCl 缓冲液构成的封闭液原体积重悬，超声波击打还原成均勻的悬浮液，在垂直混合仪上混合15min,再次以IlOOOrpm 4°C离心25min,除去上清液,沉淀物以相当于乳胶微球悬浮液和兔抗黄水牛IgG抗体两者总体积75%的同上封闭液重悬，超声波击打还原成均匀的悬浮液，该液即为红色或其它颜色的免疫探针检测试剂液；· 5)免疫探针干片的制备将上述的免疫探针检测试剂液用划膜喷金机以2 5μ 1/cm的流速喷涂在已经过含酪蛋白O. 2% O. 5%，蔗糖5% 10%，NaN3 O. 02% O. 05%, Tween-20O. 2% O. 5%的pH7. 2 O. 05M Tris-HCl缓冲液构成的聚酯膜处理液预处理后的长300mmX宽8. 5mm的聚酯膜上，经37°C，Ihr烘干，即为免疫探针干片； (2)层析膜的制备 1)血吸虫卵可溶性抗原的制备按体重2.5 3kg的健康新西兰兔，每只接种血吸虫尾蝴2000条，实验感染兔于接种后45日屠宰取肝脏，分离和纯化血吸虫虫卵，经冷冻干燥后研磨破碎，用O. 85%NaCl溶液配成3% 5%悬浮液，2 8°C浸泡3日，再反复冻融10次，冰浴超声波破碎30min, 10000r/min离心lhr,取上清液,装透析袋,用pH7. O O. OlM PB透析16小时，每隔4小时换透析液I次，透析结束后，以IOOOOrp离心60min，上清液即为血吸虫卵可溶性抗原；检测其蛋白含量后，用PH8. 2 8. 5 O. 05M TBS稀释至I 7mg/mL浓度，即可用于层析膜上检测T线的绘制； 2)羊抗兔IgG的制备 ①兔IgG的制备以心脏采血法采集健康新西兰兔的血液,分离血清,取兔血清10ml，再加IOml O. 85% NaCl混匀，用35%硫酸铵沉淀法提取兔IgG，反复沉淀提取3次，沉淀物用5ml O. 85% NaCl溶解后，用透析法除去硫酸铵，并在蛋白测定仪上测定兔IgG的蛋白含量； ②羊抗兔IgG抗体的制备用弗氏佐剂将兔IgG溶液配制成lmg/ml,用超声波制成乳浊液；按照每千克体重2mg的剂量皮下注射免疫羊，每间隔2周，再用弗氏不完全佐剂和兔IgG制备成相同浓度的乳浊液，以相同剂量与方法免疫羊，第3次免疫后IOd颈静脉采血分离血清，以琼脂免疫扩散法测定血清中羊抗兔IgG抗体效价> 1:32以上时，即可大量采集羊血并制取血清； 分离羊抗兔IgG抗体先用30%硫酸铵沉淀法提取粗羊抗兔IgG抗体一次,再用45%硫酸铵沉淀法提取2次，离心沉淀物用5ml O. 85% NaCl溶解，用透析法除去溶液中的NH4+及S042-，3000rpm离心30min，检测上清液蛋白含量后，用pH8. 2 8. 5 O. 05M TBS将上清液稀释成O. I 2mg/mL的浓度，即可用于层析膜上质控C线的绘制； 3)检测线和质控线的制作将长25mmX宽300mm的硝酸纤维素膜放在划膜喷金机的操作平台上，在该机1#泵的试剂瓶中加入血吸虫卵可溶性抗原，2#泵的试剂瓶中加入羊抗兔IgG，以I 3 μ 1/cm的流速，在硝酸纤维素膜上划出检测T线和质控C线，两线相距5 6mm，置室内晾干即为层析膜； (3)样品垫的制备将23mmX300mm玻璃纤维膜在由含酪蛋白O. 01% O. 05%，蔗糖5% 10%、NaN3 O. 02% O. 05% 和 Tween-20 O. 2% O. 5% 的 ρΗ7· 2 O. 04Μ Tris-HCl 缓冲液构成的样品垫处理液中浸泡lhr，取出，37°C烘干即成； (4)吸水纸的制备CH37吸水纸裁成长300mmX宽28mm的纸条，置37°C烘干即成； (5)PVC基板的制备PVC板其结构为三层，第一层为保护纸，第二层为不干胶，第三层为PVC基板；在保护纸上刻有三条刻痕，分别位于距离一侧长边的20mm、27mm和53mm处；将PVC板按长300mmX宽80mm规格裁剪后备用； (6)标签胶膜的制备用不干胶贴纸印制而成；其中， 1)箭头标签胶膜其规格为长300mmX宽18mm，在距一侧长边Imm处印有一条直线，在该直线的上方，每隔I. 3mm印有一条“一MAX”字样，箭头与直线垂直；指示试纸条样品垫可浸入待测溶液的最大深度不得超过这条直线； 2)手柄标签胶膜其规格为长303mmX宽30mm，绿底白字，与长边呈15°夹角印有4列“SjAb”字样，SjAb为Schistosoma japonicum Antibody的缩写，表示该试纸条用于检测日本血吸虫抗体，该部位为试纸条拿取时的手柄部位； (7)试纸条各部件的组装、切条、包装和贮存 O试纸条各部件的组装试纸条以长300mmX宽80mm的PVC为基板，依次将300mmX 23mm的样品垫、300mmX 8. 5mm的免疫探针干片、300mmX 25mm的层析膜及300mm X 28mm的吸水纸，按头尾各有I 2_的重叠连接、粘贴在带不干胶面的PVC基板上；再在吸水垫的尾部与免疫探针干片上粘贴上箭头标签胶膜；另在样品垫上粘贴上手柄标签胶膜；各部件压平，粘贴牢固即成试纸条大卡； 2)切条将试纸条大卡放在切条机上，按3mm宽度连续切割，即成宽3mmX长80mm的试纸条； 3)包装与贮存试纸条抽检合格后，按包装规格要求装入铝箔袋中，放入I小包干燥剂后，封口，即成产品；在2 8°C保存，有效期为12个月。
3.应用权利要求I所述试纸条检测牛日本血吸虫病抗体的方法，其特征在于按以下步骤进行 (1)血清稀释液的配制将Na2HPO4,KH2PO4,NaCl与蒸馏水按重量体积O. 199g O. 082g Ig 200ml比例混合，37 40°C水浴加热溶解、冷却后即成血清稀释液； (2)待检牛血清的稀释将待检牛血清与血清稀释液按体积I:I 2比例混合稀释； (3)检测操作吸取稀释的待检血清O.05ml滴在平放的试纸条的样品垫上，或将试纸条的样品垫端插入待检稀释血清中至箭头标签胶膜所印的直线条15s后，平放在操作台面上； (4)结果判定5 15min后观察结果，检测T线和质控C线均呈现红色或其它颜色的同色条带，则判为阳性；仅质控C线呈现I条红色或其它颜色的条带，则判为阴性；检测T线和质控C线均不呈现条带，则说明该试纸条已失效或试验操作有误。
全文摘要
本发明公开了一种牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的制备及其应用方法，属于动物寄生虫病诊断技术领域。试纸条由样品垫、免疫探针干片、层析膜、吸水纸、PVC基板及箭头标签胶膜与手柄标签胶膜组合而成。免疫探针干片是以聚苯乙烯乳胶微球的羧基与兔抗牛IgG抗体蛋白的胺基形成共价键结合物后吸附于聚脂膜后制成；层析膜是以锚固在硝酸纤维素膜上的血吸虫可溶性抗原为检测线、羊抗兔IgG抗体为质控线制成；可快速检测牛血清中的血吸虫抗体，操作简便，结果直观、准确。可广泛用于牛血吸虫病的诊断、普查和检疫。
文档编号G01N33/558GK102944675SQ20121044299
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月7日 优先权日2012年11月7日
发明者卢福庄, 张雪娟, 顾昀, 付媛, 季敬余, 冯尚连, 俞国乔, 杨玉焕, 周煜, 阳爱国, 董国栋, 郭莉, 毛光琼, 石团员 申请人:浙江省农业科学院