一种用于酸性磷酸酶检测的液体试剂盒和检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于酸性磷酸酶检测的液体试剂盒，包括含有酸性磷酸酶的底物的基质液，和含有对底物反应后的产物有显色反应的显色剂的显色液，基质液和显色液分开存放在各自合适的pH条件，使用时按比例混合得到工作液。该液体试剂盒使用方便，稳定性好。
【专利说明】一种用于酸性磷酸酶检测的液体试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生化分析领域。更具体地讲，本发明涉及检测生物样本中酸性磷酸酶的液体试剂盒，及应用该试剂盒检测酸性磷酸酶活性的方法。
【背景技术】
[0002]酸性磷酸酶(ACP)是一种在酸性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸的水解酶，它存在于前列腺、肝脏、脾和血细胞等多种人体器官中，但以前列腺含量最为丰富。当这些组织细胞受损伤时，ACP释放至血浆中。因此，检测人体液，特别是血清或血浆中ACP的含量，是常见的生化检测项目。
[0003]目前，市面上用于检测ACP的体外诊断试剂盒主要采用的方法是以α-萘基磷酸为底物，在酸性条件下，血清ACP催化α-萘基磷酸水解生成α-萘酚和磷酸，α -萘酚与重氮试剂反应生成偶氮化合物，偶氮化合物在405nm处有特异吸收，通过测定在405nm处吸光度的变化速率来计算ACP的活性。该方法采用连续检测法，操作相对简单、方便，但试剂中的α -萘基磷酸和重氮试剂在ACP的最适pH值pH5.0左右的缓冲液中稳定性差、极易水解，导致液体试剂稳定性差。虽然多数厂家采用冻干的方法推出了干粉试剂盒，从而解决成品贮存与运输的问题，然而在使用过程中仍然受到了复溶后稳定性的影响和复溶水的加样误差造成的瓶间差的影响。而且在使用中，如果包装太大，复溶后稳定期过后便会造成浪费；如果包装太小，本身价格高，增加化验成本。
[0004]因此本领域需要开发一种稳定的，便于存贮与运输，方便使用的ACP检测液体试剂盒。
【发明内容】
[0005]本发明一方面提供了一种用于酸性磷酸酶检测的液体试剂盒，包括基质液和显色液，基质液和显色液分开存放，基质液含有酸性磷酸酶的底物，显色液含有对所述底物反应后的产物有显色反应的显色剂。
[0006]本发明另一方面还提供了一种检测生物样本中酸性磷酸酶活性的方法，包括
[0007]提供基质液，基质液含有酸性磷酸酶的底物；
[0008]提供显色液，显色液含有对所述底物反应后的产物有显色反应的显色剂；
[0009]将基质液和显色液按比例混合得到工作液，所述工作液的pH值在4-6 ；
[0010]将待测的含有酸性磷酸酶的生物样本与工作液混合，孵育反应后，检测吸光度值；
[0011]根据吸光度值计算得到酸性磷酸酶的活性。
[0012]本发明所公开的试剂盒，在混合后得到的试剂具有单试剂的性质，使用方便，测量精密度高。具体而言，具有以下优点:
[0013]1、与现有干粉类产品相比，本发明中的ACP定量检测试剂盒为全液体试剂，使用前混合基质液和显色液，操作相对复溶干粉试剂简便，成分更均一，可减小瓶间差，提高试剂测定的重复性。
[0014]2、用户可根据每次标本量多少按一定比例配制适量工作液，即配即用，这样便可减少试剂损失，降低化验成本。
[0015]3、将底物和显色剂分别存贮在各自最稳定的pH范围，利用pH值的差异，临用前按比例配制成工作溶液，提高试剂的稳定性。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1显示的是实施例的ACP液体试剂盒的线性范围。
【具体实施方式】
[0017]本发明的其它方面和优点在阅读以下描述和具体实施方案后将变得显而易见。
[0018]定义
[0019]除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
[0020]本文中使用的术语“底物”，是指能被酸性磷酸酶水解的化合物，包括但不限于
α-萘基磷酸酯等磷酸酯类化合物。
[0021 ] 本文中使用的术语“显色剂”，是指能与酸性磷酸酶水解底物后的产物发生显色反应的化合物，包括但不限于4-氯-2-甲基苯重氮化盐等重氮盐类化合物。
[0022]本文中使用的术语“生物样本”，指来自生物体的样本,包括但不限于体液、血清和血浆。
[0023]本文中使用的术语“缓冲对”，是指组成缓冲溶液的共轭酸碱对的两类物质，它们合称为缓冲对(buffer pair)，包括但不限于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲对，乙酸-乙酸钠缓冲对。
[0024]本文中使用的术语“烷基”，是指含碳和氢的完全饱和的无环单价基团，其可为支链或直链。烧基的实例为甲基、乙基、正丁基、叔丁基、正庚基和异丙基。除非另有说明，否则本文描述的烷基优选为在主链含有1-10个碳原子且至多20个碳原子的低级烷基，以甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戍基和异戍基为例。
[0025]本发明提供一种ACP定量检测液体试剂盒，包括基质液和显色液，基质液和所述显色液分开存放，基质液含有酸性磷酸酶的底物，显色液含有对底物反应后的产物有显色反应的显色剂。所谓分开存放，是指基底液和显色液在空间上相互独立，可以分别放置在两个容器中，可以是具有两个相互空腔的容器中。
[0026]I)基质液，含有酸性磷酸酶底物，该底物可以与ACP进行催化反应，例如被ACP水解，一般为磷酸酯，优选α-萘基磷酸酯。
[0027]2)显色液，含有显色剂，例如重氮盐。底物，例如α-萘基磷酸酯，被样本中ACP水解，生成的酚可与重氮盐反应生成有颜色的偶氮化合物，因此特定波长处吸光度发生变化，通过检测该吸光度的变化速率可计算ACP的活性。所述重氮盐优选4-氯-2-甲基苯重氮化盐(4-chloro-2_methylbenzenediazonium salt,又名 Fast Red TR Salthemi (zincchloride) salt),也可采用其他易与酹生成偶氮化合物的重氮盐替换。
[0028]优选的，基质液中还含有缓冲液，将基质液维持在底物稳定的pH范围。如果底物选择α-萘基磷酸酯，可以将基质液的pH值维持在8-11，优选10。可以选择pHIO的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。其他缓冲液也可以，只要能满足PH缓冲要求即可。如果底物选择其他的化合物，根据该化合物溶液稳定的pH范围，相应选择合适的缓冲液即可。
[0029]优选的，显色液还含有缓冲液，将显色液维持在底物稳定的pH范围。如果显色剂选择4-氯-2-甲基苯重氮化盐之类的重氮盐，可以将显色液的pH值维持在小于等于3，优选1-2，可以选择pHl的甘氨酸-盐酸缓冲液。其他缓冲液也可以，只要能满足pH缓冲要求即可。如果显色剂选择其他的化合物，根据该化合物溶液稳定的PH范围，相应选择合适的缓冲液即可。
[0030]优选的，基质液和显色液中含有能将两者混合后形成的工作液的pH值维持在4-6的缓冲对。由于测定中，基质液和显色液混合形成工作液后，样本与工作液混合测定，而ACP催化水解反应的合适PH在pH4-6之间，在基质液和显色液中分别添加pH4-6缓冲对中的一种物质，以便基质液和显色液混合后，该缓冲对产生合适的缓冲能力，维持工作液的pH值。具体而言，如果基质液中的底物为α -萘基磷酸酯，可以在基质液中添加缓冲对中的碱性物质，例如柠檬酸三钠、乙酸钠或磷酸氢二钠，显色液中添加缓冲对中的酸性物质，例如柠檬酸、乙酸。
[0031]优选的，基质液和/或显色液还含有非离子表面活性剂，优选烷基酚聚氧乙烯类非离子表面活性剂，通式为
[0032]
【权利要求】
1.一种用于酸性磷酸酶检测的液体试剂盒，包括基质液和显色液，所述基质液和所述显色液分开存放，所述基质液含有酸性磷酸酶的底物，所述显色液含有对所述底物反应后的产物有显色反应的显色剂。
2.根据权利要求1所述的液体试剂盒，其特征在于:所述底物选自磷酸酯，优选α-萘基憐酸酷。
3.根据权利要求1所述的液体试剂盒，其特征在于:所述显色剂选自重氮盐，优选4_氣_2_甲基苯重氣化盐。
4.根据权利要求1所述的液体试剂盒，其特征在于:所述基质液含有PH值8-11的缓冲液，优选PH值为10的缓冲液。
5.根据权利要求1所述的液体试剂盒，其特征在于:所述显色液含有PH值小于3的缓冲液，优选PH值1-2的缓冲液。
6.根据权利要求1所述的液体试剂盒，其特征在于:所述基质液和所述显色液混合后得到工作液，所述基质液中还含有缓冲对的两类物质中的一类，所述显色液还含有所述缓冲对的两类物质中的另一类，所述缓冲对能将所述工作液的PH值维持在pH4-6。
7.根据权利要求6所述的液体试剂盒，其特征在于:所述基质液中含有所述缓冲对的两类物质中的碱性物质，所述显色液含有所述缓冲对的两类物质中的酸性物质。
8.根据权利要求1所述的液体试剂盒，其特征在于:所述基质液和/或显色液还含有非离子表面活性剂，优选所述非离子表面活性剂具有通式I的结构
9.根据权利要求1所述的液体试剂盒，其特征在于:所述显色液还含有阴离子表面活性剂，优选所述阴离子表面活性剂具有通式II的结构
R-SO3Na (II)
R % C8-C20 烷基。
10.一种检测生物样本中酸性磷酸酶活性的方法，包括 提供基质液，所述基质液含有酸性磷酸酶的底物； 提供显色液，所述显色液含有对所述底物反应后的产物有显色反应的显色剂； 将所述基质液和所述显色液按比例混合得到工作液，所述工作液的pH值在4-6 ； 将待测的含有酸性磷酸酶的生物样本与所述工作液混合，孵育反应后，检测吸光度值； 根据所述吸光度值计算得到所述酸性磷酸酶的活性。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于:所述基质液的底物为α-萘基磷酸，所述基质液的PH值为8-11。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于:所述显色液的显色剂为重氮盐，所述显色液的pH值小于3。
【文档编号】G01N21/78GK103808712SQ201210436202
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月5日 优先权日:2012年11月5日
【发明者】杜少卿, 蔡锦刚, 唐玮 申请人:深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司