专利名称：一种Aβ-淀粉样多肽1-42纯度的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种Αβ -淀粉样多肽1-42纯度的检测方法，特别涉及一种利用反相高效液相色谱法以及不同键合填料的色谱柱来检测Αβ -淀粉样多肽1-42纯度的方法。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease，AD)是一种发病率高、危害极大的中枢神经··系统退行性疾病，主要临床症状是智力进行性减退，特征性病理学改变是老年斑，神经元纤维缠结，以海马、皮层区域为主的神经元数目减少。淀粉样多肽1-42 (Amyloids 1-42peptide,简称Αβ42)是存在于阿尔茨海默病患者脑组织中的特异病理改变之物，同时它在AD患者的脑积液及血浆中有所改变。研究表明A β -淀粉样多肽1-42在脑内的沉积是阿尔茨海默病的主要原因，因此纯品Αβ -淀粉样多肽1-42对阿尔茨海默病的病理研究有非常重要的作用。目前对Αβ -淀粉样多肽1-42的药理研究也已有多种测定方法，如酶联免疫吸附测定法(ELISA),放射免疫分析法(RIA)或免疫放射分析法(ImmunoradiometriassayIRMA) , Western 印迹法(Western Boltting)免疫沉淀法(Immunoprecipi-tation)和免疫组织化学法(Immunohistochemical, IHC),各种不同检测方法的选择和应用，主要取决于实验研究的要求和目的。以上所有方法的建立是由于制备出了灵敏度高，特异性强和准确性好的A β -淀粉样多肽1-42，而对利用HPLC反相高效液相色谱法制备出来的A β -淀粉样多肽1-42进行纯度的检测就显得尤为重要。对利用HPLC反相高效液相色谱法制备出来的A β -淀粉样多肽1-42的检测，目前多数都是利用TFA体系和以聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料(PLRP-S柱)居多，由于PLRP-S柱特殊的不耐压特点，为此所得到的Αβ -淀粉样多肽1-42不但色谱峰形不对称而且所得到的理论纯度与实际纯度差异比较大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用反相高效液相色谱法检测Αβ -淀粉样多肽1-42纯度的方法，主要解决现有检测方法中以聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料不耐压导致理论纯度与实际纯度差异比较大，以及对色谱柱以及缓冲盐的选择局限性的技术问题。为实现上述目的，本发明的技术方案如下
一种Αβ -淀粉样多肽1-42纯度的检测方法，包括如下步骤
O将Αβ-淀粉样多肽1-42用超纯水超声溶解至完全，用滤膜过滤，取滤液待用。2)利用反相高效液相色谱法，对滤液进行检测，其检测条件是
色谱柱C4硅胶柱，C8硅胶柱，
流动相A相甲酸的水溶液；B相甲酸的乙腈溶液 C4柱时间(min)ABO90%10%
25.0040%60%
30.0090%10%
C8柱时间(min)AB
O85%15%
25.0035%65%
30.0085%15%
上述％是质量百分浓度，流速lml/min,波长220nm。更为优选的方案是Αβ -淀粉样多肽1-42与超纯水添加比例1-2:1 (mg:ml)，进一步优选为I: I (mg:ml)，Αβ -淀粉样多肽1-42上样量通常为O. 1-0. 2mg。更为优选的方案是所用C4硅胶柱尺寸为5um，4.6X250mm (LD)0更为优选的方案是所用C8硅胶柱为尺寸5um，4. 6X250mm (LD)0 更为优选的方案是所用的流动相的体系是含体积浓度为O. 05-0. 1%甲酸水溶液和体积浓度为O. 05-0. 1%甲酸乙腈溶液。更为优选的方案是所用的流动相中C4柱B相的质量百分比浓度为10-60%。更为优选的方案是所用的流动相中C8柱B相的质量百分比浓度为15-65%。更为优选的方案是步骤2)中C4柱的流动相梯度选择O到25min A:B由90:10到40:60。步骤2)中C8柱的流动相梯度选择O到25min A:B由85:15到35:65。色谱条件的选择 I.流动相的选择
目前常用的Αβ -淀粉样多肽1-42纯度检测的流动相体系是体积浓度为O. 1%的三氟乙酸体系和PLRP-S柱的结合，其检测出来的色谱峰很宽，不能形成很好的对称色谱峰形。也选用其它经常检测多肽的体系进行相关的实验，如醋酸胺缓冲液体系，甲酸体系。这三种体系对A β -淀粉样多肽1-42分离效果基本差不多。而本发明的甲酸色谱条件下A β -淀粉样多肽1-42的峰形稍微比较对称一些，并且甲酸体系也比较容易配置得到。2.色谱柱的选择
Αβ-淀粉样多肽1-42的性质及序列使它在色谱柱中极易造成峰形扩散，一般的以硅胶基质为的C18键合相填料基本无法使峰聚集而在色谱柱中出现很好的色谱峰，所以目前多数选择使用以聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料(PLRP-S柱)，因为其有很好的聚合性，所以用此填料的色谱柱检测Αβ -淀粉样多肽1-42纯度居多。但是聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物又存在一定的缺点，就是聚合物色谱柱的柱效比较低，分离效果比较差，主要是由于以聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料不耐压，对装此填料的装柱技术要求极高不仅装柱困难，而且所装出来的色谱柱的理论塔板数也比较低。故此本发明选择键合填料为C4货C8的色谱柱，一方面是由于键合填料为C4或C8的色谱柱的孔径不仅大于普通C18的色谱柱孔径，而且对于疏水性的分子量稍大的蛋白在一定程度上也有比较好的聚合性；另一方面，C4或CS的键合填料其耐压程度远远高于聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料，所以其装柱出来的色谱柱柱效高，分离效果好。3.梯度的选择
针对Αβ-淀粉样多肽1-42峰形易扩散的特点，不管是以聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料色谱柱还是以键合填料为C4或CS的色谱柱，我们在梯度的选择上都是选用较宽的梯度作为A β -淀粉样多肽1-42的检测梯度条件。由于C4和C8其碳链长度的不同的，Αβ -淀粉样多肽1-42在C4和CS色谱柱上的保留强弱有一些区别，在CS色谱柱的保留时间比在C4色谱柱上的保留时间更久一些，所以C4色谱柱的梯度选择为B相的质量百分比浓度10-60%，C8色谱柱的梯度选择为B相的质量百分比浓度15-65%。本发明的有益效果是解决了现有对Αβ-淀粉样多肽1-42纯度检测方法的局限性，利用甲酸体系和键合填料为C4和CS的条件，不仅能解决A β -淀粉样多肽1-42色谱峰形不对称的缺点，而且也大大减小了理论纯度与实际纯度的误差。此方法的建立为利用HPLC反相高效液相色谱法制备出来的Aβ -淀粉样多肽1-42进行纯度的检测提供了更多更方便可靠的检测途径。大部分对Αβ-淀粉样多肽1-42检测色谱柱都使用的是PLRP-S (刚性聚合物色谱柱)，而本发明使检测方法不仅在体系上，而且在色谱分析柱上都有了更多样的选择。
图I为PLRP-S填料色谱柱在TFA体系下的检测图。图2为PLRP-S填料色谱柱在甲酸体系下的检测图。图3为C4键合相填料色谱柱甲酸体系下的检测图。图4为CS键合相填料色谱柱甲酸体系下的检测图。
具体实施例方式实施例I
I.样品处理称取O. Img的Αβ -淀粉样多肽1-42，用O. Iml的超纯水超声溶解至完全，用O. 45um的滤膜过滤,取滤液待用。2.色谱检测条件日本岛津液相色谱仪(型号LC_10AVP，高压双泵，紫外检测器)，岛津N2000工作站。流动相A相体积浓度为O. 1%三氟乙酸的水溶液，B相体积浓度为O. 1%三氟乙酸的乙腈溶液，梯度O到25分钟A:B由90:10到50:50 ;流速lml/min ；波长220nm ;色谱柱=PLRP 柱，IOum,4. 6X250mm (I. D);进样量0. lmg/0. lml，5ul。3.通过色谱仪的紫外检测吸收得PLRP-S填料色谱柱在TFA体系下的检测图(图1)。实施例2
I.样品处理称取O. Img的Αβ -淀粉样多肽1-42，用O. Iml的超纯水超声溶解至完全，用O. 45um的滤膜过滤,取滤液待用。2.色谱检测条件日本岛津液相色谱仪(型号LC_10AVP，高压双泵，紫外检测器)，岛津N2000工作站。流动相A相体积浓度为O. 1%三氟乙酸的水溶液，B相体积浓度为O. 1%三氟乙酸的乙腈溶液，梯度O到25分钟A:B由90:10到50:50 ;流速lml/min ；波长220nm ;色谱柱=PLRP 柱，IOum,4. 6X250mm (I. D);进样量0. lmg/0. lml，5ul。3.通过色谱仪的紫外检测吸收得PLRP-S填料色谱柱在甲酸体系下的检测图(图2)。实施例3I.样品处理称取O. Img的Αβ -淀粉样多肽1-42，用O. Iml的超纯水超声溶解至完全，用O. 45um的滤膜过滤,取滤液待用。2.色谱检测条件日本岛津液相色谱仪(型号LC_10AVP，高压双泵，紫外检测器)，岛津N2000工作站。流动相A相体积浓度为O. 05-0. 1%甲酸的水溶液，B相体积浓度为O. 05%-0· 1%甲酸的乙腈溶液，梯度O到25分钟A:B由90:10到40:60 ;流速:1ml/min ;波长220nm ;色谱柱:C4 柱,5um, 4. 6 X 250mm (I. D);进样量:0. lmg/0. lml, 5ul。3.通过色谱仪的紫外检测吸收得C4填料色谱柱在甲酸体系下的检测图(图3)。实施例4
I.样品处理称取O. Img的Αβ -淀粉样多肽1-42，用O. Iml的超纯水超声溶解至完全，用O. 45um的滤膜过滤,取滤液待用。
2.色谱检测条件日本岛津液相色谱仪(型号LC_10AVP，高压双泵，紫外检测器)，岛津N2000工作站。流动相A相体积浓度为O. 05-0. 1%甲酸的水溶液，B相体积浓度为O. 05%-0· 1%甲酸的乙腈溶液，梯度O到25分钟A:B由90:15到35:65 ;流速:1ml/min ;波长220nm ;色谱柱:C8 柱,5um, 4. 6X 250mm (I. D);进样量:0. lmg/0. lml, 5ul。3.通过色谱仪的紫外检测吸收得CS填料色谱柱在甲酸体系下的检测图(图4)。
权利要求
1.ー种AP -淀粉样多肽1-42纯度的检测方法，其特征是包括如下步骤 将AP-淀粉样多肽1-42用超纯水超声溶解至完全，再用滤膜过滤，取滤液待用； 利用反相高效液相色谱法，对滤液进行检测，其检测条件是 色谱柱C4硅胶柱，C8硅胶柱， 流动相A相甲酸的水溶液，B相甲酸的こ腈溶液， C4柱时间minAB O90%10% 25.0040%60% 30.0090%10% C8柱时间minAB 085%15% 25.0035%65% 30.0085%15% 流速lml/min,波长220nm。
2.根据权利要求I所述的ー种AP-淀粉样多肽1-42纯度的检测方法，其特征是所述 >C4娃胶柱尺寸为5um,4. 6X250mm。
3.根据权利要求I所述的ー种AP-淀粉样多肽1-42纯度的检测方法，其特征是所述C8娃胶柱尺寸为5um, 4. 6 X 250mm。
4.根据权利要求I所述的ー种AP-淀粉样多肽1-42纯度的检测方法，其特征是所述A相是含体积浓度为0. 05-0. 1%甲酸水溶液，所述B相是体积浓度为0. 05-0. 1%甲酸こ腈溶液。
5.根据权利要求I所述的ー种AP-淀粉样多肽1-42纯度的检测方法，其特征是步骤2)中C4柱的流动相梯度选择0到25min A:B由90:10到40:60。
6.根据权利要求I所述的ー种检测AP-淀粉样多肽1-42纯度的方法，其特征是步骤2)中C8柱的流动相梯度选择0至Ij 25min A:B由85:15到35:65。
全文摘要
本发明公开了一种Aβ-淀粉样多肽1-42纯度的检测方法，利用反相高效液相色谱法以及不同键合填料的色谱柱来检测Aβ-淀粉样多肽1-42纯度，以解决现有对Aβ-淀粉样多肽1-42纯度检测方法的局限性，为检测Aβ-淀粉样多肽1-42纯度提供更多的途径。其检测条件为色谱柱C4硅胶柱，C8硅胶柱；流动相A相甲酸水溶液，B相甲酸乙腈溶液，C4柱0到25分钟A∶B由90∶10到40∶60；C8柱0到25分钟A∶B由85∶15到35∶65；流速1ml/min，波长220nm，样品浓度0.1mg-0.2mg/0.1ml，上样量0.1-0.2mg。本发明无论在色谱柱的选择上还是流动相的试剂上，都是很容易得到的，成本低，操作方便，更能达到检测Aβ-淀粉样多肽1-42纯品纯度的目的。
文档编号G01N30/88GK102955014SQ20121039848
公开日2013年3月6日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者徐红岩, 闫凤 申请人:上海吉尔多肽有限公司, 吉尔生化(上海)有限公司