专利名称：一种鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的引物及试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种家畜口蹄疫感染与免疫鉴别试剂盒。
技术背景
口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)又称 口疮热(Aphthous fever),是由口蹄 疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、高 度接触性传染病。除了猪、牛、羊等主要家畜之外，FMDV还可以感染三十多种野生动物，感染 后发病率几乎高达100%。患病动物的口、舌、蹄和乳房等部位出现水泡，破溃并形成烂斑。 人也可以感染FMD，症状较轻，大多病程呈良性经过。世界各国都高度重视FMD疫情，世界动 物卫生组织(OIE)和世界粮农组织(FAO)将其列为A类动物传染病之首。
区分FMD野毒感染动物和疫苗免疫动物能准确反映一个地区的FMD感染状态，也 是OIE判断一个国家或地区有无FMD的依据。在采取FMD计划免疫的预防措施的国家或地 区，也必须实行严格的FMD进口检疫和国内疫情监测。在疫情监测的过程中，通常是以动物 血清抗体检测为主，然而现有的血清学检测方法主要是针对FMDV的结构蛋白(structural protein)抗体的监测，这种检测可以确定动物是否接触过FMDV，但难以区分FMD免疫动 物和自然感染动物。OIE规定存在FMD的地区必须进行疫苗免疫，而且一般采用灭活苗免 疫。因为在疫苗制备过程中，病毒要经过灭活，纯化和乳化等过程，FMDV16的非结构蛋白 (nonstructural protein, NSP)受到严重破坏,疫苗中几乎不存在NSP,因此,免疫动物体内 无NSP抗体。感染FMD的动物，野毒在成熟或装配过程中伴随NSP的产生，因此感染动物体 内存在NSP抗体。所以，检测NSP抗体可以区分免疫动物和感染动物。
NSP抗体检测方法包括以2C、3A、3B、3ABC和3D为基础的琼脂凝胶免疫扩散实 验(AGID)、乳胶凝集实验、酶联免疫吸附实验(ELISA)、酶联免疫电转化斑点实验(enzyme immuno-transfer blotting, EITB)方法和免疫阻断方法(immuno-block method), De Dingo等(1997)应用ELISA的结果表明，ELISA是最佳方法，客观性强，敏感性高，适宜大规 模样品的检测。
但是，现有的检测方法仍存在着缺点和不足，主要有以下几点①未利用噬菌体表 面展示的多拷贝NSP抗原；②抗原分离纯化工艺复杂。发明内容
本发明的主要目的是，提供一种利用噬菌体表面展示的多拷贝NSP抗原，简化抗 原分离纯化制备试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案
一种鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的试剂盒，所述试剂盒包含
一块预包被有吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3ABC抗原的ELISA微 孔板，所述口蹄疫病毒3ABC抗原的氨基酸序列如SEQ ID:No.1所示；
一块预包被有吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3B抗原的ELISA微孔板，所述口蹄疫病毒3B抗原的氨基酸序列如SEQ ID:No. 2所示；
一块预包被有吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3D抗原的ELISA微孔板，所述口蹄疫病毒3D抗原的氨基酸序列如SEQ ID:No. 3所示；
酶结合物山羊抗猪抗体-辣根过氧化物酶结合物的水溶液，浓度为55 μ mo I/L ；
洗涤液0.15mol/L、ρΗ7· 2 的 PBS ；
底物浓度为O. l%g/mL)的TMB水溶液；
显色剂浓度为O. 015%g/mL)的H2O2水溶液；
样本稀释液0. l%g/mL牛血清白蛋白，添加O. l%g/mL叠氮化钠作保护剂；
终止液2mol/L的 H2SO4 ；
阳性对照品含FMDV抗体的猪血清，用蒸馏水按照1:500进行稀释，添加O. l%g/ mL叠氮化钠作保护剂；
阴性对照品不含FMDV抗体的猪血清，用蒸馏水按照1:500进行稀释，添加 O. l%g/mL叠氮化钠作保护剂。
如上所述的试剂盒，其中优选地，所述ELISA微孔板为96孔ELISA微孔板。
如上所述试剂盒的使用方法，其步骤如下
A.用蒸馏水或去离子水将所述洗涤液按1:10的体积比稀释，作为工作洗涤液；
B.用所述样本稀释液 将待检血清按1:100的体积比稀释；
C.取所述阴性对照品和阳性对照品各100μ L分别加入一个反应孔内，并取 100 μ L所述样本稀释液加入一个反应孔内作为空白对照，其余的每个样本检测孔中分别加已稀释待检血清100 μ L ;37°C避光反应30分钟后甩去孔内液体，每个孔内注满所述工作洗涤液，重复洗涤3次，每次洗涤均停留I分钟后甩净拍干；
D.除空白对照孔外其余每孔内加入I滴所述酶结合物，37°C下避光反应30分钟后甩去孔内液体，按照步骤C中所述的操作对孔进行洗涤，拍干；
E.各孔内分别加入所述底物和显色剂各一滴，混匀，37°C下避光显色10分钟，之后分别加入所述终止液一滴，混匀，终止反应；
F.通过仪器判断结果，以空白对照调零，以620nm作参比波长，用酶标仪于450nm 读取0. D值，若检孔0. D值大于阴性对照2.1倍为阳性，当阴性对照0. D值低于0. 08时按 0. 08计算。
注意事项试剂盒在2_8°C下保存，每次取出时先平衡至室温后使用。滴瓶每次用后一定要将盖拧紧，各瓶盖之间不可混用，各试剂盒之间不可混用。
洗涤时将蒸馏水加满孔内，每次停放三十秒钟后甩去孔内液体。禁用自来水等其它水源。
为提高实验的可比性建议使用仪器判读结果，并对阴性对照测复孔以减少误差。
一对鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的引物，其用来克隆口蹄疫病毒3ABC基因， 其特征在于，
上游引物T4-3A的核苷酸序列如SEQ ID:No. 4所示，
下游引物T4-3C的核苷酸序列如SEQ ID:No. 5所示。
一对鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的引物，其用来克隆口蹄疫病毒3B基因，其特征在于，
上游引物T4-3B1的核苷酸序列如SEQ ID:No. 6所示，
下游引物T4-3B2的核苷酸序列如SEQ ID:No. 7所示。
一对鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的引物，其用来克隆口蹄疫病毒3D基因，其特征在于，
上游引物T4-3D1的核苷酸序列如SEQ ID:No. 8所示。
下游引物T4-3D2的核苷酸序列如SEQ ID:No. 9所示。
本发明的有益效果为
本发明首次将口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)3ABC、3B和3D展示在T4噬菌体表面，并使用改造的高效可溶性表达载体对3B蛋白进行融合表达，建立4种区分FMD野毒感染动物和疫苗免疫动物DIVA - ELISA方法。
本发明还提供了利用T4噬菌体表面多拷贝展示口蹄疫病毒NSP抗原3ABC、3B及 3D制备的ELISA试剂盒，为感染与免疫鉴别诊断提供了新的技术手段。
具体实施方式
一、制备抗原蛋白
1.根据GenBank中注册的O型FMDV的3ABC和3D基因序列设计特异性的引物对 T4-3A/T4-3C和T4-3D1/T4-3D2，分别用于克隆和表达3ABC 和3D基因
上游引物T4-3A SEQ ID: No. 4 ；
下游引物T4-3C SEQ ID: No. 5 ；
上游引物T4-3D1 SEQ ID: No. 8 ；
下游引物T4-3D2 :SEQ ID:No.9。
采用RT-PCR方法扩增3ABC和3D基因片段并克隆到pGEM_T Easy载体中进行序列测定。对两个基因的操作过程相同，详述如下。
(I)总 RNA 的萃取
取含FMDV的乳鼠体，剪碎，加入Eppendorf管中称重。按照Ig加入IOmL的比例逐渐加入199培养液(美国Gibco公司产品)，在消毒的玻璃研磨器内反复研磨得到均匀的混悬液。从中吸出250 μ L混悬液，加入TRIZOL LS总RNA抽提溶液(美国Invitrogen公司产品)750 μ L，混合备用，可置-80 V保存。
抽提ΒΗΚ21细胞传代适应的FMDV时，待细胞单层出现100%细胞病变(CPE)时， 细胞脱壁悬浮。无菌收集细胞和培养液，10, OOOrpm离心lOmin。取沉淀,按照每IOcm2的 BHK21细胞单层加入ImL TRIZOL LS，用移液器吹打溶解为均匀的混悬液，即用或置_80°C保存。
将上述制备好的样品置Eppendorf管中，15 30°C下孵育5min。然后按照每ImL TRIZOL LS加入O. 2mL氯仿的比例加入氯仿，盖紧，大力摇动15次(共约15s)，置室温孵育 2-3min后,在预先致冷至2_8°C的冷冻高速离心机中离心15min。
离心后用ImL —次性注射器吸取上清，置新的无菌Eppendorf管中，按照ImL TRIZOL LS原量加入异丙醇O. 5mL,室温下置lOmin，再在预先致冷至2_8°C的冷冻高速离心机中离心IOmin0
用移液器吸去上清，沉淀按TRIZOL LS原量加入等量75%乙醇，轻轻振摇，在预先致冷至2_8°C的冷冻高速离心机中离心15min。用移液器去掉酒精，打开Eppendorf管盖，置超净工作台吹风干燥5-10min。管底 的微量白色物质即为抽提出的总RNA。(2)反转录取0. 2mLEppendorf 管，作为 A 管，加入5 X反转录酶XL缓冲液 4 ii LdNTP5u LRNA 酶抑制剂0.5iiL将A管置冰盒中，加入AMV反转录酶XL2 ii L ;在抽提的总RNA的Eppendorf管中，加入上游引物2u L下游引物2u LDEPC 水3-5 u L轻轻吹打溶解，从中吸取8. 5 ii L加入A管。将A管以5，OOOrpm离心10s，置HYBAID PCR仪中，42°C保温lh。(3) PCR 扩增在0.5mL Eppendorf管中，制备反应体系，总量为lOOyL，其中加入
反转录产物10ul
上游引物1ul
下游引物1ul
ExTM Taq DNA 聚合酶1 ul
lOxExTMTaq 缓冲液10ul
MgCl2 溶液8ul
dNTP混合物5ul
DEPC-水64‘uL5, OOOrpm 离心 10s ;用 0. 2mL Eppendorf 管分装，10 u L/ 管，向每管中加入 10 y L PCR矿物油，5，OOOrpm离心10s。按照温度梯度，置HYBAID梯度PCR仪上，进行降落PCR扩 增，相应的循环条件和温度列表如下
权利要求
1.一种鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含 一块预包被有吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3ABC抗原的ELISA微孔板，所述口蹄疫病毒3ABC抗原的氨基酸序列如SEQ ID:No.1所示；一块预包被有吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3B抗原的ELISA微孔板， 所述口蹄疫病毒3B抗原的氨基酸序列如SEQ ID:No. 2所示；一块预包被有吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3D抗原的ELISA微孔板， 所述口蹄疫病毒3D抗原的氨基酸序列如SEQ ID:No. 3所示；酶结合物山羊抗猪抗体-辣根过氧化物酶结合物的水溶液，浓度为55 μ mo I/L ； 洗涤液0. 15mol/L、pH7. 2 的 PBS ；底物浓度为O. l%g/mL的TMB水溶液；显色剂:浓度为O. 015%g/mL的H2O2水溶液；样本稀释液0. l%g/mL牛血清白蛋白，添加O. l%g/mL叠氮化钠作保护剂；终止液2mol/L 的 H2SO4 ；阳性对照品含FMDV抗体的猪血清，用蒸馏水按照1:500进行稀释，添加O. l%g/mL叠氮化钠作保护剂；阴性对照品不含FMDV抗体的猪血清，用蒸馏水按照1:500进行稀释，添加O. l%g/mL 叠氮化钠作保护剂。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述ELISA微孔板为96孔ELISA微孔板。
3.权利要求1所述试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤如下A.用蒸馏水或去离子水将所述洗涤液按1:10的体积比稀释，作为工作洗涤液；B.用所述样本稀释液将待检血清按1:100的体积比稀释；C.取所述阴性对照品和阳性对照品各100μ L分别加入一个反应孔内，并取IOOyL所述样本稀释液加入一个反应孔内作为空白对照，其余的每个样本检测孔中分别加已稀释待检血清100 μ L ;37°C避光反应30分钟后甩去孔内液体，每个孔内注满所述工作洗涤液，重复洗涤3次，每次洗涤均停留I分钟后甩净拍干；D.除空白对照孔外其余每孔内加入I滴所述酶结合物，37°C下避光反应30分钟后甩去孔内液体，按照步骤C中所述的操作对孔进行洗涤，拍干；E.各孔内分别加入所述底物和显色剂各一滴，混匀，37°C下避光显色10分钟，之后分别加入所述终止液一滴，混匀，终止反应；F.通过仪器判断结果，以空白对照调零，以620nm作参比波长，用酶标仪于450nm读取 O. D值，若检孔O. D值大于阴性对照2.1倍为阳性，当阴性对照O. D值低于O. 08时按O. 08 计算。
4.一对鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的引物，其用来克隆口蹄疫病毒3ABC基因，其特征在于，上游引物T4-3A的核苷酸序列如SEQ ID:No. 4所示，下游引物T4-3C的核苷酸序列如SEQ ID:No. 5所示。
5.一对鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的引物，其用来克隆口蹄疫病毒3B基因，其特征在于，上游引物T4-3B1的核苷酸序列如SEQ ID:No. 6所示，下游引物T4-3B2的核苷酸序列如SEQ ID:No. 7所示。
6.一对鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的引物，其用来克隆口蹄疫病毒3D基因，其特征在于，上游引物T4-3D1的核苷酸序列如SEQ ID:No. 8所示。 下游引物T4-3D2的核苷酸序列如SEQ ID:No. 9所示。
全文摘要
一种鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的试剂盒，包含3块预包被ELISA微孔板分别预包被有吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3ABC抗原、吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3B抗原、吸附T4噬菌体表面多拷贝展示的口蹄疫病毒3D抗原；山羊抗猪抗体-辣根过氧化物酶结合物；洗涤液0.15mol/L、pH7.2的PBS；底物0.1%TMB溶液；显色剂0.015%H2O2；样本稀释液0.1%牛血清白蛋白，0.1%叠氮化钠作保护剂；终止液2mol/LH2SO4；阳性对照品，500倍稀释，0.1%叠氮化钠作保护剂；阴性对照品，500倍稀释，0.1%叠氮化钠作保护剂。
文档编号G01N33/531GK103063838SQ201210385688
公开日2013年4月24日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者林志雄, 田纯见, 马静云, 罗琼, 鱼海琼, 罗长保, 陈茹, 刘志玲, 王宏, 吴晓薇, 毕英佐 申请人:广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心