专利名称：一种vegf单抗及包含该单抗的骨折愈合评价抗体芯片的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种VEGF单抗及包含该单抗的骨折愈合评价抗体芯片。
背景技术：
血管生成在骨折愈合过程中具有重要意义。新的血管形成可能与诸多因素有关，如成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白、转化生长因子。血小板衍生长因子、前列腺素E、血管内皮细胞生长因子、肿瘤坏死因子、胰岛素生长因子I等。血管内皮细胞生长因子(VEGF)对内皮细胞有促进其增殖 和血管生成，增加血管通透性，尤为重要。VEGF通过与血管内皮细胞上的受体结合，具有强大、特异性促血管内皮细胞增生和血管生成作用，是促血管再生的最终通道，其他因子的促血管生成作用是全部或部分通过VEGF的作用得以实现。应用VEGF使骨折端血流量在一定时间内较对照组增高；抗VEGF可导致骨折端血流量明显减少，说明VEGF对骨折端血流量变化可能影响骨折愈合，有重要意义。脑外伤后体液中存在促进骨髓基质干细胞有丝分裂和增殖的细胞因子。其中骨形态发生蛋白(BMP-2)是骨折成功愈合的极重要的因素，然而骨形态发生蛋白似乎并非是脑外伤后骨折愈合加速因素之一；脑外伤后碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)阳性表达提前出现，与血管内皮细胞生长因子(VEGF)有明显的时间和浓度关系，通过血管内皮细胞生长因子的表达促进成骨化；胰岛素生长因子I (IGF- I )在骨折愈合中主要促进软骨的生长；脑源性神经(BDNF)营养因子在骨折愈合各个阶段均有促进作用；血小板衍生因子血清浓度明显低于其他组，作用机制可能是通过血清中胰岛素生长因子II (IGF- II )含量的升高以及局部血小板衍生因子的聚集来完成的，胰岛素生长因子II (IGF- II )血清浓度升高的时间和血小板衍生因子(TOGF)降低的时间均集中在前两周，时间上一致，两者之间可能有协同作用；上皮生长因子(EGF)主要是由炎症细胞单核/巨噬细胞分泌，同时作用于修复细胞成纤维细胞、内皮细胞、表皮细胞等，具有促进细胞增殖的功能。但是，高效价、高特异性的抗人VEGF单克隆抗体及骨折愈合评价抗体芯片目前尚未见到报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种VEGF单抗及包含该抗体的芯片以及应用。本发明的整体技术构思是利用自主设计合成的VEGF多肽(序列为IFQEYPDEIEHFKPS)经免疫动物、细胞融合、亚克隆及酶联免疫吸附实验进行特异性筛选技术，获得高效价、高特异性抗人VEGF单克隆抗体，由于此单抗效价高、特异性好，与另外7种与骨折愈合相关的单克隆抗体点制的抗体芯片，结合CY3标记的补体C3抗体与被检产品建立了完整的检测系统，用于检测及评价骨折愈合效果。此抗体芯片具有灵敏度高，特异性好、操作简单、高通量等优点，可用于临床和体检血清的监测和质控。作为优选，所述单克隆抗体包括单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。本发明所述“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE, IgM, IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd ;和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP. A-0120694和EP. A. 0125023中描述。本发明所述单克隆抗体可以是，例如，单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结
合结构域的任何多肽。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(⑶Rs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP. A. 184187,GB2188638A或.EP. A. 239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的单克隆抗体也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明人源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。如上所述，本发明还提供了用于实施本发明抗体的试剂、试剂盒或芯片。试剂、试剂盒或芯片至少包括如下一种或多种根据以上方法制成的抗体，编码该抗体的核苷酸，或包含该抗体的真核细胞、原核细胞和病毒以及任选的缓冲溶液。作为优选，本发明所述的抗体芯片，还包含特异性结合以下抗原的抗体IGF_1、IGF-2、BMP-2、EGF、PDGF, bFGF、VEGF, BDNF。本发明还提供包含所述抗体芯片的试剂盒，还包含信标分子标记的C3补体抗体，所述信标分子优选为CY3。在具体实施方式
中，本发明还提供VEGF抗体的制备方法，包括如下工艺步骤(I)细胞融合将自主设计合成的VEGF多肽(序列为IFQEYPDEIE HFKPS)免疫动物取其致敏的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞悬液按10-100 1比例混合，加入聚乙二醇(美国Sigma公司出品)使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基(美国海克隆公司出品)进行细胞培养；(2)筛选杂交瘤细胞待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；(3)单克隆抗体特异性筛选选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于I :5000的阳性孔的上清，分别对IGF-I、IGF-2、BMP-2、EGF、PDGF, bFGF、VEGF, BDNF抗原进行特异性和效价筛选。(4)单克隆抗体纯化保存将特异性好和效价高的克隆孔培养液吸出，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪(美国通用公司制造)将IgG单克隆抗体培养上清溶液在A280nm时收集，I. 44 (吸光单位)浓度为l-10mg/ml。筛选的VEGF杂交瘤细胞株分泌的单抗进行序列分析，其重链可变区如下QVQLV QSGAE VKKPG ASVKV SCKAS GGTFS SYAIS WVRQA PGQGL EWMGG FDPED GETIYAQKFQ GRVTM TEDTS TDTAY MELSS LRSED TAVYY CATGR SMVRG VIIPF NGMDV WGQGT TVTVSSY (如 SEQ ID No. I 所示)其轻链可变区如下DIR MTQSP SSLSA SVGDR VTITC RASQSISSYL NWYQQ KPGKA PKLLI YAASS LQSGV PSRFS GSGSG TDFTL TISSL QPEDFATYYC QQSYSTPLTF GGGTK VEIKP (如 SEQ ID No. 2 所示)(5) CY3标记抗体用CY3荧光素标记补体C3抗体。(6)单克隆抗体微阵列点样一张芯片点96个点，与另7种与骨折愈合的单克隆抗体经有限稀释点于芯片上，每一种单抗两个点，每一个点的含量O. 1-lng/ml。本发明的具体工艺步骤和各步骤中的工艺参数是步骤(I)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的比值按1:10-100的比例混合，加入PEG使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第I分钟滴加4. 5ml培养液；间隔2分钟滴加5ml培养液，然后加培养液50ml，以HAT选择培养基按36%的孔为I个细胞/孔进行细胞培养。步骤(2)中是将细胞培养至覆盖0% 20%孔底时，吸取培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。步骤(3)中采用酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于I :5000的阳性孔的上清，分别与8种骨折愈合相关的标志物抗原进行特异性和效价筛选。步骤(4)中将特异性好和效价高的克隆孔培养液吸出，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪(美国通用公司制造)将IgG单克隆抗体培养上清溶液在A280nm时收集，I. 44(吸光单位)浓度为 l-10mg/ml。步骤(5)中选用的是CY3对补体C3抗体的标记步骤(6)中标准品点样矩阵的设计每种抗体重复2-5个点，选取6-18个不同的抗体浓度梯度，6-18个矩阵,采用SmartArrayerTM微阵列芯片点样系统进行点样。本发明所取得技术进步在于所获得的抗人VEGF单克隆抗体分别经AKTA蛋白纯化仪FPLC纯化，其效价高、特异性非常好，与另7种与骨折愈合相关的单克隆抗体经有限稀释点于芯片上，与标记的补体C3抗体和检测样本进行杂交，借助目前先进的芯片检测仪器进行检测。此技术与传统的检测方法比较，具有快速、操作便捷、高通量检测的特点；并可快速、准确地进行定性检测。本发明所公开的方法是将自主设计合成的VEGF多肽经免疫动物、细胞融合、克隆化培养、以及大量的组织细胞原位特异性筛选从而获得高效价、高特异性的抗人VEGF单克隆抗体，此抗体与7种与骨折愈合相关标记物的单克隆抗体制成的抗体芯片可直接应用于临床检测和基础研究。单克隆抗体在生物学和医学研究领域中具有极大的应用价值，是亲和层析中重要的配体，是免疫组化中主要的抗体，是免疫检验中的新型试剂，是生物治疗的导向武器。单克隆抗体其特异性强，可将抗原抗体反应的特异性大大提高，减少了可能的交叉反应，使试验结果可信度更大。单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。本专利首次结合最新的生物芯片技术对骨折愈合影响因子进行研究，摆脱了目前免疫组化，酶联免疫吸附测定等研究方法因系统误差 而难以进行比较的弊端，可以同时对几十甚至上百种生物因子同时进行高通量筛选，快速准确地找出促进骨折愈合的生物因子及这些生物因子之间协同作用的机理，指导临床的用药治疗，并对骨折愈合疗效进行评价。本研究另一个新的突破就是通过补体C3搭桥，摆脱了以前严格的双抗夹心法，多种骨折愈合因子只需要一种二抗(抗补体C3的抗体)就可以解决。这样不仅大大降低了实验的技术成本,而且使操作更为简便、快捷。
具体实施例方式本发明公开了一种VEGF单抗及包含该抗体的芯片以及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。在进一步阐述本发明之前，我们有必要认识到，本发明并不局限于描述的特定的实施方案，也就是说，在具体形式上可能存在着变化。还有一点需要提醒的是，由于本发明的范围受附加的权利要求书的限制，因此，本文使用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，而不是为了限制本发明的目的。术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以互换使用。这些术语均为本领域技术人员所熟知的术语，具体是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。目前已知的免疫球蛋白多肽包括K和λ轻链，以及a，Y(IgG1, IgG2, IgG3,IgG4), δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”(大约25kDa或大约214个氨基酸)包含一个由NH2-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个COOH-末端上的K或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”(大约50kDa或大约446个氨基酸)，同样包含一个可变区(大约116个氨基酸)，以及重链恒定区之一，例如Y (大约330个氨基酸)。术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab，Fv, scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于固相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。该术语还包括Fab’、Fv、F(ab’)2和/或其它能与抗原特异性结合的抗体片段和单克隆抗体。抗体还可以以多种形式存在，例如包括Fv、Fab和(Fab’)2，以及双功能杂合抗体(例如文献，Lanzavecchia 等，Eur. J. Immunol. , 1987 ；17,105)以及以单链形式(例如，Huston 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，1988 ;85，5879 和 Bird 等，Science, 1988 ;242，423，在此引用作为参考)存在。免疫球蛋白的重链或轻链可变区由三个超变区(也称为“互补决定区”或⑶R)组成，这些超变区被框架区(FR)间隔。框架区和互补决定区的范围已被精石角定义(参见"Sequences of Proteins of Immunological Interest, " E. Kabat 等，U. S. Department of Health and Human Services, 1991)。此处所讨论的所有抗体氨基酸序列的排序都参照Kabat系统。同一物种不同的轻链和重链框架区序列相对保守。抗体的框架区用于定位和校准CDR。CDR主要负责结合抗原的表位。嵌合抗体是其重链和轻链基因经过构建的抗体，特别是利用基因工程改造的属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因。例如，可以将鼠单克隆抗体基因的可变区片段连接到人抗体恒定区片段如Y I和Y3。例如治疗用嵌合抗体是一种嵌合蛋白质，它由来源于兔 抗体可变区片段或抗原结合区片段和人抗体恒定区或效应区结合(如由A. T. C. C.保藏登记号CRL 9688的细胞制备的抗Tac嵌合抗体)，当然，嵌合抗体的基因来源也可以使用其它哺乳动物物种。可以理解本发明设计和生产的人源化抗体可能会替代某些保守性氨基酸，这些氨基酸对抗原结合或抗体其他功能基本上没有影响。换而言之，gly和ala ;val、ile和Ieu ；asp和glu ；asn和gin ；ser和thr ；lys和arg ；phe和tyr,以上各组合内部的氨基酸可相互取代。抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N端成熟区域。所有区域、CDR和残基编号均以序列比对、按已有的结构知识为基础进行定义。框架区和CDR残基的鉴定和编号按 Chothia 和他人所述(Chothia, Structural determinants in the sequences ofimmunoglobulin variable domain. J Mol Biol. 1998 ;278,457)。VH是抗体重链的可变区。VL是抗体轻链的可变区，它可能具有K和λ同种型。K-I抗体具有K -I同种型而Κ-2抗体具有K -2同种型，V λ是可变的λ轻链。“相应的氨基酸”，是指当两个或多个氨基酸序列比对时，位于相同位置(也就是它们彼此对应)的氨基酸残基。抗体序列比对和编号的方法在Chothia，见上，Kabat，见上和其他中得到详尽阐述。本领域普通技术人员已知(参见如Kabat 1991 Sequences of Proteinsof Immunological Interest, DHHS, Washington, DC),有时可以在抗体的一个或两个氨基酸中制造一个、两个或三个缺口和/或插入1、2、3或4个残基或者至多约15个残基(特别是在L3和H3⑶R中)，从而完成一次比对。“可取代位置”，指的是抗体的一个特殊位置，其可以被不同的氨基酸取代而不会使抗体的结合活性显著降低。鉴定可取代位置的方法和它们可以被如何取代在下面将进行更加详细的描述。可取代位置也可以称为“变异耐受位置”。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例I :本发明所述单克隆抗体的制备抗体的制备方法，包括如下工艺步骤
(I)细胞融合将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞分别与自主设计合成的VEGF多肽(序列为IFQEYPDEIE YIFKPS)致敏的脾细胞悬液按I :10-100比例混合，加入聚乙二醇(美国Sigma公司出品)使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基(美国海克隆公司出品)进行细胞培养；(2)筛选杂交瘤细胞待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；(3)单克隆抗体特异性筛选选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于I :10000的阳性孔的上清，分别对8种骨折愈合标志物抗原进行特异性和效价筛选。
(4)单克隆抗体纯化保存将特异性好和效价高的克隆孔培养液吸出，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪(美国通用公司制造)将IgG单克隆抗体培养上清溶液在A280nm时收集，I. 44 (吸光单位)浓度为l-10mg/ml。(5) CY3标记抗体用CY3荧光素标记补体C3抗体。(6)8种骨折愈合相关标志物的单克隆抗体微阵列点样一张芯片点96个点，每一种单抗两个点，每一个点的含量O. 01-lng/ml。步骤(I)进行完毕后采用酶联免疫吸附实验方法测定抗血清，该方法由如下操作步骤组成a、包被以50mmol/L、pH=9的碳酸盐缓冲液将步骤(I)中的VEGF合成肽包被96孔聚乙烯板，4微克/孔，真空抽干，密封4°C保存备用。b、封闭每孔加入pH为7. 4的磷酸盐缓冲液200 μ I洗涤、内含1%山羊血清；C、加样每孔加入细胞融合后7天的细胞培养上清液50-100 μ I (1:5000-10000稀释)，每板设一正常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液)，洗涤；d、加入酶标二抗每孔100-200 μ 1，洗涤；e、显色每孔加入底物50-100 μ I ；f、比色以空白调零，405nm波长测定光密度(0.D)；g、结果判断:P/N=测定标本O. D均值/阴性血清O. D均值，P/N彡2. I为阳性。步骤(2)待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；步骤(3)选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于I :10000的阳性孔的上清，分别与其他7种骨折愈合标志物抗原进行特异性和效价筛选。步骤(4)将特异性好和效价高的克隆孔培养液吸出，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪(美国通用公司制造)将IgG单克隆抗体培养上清溶液在A280nm时收集，I. 44 (吸光单位)浓度为 l-10mg/ml。实施例2 :抗体芯片的制备方法在实施例I基础上增加如下工艺步骤步骤(5)用CY3突光素标记补体C3抗体。步骤(6)标准品点样矩阵的设计每种抗体重复2-5个点，选取6-18个不同的抗体浓度梯度，6-18个矩阵,采用SmartArrayerTM微阵列芯片点样系统进行点样。步骤(7):样本点样矩阵的设计8种抗体，每种抗体重复两个点，总计16个点，采用用点样液作为阴性对照，采用抗补体C3的抗体作为阳性对照，每个矩阵总计20个点。每张芯片上总计24个点阵。采用SmartArrayerTM微阵列芯片点样系统进行点样。 步骤(8)点样完毕后在30_4(TC抽真空过夜，进行干燥；干燥完毕后抽真空塑封，
4-8 °C保存备用。点样参数
权利要求
1.一种VEGF的单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；或其重链可变区由SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO. I的氨基酸序列至少有95%的一致性，轻链可变区由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述单克隆抗体具有特异性结合VEGF的特性。
2.根据权利要求I所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。
3.权利要求I至2任一项所述的单克隆抗体在制备评价骨折愈合的试剂中的用途。
4.一种试剂，包含权利要求I至2任一项所述的单克隆抗体。
5.一种试剂盒，包含权利要求I至2任一项所述的单克隆抗体。
6.一种抗体芯片，包含权利要求I至2任一项所述的单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的抗体芯片，其特征在于，还包含特异性结合以下抗原的抗体IGF-I、IGF-2、BMP-2、EGF、PDGF, bFGF、BDNF。
8.包含权利要求6或7所述抗体芯片的试剂盒，其特征在于，还包含信标分子标记的C3补体抗体，所述信标分子优选为CY3。
全文摘要
本发明涉及生物工程技术领域，公开了一种VEGF的单克隆抗体及包含该抗体的芯片。本发明所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。包含此抗体芯片可直接应用于医学临床对骨折愈合进行疗效评价，解决了传统技术存在的费时、费力、结果重复性差等技术问题，在临床治疗领域中具有极高的应用价值，具有广泛的应用前景。
文档编号G01N33/577GK102863529SQ201210379559
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月9日 优先权日2012年10月9日
发明者李彬 申请人:李彬