一种荧光分析方法和装置制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种荧光分析方法和装置，具体地，本发明公开了一种用于定量检测样品中的待测物的渗漏检测装置，所述装置包括(1)包含检测区的多孔膜和(2)位于多孔膜下方的吸收垫。本发明还公开了一种基于所述渗漏检测装置的定量检测待测物的检测方法和一种基于所述检测方法的检测装置。
【专利说明】一种荧光分析方法和装置
【技术领域】
[0001]本发明属于体外检测【技术领域】，具体地涉及一种基于测量荧光强度的分析方法和
>J-U装直。
【背景技术】
[0002]在免疫检测领域中，常常需要对各类抗原或抗体进行定性或定量检测。现有技术中，以“竞争抑制和双抗夹心”为基础衍生出多种免疫反应分析方法，如:放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法、时间分辨荧光法和荧光免疫法等，可用于确定病原微生物，对人体的特异性蛋白定量检测，从而对疾病进行辅助诊断或监测等等，用途非常广泛。这类免疫反应分析方法，通常将捕获抗体固定于固相载体，然后与抗原(目标蛋白)反应，洗涤后再与标记抗体反应，洗涤，最后检测放射性强度、溶液吸光度或光信号等，从而报告检测样本中目标蛋白的浓度。上述方法的自动化免去了人工洗涤的烦琐，但正因为自动化，使得仪器体积庞大价格昂贵，一般只在大型实验室使用。
[0003]斑点金免疫渗滤技术(dotimmunogold filtration assay, DIGFA)是 Spielberg等最初于1989年通过检测抗HIV建立，随着胶体金技术、材料技术以及计算机的高速发展，斑点金免疫渗滤技术日臻完备，作为以膜为载体的胶体金快速诊断技术中的一种，具有检测快速、便捷、不需要特殊设备、结果判断直观等优点。由于该方法只需肉眼观察即可，非专业人士也可操作，使急诊、基层医院、病人床边和现场等远离大型实验室的地方开展相关检测成为可能，所以应用范围相当广泛。如:已应用于多种寄生虫病标志物、心脏病标志物、传染性疾病标志物、毒物、性传播疾病和其他生化指标的检测等，在其他领域如食品卫生、环境保护等领域都有报道。
[0004]DIGFA法已经超过20年的发展，但其基本的工作原理并未改变，这决定了到目前为止，它只用于定性或半定量检测且灵敏度也不如前述的定量免疫分析方法，进一步的应用遇到了瓶颈。因此，本领域急需对现有的DIGFA方法进行变革，在赋予其高灵敏度和定量准确的新优势的同时，保持其快捷、简便、成本低廉等特点，从而进一步扩展其应用领域。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种渗漏检测装置，用于定量检测样品中的待测物。
[0006]本发明提供了一种定量检测待测物的检测方法，所述方法灵敏度高，定量准确。
[0007]本发明还提供了 一种定量检测待测物的检测装置。
[0008]在本发明第一方面中，提供了一种渗漏检测装置，该渗漏检测装置包括:
[0009](I)包含检测区的多孔膜，其中，所述的检测区包含被荧光物质标记的固定化检测齐U，并且
[0010](al)所述固定化检测剂能与样品中的待测物结合，从而形成“检测剂一待测物”复合物；其中所述待测物还可与结合剂结合，从而当检测区接触含待测物的样品和结合剂后，在检测区形成“检测剂一待测物一结合剂”复合物；[0011]或者
[0012](bl)所述固定化检测剂能与结合剂结合，从而形成“检测剂一结合剂”复合物；其中所述结合剂还可与待测物结合，从而当检测区接触含待测物和结合剂的混合溶液后，在检测区形成“检测剂一结合剂”复合物；
[0013]其中，所述结合剂被吸光物质标记，且所述吸光物质影响所述荧光物质的荧光强度；
[0014](2)位于多孔膜下方的吸收垫，所述吸收垫具有吸收能力，使得加至检测区的样品和液体透过多孔膜并被吸收垫吸收。
[0015]在另一优选例中，所述的检测区包含有一种或多种固定化检测剂；较佳地，所述的结合剂数量为一种或多种，从而可同时用于检测一种或多种待测物。
[0016]在另一优选例中，所述的渗漏检测装置是定量检测装置。
[0017]在另一优选例中，所述的待测物为抗原或抗体。
[0018]在另一优选例中，所述的待测物是抗原，则所述的结合剂和检测剂是可同时结合于所述抗原的抗体；或者所述的待测物是抗体，则所述的检测剂和结合剂是可同时结合于所述抗体的抗原或所述抗体的抗体(抗抗体)。
[0019]在另一优选例中，所述的待测物是抗原，则所述的结合剂是可结合于所述抗原的抗体，所述检测剂是所述抗原的等同物；或者所述的待测物是抗体，则所述的结合剂是可结合于所述抗体的抗原或所述抗体的抗体(抗抗体)，所述检测剂是所述抗体的等同物。
[0020]在本发明第二方面中，提供了一种渗漏检测装置，该渗漏检测装置包括:
[0021](I)包含检测区的多孔膜，其中，所述的检测区包含固定的第一检测剂，其中，所述第一检测剂被荧光物质标记，能与可流动的第二检测剂形成复合检测剂，并且
[0022](a2)所述复合检测剂能与样品中的待测物结合，从而形成“复合检测剂一待测物”复合物；所述待测物可与结合剂结合，从而当检测区接触含待测物的样品和结合剂后，在检测区形成“复合检测剂一待测物一结合剂”复合物；
[0023]或者
[0024](b2)所述复合检测剂能与结合剂结合，从而形成“复合检测剂一结合剂”复合物；其中所述结合剂还可与待测物结合，从而当检测区接触含待测物和结合剂的混合溶液后，在检测区形成“复合检测剂一结合剂”复合物；
[0025]其中，所述结合剂被吸光物质标记，且所述吸光物质影响所述荧光物质的荧光强度；
[0026](2)位于多孔膜下方的吸收垫，所述吸收垫具有吸收能力，使得加至检测区的样品和液体透过多孔膜并被吸收垫吸收。
[0027]在另一优选例中，所述的第二检测剂的数量为一种或多种；较佳地，所述的结合剂数量为一种或多种，从而可同时用于检测一种或多种待测物。
[0028]在另一优选例中，所述复合检测剂为“第一检测剂一第二检测剂”复合物。
[0029]在另一优选例中，所述“复合检测剂一待测物”复合物为“第一检测剂一第二检测剂一待测物”复合物。
[0030]在另一优选例中，所述“复合检测剂一待测物一结合剂”复合物为“第一检测剂一第二检测剂一待测物一结合剂”复合物。[0031]在另一优选例中，所述“复合检测剂一结合剂”复合物为“第一检测剂一第二检测剂一结合剂”复合物。
[0032]在另一优选例中，所述的渗漏检测装置是定量检测装置。
[0033]在另一优选例中，所述待测物为抗原或抗体。
[0034]在另一优选例中，所述的待测物是抗原，则所述的结合剂和第二检测剂是可同时结合于所述抗原的抗体；或者所述的待测物是抗体，则所述的第二检测剂和结合剂是可同时结合于所述抗体的抗原或所述抗体的抗体(抗抗体)。
[0035]在另一优选例中，所述的待测物是抗原，则所述的结合剂是可结合于所述抗原的抗体，所述第二检测剂是所述抗原的等同物；或者所述的待测物是抗体，则所述的结合剂是可结合于所述抗体的抗原或所述抗体的抗体(抗抗体)，所述第二检测剂是所述抗体的等同物。
[0036]在另一优选例中，所述第一检测剂为标记荧光物质的链亲和素(SA)，则所述第二检测剂被生物素(biotin)标记。
[0037]在另一优选例中，该渗漏检测装置还包括:
[0038]在吸收垫下方存在一底部装置；
[0039]在多孔膜上方存在一盖部装置，所述盖部装置上具有可供加入样品的开孔，且所述多孔膜位于该开孔下方。
[0040]在另一优选例中，所述荧光物质的激发或发射光谱与所述吸光物质的吸收光谱全部或部分重叠。
[0041]在另一优选例中，所述的待测物包括:蛋白、核酸或小分子化合物。
[0042]在另一优选例中，所述的待测物是液相(溶液)、悬浮液或固相。
[0043]在另一优选例中，所述的荧光物质选自下组:荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4，5_ 二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白、量子点、或稀土元素离子或其螯合物。
[0044]在另一优选例中，所述的吸光物质选自下组:胶体金、纳米金棒、纳米银棒或其组
八
口 o
[0045]在另一优选例中，所述的吸光物质为纳米金棒。
[0046]在另一优选例中，所述的纳米金棒的纵横比为1.5-10，较佳地为1.5-5。
[0047]在另一优选例中，所述的纳米金棒的长度为10-200nm，较佳地为20-100nm。
[0048]在另一优选例中，所述的胶体金是平均粒径为10_70nm的胶体金颗粒。
[0049]在另一优选例中，所述多孔膜上还包括不同于检测区的对照区，所述对照区含有固定化的对照剂，其中，所述对照剂用于特异性结合被吸光物质标记的结合剂。
[0050]在另一优选例中，所述对照区用于显示待测物的检测结果的有效性。
[0051]在本发明第三方面中，提供了一种定量检测待测物的荧光分析方法，包括步骤:
[0052](I)包括:
[0053](al)将待测物样品和结合剂分别添加于渗漏检测装置的检测区，或将待测物样品和结合剂的混合物添加于所述的检测区，
[0054]其中，所述的检测区包含被荧光物质标记的固定化检测剂，并且所述固定化检测剂能与样品中的待测物结合，从而形成“检测剂一待测物”复合物；其中所述待测物可与结合剂结合，从而当检测区接触含待测物的样品和结合剂后，在检测区形成“检测剂一待测物一结合剂”复合物；
[0055]或者
[0056](a2)将第二检测剂、待测物样品和结合剂分别添加于渗漏检测装置的检测区，或将第二检测剂、待测物样品和结合剂的混合物添加于所述的检测区，
[0057]其中，所述的检测区包含固定的第一检测剂，其中，所述第一检测剂被荧光物质标记，能与可流动的第二检测剂形成复合检测剂，并且所述复合检测剂能与样品中的待测物结合，从而形成“复合检测剂一待测物”复合物；所述待测物可与结合剂结合，从而当检测区接触第二检测剂、含待测物的样品和结合剂后，在检测区形成“复合检测剂一待测物一结合齐U”复合物；
[0058]并且，所述结合剂被吸光物质标记，且所述吸光物质影响所述荧光物质的荧光强度；
[0059](2):检测所述检测区的荧光强度F，从而测得待测物的存在与否或数量。
[0060]在本发明第四方面中，提供了一种定量检测待测物的荧光分析方法，包括步骤:
[0061](I)包括:
[0062](bl)将待测物样品和结合剂依次添加于渗漏检测装置的检测区，或者将待测物样品和结合剂的混合物添加于所述的检测区，
[0063]其中，所述的检测区包含被荧光物质标记的固定化检测剂，并且所述固定化检测剂能与结合剂结合，从而形成“检测剂一结合剂”复合物；其中所述结合剂还可与待测物结合，从而当检测区接触待测物样品和结合剂后，在检测区形成“检测剂一结合剂”复合物；
[0064]或者
[0065](b2)将待测物样品、第二检测剂和结合剂依次添加于渗漏检测装置的检测区，
[0066]或者
[0067]首先提供一将待测物样品和第二检测剂的第一混合物，然后将结合剂和第一混合物依次添加于所述的检测区，或者将结合剂和第一混合物所形成的第二混合物添加于所述的检测区，
[0068]或者
[0069]首先提供一待测物样品和结合剂的第三混合物，然后将第二检测剂和第三混合物依次添加于所述的检测区，或者将第二检测剂与第三混合物所形成的第四混合物添加于所述的检测区，
[0070]其中，所述的检测区包含固定的第一检测剂，其中，所述第一检测剂被荧光物质标记，能与可流动的第二检测剂形成复合检测剂，并且所述复合检测剂能与结合剂结合，从而形成“复合检测剂一结合剂”复合物；其中所述结合剂可与待测物结合，从而当检测区接触待测物样品、第二检测剂和结合剂后，在检测区形成“复合检测剂一结合剂”复合物；
[0071]并且，所述结合剂被吸光物质标记，且所述吸光物质影响所述荧光物质的荧光强度；
[0072](2)检测所述检测区的荧光强度F，从而测得待测物的存在与否或数量。
[0073]在另一优选例中，所述步骤(2)包括:将检测区的荧光强度F和标准曲线或者与未加样的初始荧光强度I7O进行比较，从而确定待测物的存在与否或数量。
[0074]在另一优选例中，所述的待测物是液相(溶液)、悬浮液或固相。[0075]在另一优选例中，当待测物为固相时，步骤(I)还包括加入溶剂(如水或缓冲液)
[0076]在另一优选例中，所述的方法还包括用已知浓度的待测物标准品进行测量，从而制作标准曲线的步骤。
[0077]在本发明第五方面中，提供了一种定量检测待测物的荧光检测装置，所述的装置包括:
[0078](a) 一本发明第一方面或第二方面所述的渗漏检测装置；和
[0079](b) 一用于检测荧光强度的检测器。
[0080]在另一优选例中，所述装置还包括光源和计算机。
[0081]所述光源照射到检测区处，激发出的荧光进入检测器，由计算机进行数据处理和分析。
[0082]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0083]图1A是渗漏检测装置示意图。
[0084]图1B是渗漏检测装置示意图。
[0085]图2是检测装置示意图。
[0086]图3是实施例1的AFP标准系列浓度(IgC)与相应荧光强度(IgF)标准曲线图。
[0087]图4是实施例2的AFP标准系列浓度(IgC)与相应荧光强度(IgF)标准曲线图。
[0088]图5是实施例3的CRP标准系列浓度(C)与相应荧光强度(F)标准曲线图。
【具体实施方式】
[0089]本发明人通过长期而深入的研究，发现了一种基于荧光淬灭原理的检测方法，所述方法采用固定化的被荧光物质标记的检测剂，不仅可以通过目测检测区的颜色来判断是否含有待测物，还可以通过测量检测区处荧光强度的方式来定量检测待测物。所述方法不仅具有灵敏度高，定量准确的优点，而且操作仍然十分简便、快捷、且成本低廉。所述方法是基于本发明提供的一种渗滤测试装置，通过一种含有光源和检测器的装置实现了对待测物的定量检测。在此基础上，发明人完成了本发明。
[0090]渗漏检测装置
[0091]现在更详细地描述用于制造本发明渗漏检测装置的方法和材料。应注意，渗漏检测装置的具体构造可以变化，这取决于意图用渗漏检测装置来进行的具体测试。在实施例之外制造渗漏检测装置的变动方法，也落于本发明范围之中。
[0092]渗漏检测装置可包括盖部装置1，所述盖部装置具有一个用于加样的开孔11，所述开孔可以是圆形、方形等多种形状。
[0093]多孔膜2 (或微孔膜)位于盖部装置I的开孔下方，所述多孔膜包括:检测区和优选的设置有对照区，且通常对照区与检测区之间有适当的空间。
[0094]吸收垫3位于多孔膜下方。
[0095]位于吸收垫下方还具有一底部装置4。[0096]按图1B所示，分别将多孔膜2、吸收垫3、盖部装置I和底部装置4装配成渗滤测试装置，其中，多孔膜上已固定了被荧光物质标记的检测剂。
[0097]所述渗漏检测装置可以是多种形式存在，例如板，片或盒等。以盒为例，所述盖部装置为盒盖，所述底部装置为盒底，可以将多孔膜安放在盒盖开孔(如0.4?0.8cm的圆孔)正下方，吸收垫在多孔膜的正下方，紧密闭合盖、底，使多孔膜贴紧吸收垫，即制备成图1A所示的渗漏检测装置。
[0098]所述盖部装置和底部装置可以用任何稳定的、无孔的材料制成。因为许多测定用水作为扩散介质，因此底部装置较佳地是基本上不透水的，且其强度应足以支承粘于其的渗漏检测装置。在一个优选例中，背衬片是用聚合物物(如塑料)制成的。
[0099]所述吸收垫可以用任何能吸收作为样品和缓冲液的液体的材料制成。吸收垫片的吸收能力应足够大，以便吸收添加至渗漏检测装置的液体。适用于吸收垫片的材料的例子包括纤维素和玻璃纤维。
[0100]所述多孔膜可以用任何材料制成，只要该材料有足够孔隙度从而允许在表面和内部发生流体的毛细管作用。多孔膜应有足够的孔隙度，从而允许涂有抗体或抗原的颗粒移动。多孔膜还可被含待检测分析物的样品中所用的液体润湿(例如，对于水性液体具有亲水性，对于有机溶剂具有疏水性)。通过例如在美国专利N0.4，340, 482或N0.4，618，533中所述的方法(这些方法描述了将疏水表面转变成亲水表面)，可以改变其疏水性从而使其具有亲水性以便用于水性液体。可用于制造多孔膜的材料例子包括:聚脂膜、纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维、尼龙、聚电解质离子交换膜、丙烯共聚物/尼龙、和聚醚砜(polyethersulfone)。在一优选例中,所述多孔膜为硝酸纤维素膜片
[0101]检测方法
[0102]本发明渗漏检测装置可用于大量不同的渗漏分析方法，而这些分析方法涉及一种或多种可流动结合剂、一种固定化检测剂和任选地涉及一种或多种可流动的第二检测剂。所述的固定化检测剂被荧光物质标记，至少一种结合剂被吸光物质标记，当荧光物质标记的检测剂和吸光物质标记的结合剂结合后，可形成含有吸光物质和荧光物质的复合物。具体地，当所述吸光物质影响(部分淬灭或全部淬灭)所述荧光物质的荧光强度时，本发明的检测方法即可通过检测荧光物质的荧光强度来测定待测物的数量。
[0103]如本文所用，术语“待测物”、“其等同物”或“分析物”指待用渗漏检测装置检测以及可任选地被定量测定的、样品中的任何组份，待测物或其等同物或分析物的例子包括:蛋白质，如激素或其他分泌蛋白质、酶和细胞表面蛋白；糖蛋白；肽；小分子；多糖；抗体(包括单克隆抗体或多克隆抗体及其片段)；核酸；药物(包括地高辛等强心甙类药物)；毒素；病毒或病毒颗粒；细胞壁组份；或其他具有表位的化合物。
[0104]优选地，所述的待测物包括肿瘤标志物、心肌标志物等特异性的蛋白，所述肿瘤标志物选自下组:甲胎蛋白(AFP)、C-反应蛋白(CRP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125 (CA125)、糖抗原19-9 (CA19-9)、总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、糖链抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、或人绒毛膜促性腺激素(3 -HCG)。
[0105]结合剂
[0106]本发明所用的结合剂可以是任何能够结合于待测物或其等同物的物质。具体地，为特异性结合待测物或其等同物的物质。
[0107]有各种不同类型的分子可用作分析物结合剂，其中包括例如:寡核苷酸、抗体、工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(该抗原具有分析物结合位点)的异源混合物的裂解物。P.Holliger 等人，Trends in Biotechnology 13:7-9 (1995) ; S.M.Chamow 等人，Trends inBiotechnology 14:52-60(1996)。如果待检测分析物是配体,那么可使用结合于该配体的受体，反之亦然。
[0108]检测剂
[0109]本发明所用的检测剂可以是任何能与结合剂和/或样品中的待测物或其等同物结合的物质，包括例如:抗体、工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(该抗原具有分析物结合位点)的异源混合物的裂解物。
[0110]优选地，可以通过抗原和抗体的结合或寡核苷酸与互补核酸单链特异性结合的方式将含有荧光标记的物质与含有吸光物质标记的物质结合；还可以通过生物素(biotin)和链亲和素(Streptavidin，SA)的结合方式，从而将含有荧光标记的物质与含有吸光物质标记的物质结合。
[0111]标记物质
[0112]连于结合剂或检测剂的可检测标记物包括大量不同物质，只要标记物能够被检测。可检测标记物的例子包括(但并不限于):颗粒、发光标记物；比色标记物、荧光标记物；化学标记物；酶；放射性标记物；或射频标记物；金属胶体；和化学发光标记物。常用检测方法的例子包括(但并不限于):光学方法，如测量光散射、单反射、光度计或光电倍增管；放射性(用盖革计数器等进行测量)；导电性或电介质(电容)；电化学法检测所释放的电活性物质，如铟、秘、镓、締离子[如用Hayes等人(Analytical Chem.66:1860-1865 (1994)所述的方法]，或亚铁氰化物[如用 Roberts 和 Durst (Analytical Chem.67:482-491 (1995)所提出的方法。其中通过在检测区滴加洗涤剂，使包裹在脂质体中的亚铁氰化物被释放出，然后用电化学法检测释放的亚铁氰化物]。其他常规方法只要合适，也可使用。
[0113]在一个优选例中，可检测标记物是颗粒。可使用的颗粒例子包括(但并不限于):胶体金颗粒；胶体硫颗粒；胶体硒颗粒；胶体硫酸钡颗粒；胶体硫酸铁颗粒；金属碘酸盐颗粒；卤化银颗粒；二氧化娃颗粒；胶体(水合)金属氧化物颗粒；胶体金属硫化物颗粒；胶体硒化铅颗粒；胶体硒化镉颗粒；胶体金属磷酸盐颗粒；胶体金属铁酸盐颗粒；涂有有机或无机层的上述任一种胶体颗粒；蛋白质或肽分子；脂质体；或有机聚合物乳胶颗粒，例如聚苯乙烯乳胶珠。
[0114]用于检测剂的标记物，本发明优先选用荧光标记物(简称荧光物质)，用于结合剂的标记物，本发明优先选用吸光物质标记物(简称吸光物质)。当荧光标记物和吸光标记物通过特定的方式结合后，当荧光物质的激发或发射光谱与吸光物质的吸收光谱部分或完全重叠时,吸光物质会影响(部分淬灭或全部淬灭)突光物质的突光，从而通过检测突光物质的荧光强度来测定待测物的数量。
[0115]荧光物质和吸光物质的选择
[0116]用于本发明标记的荧光物质和吸光物质应配合使用，基本原则是荧光物质的激发或发射光谱与吸光物质的吸收光谱部分或完全重叠。最优的是完全重叠，如此会有较高的检测灵敏度。[0117]代表性的突光物质包括(但并不限于):突光素、羧基突光素、2-甲氧基突光素、4,5-二甲氧基突光素、罗丹明、藻红蛋白(Phycoerythrin, PE)、量子点、稀土元素离子(如Eu3+)及其螯合物等组合，只要所选荧光物质的激发或发射光谱与所选吸光物质的吸收光谱
有重叠即可。
[0118]代表性的吸光物质包括(但并不限于):胶体金、纳米金棒、纳米银棒等组合，只要所选吸光物质的吸收光谱与所选荧光物质的激发或发射光谱重叠即可。
[0119]胶体金颗粒可用任何常规方法制造,例如总结于G.Frens, 1973 Nature PhysicalScience, 241:20(1973)中的方法。其他方法描述于美国专利N0.5，578，577,5, 141，850、4，775，636、4，853，335、4，859，612、5，079，172、5，202，267、5，514，602、5，616，467、5，681，775。
[0120]如本文所用，术语“纳米金棒”指具有一定纵横比、且横轴和纵轴处于5-200纳米范围的金颗粒。
[0121]一种特别优选的吸光物质是胶体金，尤其是粒径为20-40nm的胶体金。
[0122]优选地，本领域技术人员常用荧光标记物质包括PE，PE的吸收光谱在55(T650nm之间，最大发射波长为575nm,而30nm胶体金的吸收光谱在30(T800nm,较宽泛,最大吸收峰为525飞30nm处，与PE的发射光谱有部分重叠，所以选择30nm胶体金作为相应的吸光物质。
[0123]荧光淬灭原理
[0124]含有荧光标记的物质与含有吸光物质标记的物质结合后，当荧光物质的激发或发射光谱与作为荧光淬灭剂的吸光物质的吸收光谱全部或部分重叠时，因共振能量转移，吸光物质会对该荧光物质的荧光产生淬灭作用。
[0125]本发明中，引起荧光淬灭的原因包括两个方面:一是复合物内部吸光物质对荧光物质的淬灭；二是堆积在一起的复合物之间的相互淬灭，如:复合物甲的吸光物质淬灭复合物乙的荧光，复合物乙的吸光物质淬灭复合物丙的荧光，复合物丙的吸光物质淬灭复合物甲的荧光，依此类推。
[0126]工作原理
[0127]现结合图1A和图1B和具体的实施方式说明本发明检测方法的工作原理:
[0128]方法一、
[0129](1.1)选择一检测剂，所述检测剂是对待测物特异性结合的物质(如待测物为抗原，则检测剂为该抗原的一抗体，记为Abl)，并预先对该检测剂进行荧光物质标记，生成经荧光物质标记的检测剂(记为F-Abl)，然后将其固定在多孔膜上。要求该荧光物质的激发与发射光谱和吸光物质(如胶体金)的吸收光谱全部或部分重叠。
[0130](1.2)通过加样孔11，将含有待测物(如抗原，记为Ag)的样品和结合剂(如抗原的胶体金标记第二抗体，简称为抗原的金标抗体，记为Ab2-G)加在多孔膜上，样品中的待测物和结合剂与固定在此的荧光物质标记的针对抗原的检测剂(F-Abl)结合，形成3元复合物，即“F-Abl-Ag-Ab2-G”夹心复合物，其中的金淬灭检测区处的荧光物质的荧光。
[0131](1.3)游离金标抗体被对照区的对照剂(如抗金标抗体的抗体)捕获，呈现红色，说明检测有效。
[0132](1.4)测定检测区处荧光物质的荧光强度，荧光越强说明待测物浓度越低，反之则越高；如样本中无抗原时，不能形成“夹心复合物”，则检测区处的荧光强度为原始荧光强度。
[0133]方法二、
[0134]检测区处也可固定其他能捕获“夹心复合物”的荧光标记物质。
[0135](2.1)将含有待测物(如抗原，记为Ag)的样品和两种结合剂(如抗原的两种抗体:胶体金标记的抗体，也称为抗原的金标抗体，记为Ab2-G ；以及biotin标记的抗体，记为Abl-biotin)混合后，待测物、金标抗体和biotin标记的抗体完全复溶后，形成如G-Ab2-Ag-Ab1-biotin 的 3 兀复合物。
[0136](2.2)通过加样孔11，将所述3元复合物加在多孔膜上，固定在此的荧光标记的能与biotin结合的检测剂(如突光标记的SA,记为F-SA)捕获上述3元复合物，形成如G-Ab2-Ag-Abl-biotin-SA-F的4元复合物，其中的金淬灭检测区处的荧光物质的荧光。
[0137](2.3)游离金标抗体被对照剂(如抗金标抗体的抗体)捕获，呈现红色，说明检测有效。
[0138](2.4)测定检测区处荧光物质的荧光强度，荧光越强说明待测物浓度越低，反之则越高；如样本中无抗原时，不能形成“夹心复合物”，则检测区处的荧光强度为原始荧光强度。
[0139]本发明还适用于竞争抑制法:
[0140]方法三、
[0141](3.1)将待测物的等同物(如待测物为抗原，该等同物为其标准抗原，记为AgO)标记荧光，生成被荧光物质标记的检测剂(记为F-AgO)，然后将其固定在图1B的多孔膜上。
[0142](3.2)先将含有待测物(如抗原，记为Ag)的样品、结合剂(如抗原的金标抗体，记为Abl-G)混匀，形成含Ag-Abl-G的复合物的混合物，当Abl-G的含量大于待测物的含量时，Abl-G会剩余。
[0143](3.3)通过加样孔11，将步骤(3.2)的混合物滴加至多孔膜上(如滴加2?3滴，待完全渗入，可再通过加样孔11滴加洗涤液2?3滴，待完全渗入)。固定在此的荧光标记的检测剂(如F-AgO)捕获上述混合液中剩余的Abl-G，形成如F-AgO-Abl-G的复合物，其中的金淬灭检测区处的荧光物质的荧光。
[0144](3.4)测定检测区处荧光物质的荧光强度，荧光越强，待测物浓度越高，反之，则待测物的浓度越低；若样本中无待测物，则多孔膜上检测区处形成的“F-Ag0-Abl-G”最多，相应地，荧光最弱。
[0145]方法四、
[0146](4.1)将待测物的等同物(如待测物为抗原，该等同物为其标准抗原，记为AgO)标记biotin(记为biotin-AgO),而图1B的多孔膜上固定标记了突光物质的检测剂(记为F-SA)。
[0147](4.2)将含有待测物(如抗原，记为Ag)的样品、结合剂(如抗原的金标抗体，记为Abl-G)和标记有biotin的待测物等同物混勻，形成含biotin-Ag0_Abl-G的复合物的混合物。
[0148]另一优选例中，先将含有待测物的样品、结合剂混匀，形成如Ag-Abl-G的复合物，当Abl-G的含量大于Ag的含量时，Abl-G会剩余。再和标记有biotin的待测物等同物混合，复溶，形成含biotin-AgO-Abl-G的复合物的混合物。
[0149]另一优选例中，先将含有待测物的样品和标记有biotin的待测物等同物混匀，再和结合剂混合，复溶，形成含biotin-AgO-Abl-G的复合物的混合物。
[0150](4.3)通过加样孔11，将步骤(4.2)得到的混合物滴加至多孔膜上(如滴加2~3滴，待完全渗入，可再通过加样孔11滴加洗涤液2~3滴，待完全渗入)。固定在此的荧光标记的检测剂(如F-SA)捕获上述混合液中biotin-AgO-Abl-G的复合物，形成如F-SA-biotin-AgO-Abl-G的复合物，其中的金淬灭检测区处的荧光物质的荧光。
[0151](4.4)测定检测区处荧光物质的荧光强度，荧光越强，待测物浓度越高，反之，则待测物的浓度越低；若样本中无待测物，则多孔膜上检测区处形成的“F-AgO-Abl-G”最多，相应地，荧光最弱。
[0152]检测装置
[0153]现结合图2说明本发明的检测装置:
[0154]如图2所示，所述装置可以包括:渗漏检测装置、检测器、光源、光导纤维和计算机。还可以包括一份检测方法的使用说明。其中渗漏检测装置的工作原理如上所述，荧光强度的检测方法可以如下所述(但不仅限于此)，任何可用于检测荧光强度的方法均可用于本发明的检测装置。
[0155]激发光通过Y型光导纤维的I个分支照射到多孔膜的检测区处，激发出的荧光通过Y型光导纤维的另I分支进入检测器，由计算机进行数据处理和分析。
[0156]本发明中，光源用于提供某一发射波长的光线，从而激发突光物质发出突光。可选用任何可以提供合适波长的光·源，包括(但不限于):LED、氙灯、卤钨灯、激光等。一种优选的光源是激光光源，激光光源可用本领域常规的方法和设备(如激光器)产生。代表性的激光器包括(但并不限于):半导体激光器、氦氖激光器、氩离子激光器、还包括波长可选的激光器、多波长激光器和双波长激光器等。
[0157]激光器产生的激光波长与激光介质有关，常见的激光波长见下表:
[0158]
【权利要求】
1.一种渗漏检测装置，其特征在于，该渗漏检测装置包括: (1)包含检测区的多孔膜，其中，所述的检测区包含被荧光物质标记的固定化检测剂，并且 (al)所述固定化检测剂能与样品中的待测物结合，从而形成“检测剂一待测物”复合物；其中所述待测物还可与结合剂结合，从而当检测区接触含待测物的样品和结合剂后，在检测区形成“检测剂一待测物一结合剂”复合物； 或者(bl)所述固定化检测剂能与结合剂结合，从而形成“检测剂一结合剂”复合物；其中所述结合剂还可与待测物结合，从而当检测区接触含待测物和结合剂的混合溶液后，在检测区形成“检测剂一结合剂”复合物； 其中，所述结合剂被吸光物质标记，且所述吸光物质影响所述荧光物质的荧光强度； (2)位于多孔膜下方的吸收垫，所述吸收垫具有吸收能力，使得加至检测区的样品和液体透过多孔膜并被吸收垫吸收。
2.一种渗漏检测装置，其特征在于，该渗漏检测装置包括: (1)包含检测区的多孔膜，其中，所述的检测区包含固定的第一检测剂，其中，所述第一检测剂被荧光物质标记，能与可流动的第二检测剂形成复合检测剂，并且 (a2)所述复合检测剂能与样品中的待测物结合，从而形成“复合检测剂一待测物”复合物；所述待测物可与结合剂结合，从而当检测区接触含待测物的样品和结合剂后，在检测区形成“复合检测剂一待测物一结合剂”复合物； 或者(b2)所述复合检测剂能·与结合剂结合，从而形成“复合检测剂一结合剂”复合物；其中所述结合剂还可与待测物结合，从而当检测区接触含待测物和结合剂的混合溶液后，在检测区形成“复合检测剂一结合剂”复合物； 其中，所述结合剂被吸光物质标记，且所述吸光物质影响所述荧光物质的荧光强度； (2)位于多孔膜下方的吸收垫，所述吸收垫具有吸收能力，使得加至检测区的样品和液体透过多孔膜并被吸收垫吸收。
3.如权利要求1或2所述的渗漏检测装置，其特征在于，该渗漏检测装置还包括: 在吸收垫下方存在一底部装置； 在多孔膜上方存在一盖部装置，所述盖部装置上具有可供加入样品的开孔，且所述多孔膜位于该开孔下方。
4.如权利要求1或2所述的渗漏检测装置，其特征在于，所述荧光物质的激发或发射光谱与所述吸光物质的吸收光谱全部或部分重叠。
5.如权利要求1或2所述的渗漏检测装置，其特征在于，所述的待测物包括:蛋白、核酸或小分子化合物。
6.如权利要求1或2所述的渗漏检测装置，其特征在于，所述的荧光物质选自下组:荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4,5- 二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白、量子点、或稀土元素离子或其螯合物。
7.如权利要求1或2所述的渗漏检测装置，其特征在于，所述的吸光物质选自下组:胶体金、纳米金棒、纳米银棒或其组合。
8.如权利要求1或2所述的渗漏检测装置，其特征在于，所述多孔膜上还包括不同于检测区的对照区，所述对照区含有固定化的对照剂，其中，所述对照剂用于特异性结合被吸光物质标记的结合剂。
9.一种定量检测待测物的荧光分析方法，其特征在于，包括步骤: (1)包括: (al)将待测物样品和结合剂分别添加于渗漏检测装置的检测区，或将待测物样品和结合剂的混合物添加于所述的检测区， 其中，所述的检测区包含被荧光物质标记的固定化检测剂，并且所述固定化检测剂能与样品中的待测物结合，从而形成“检测剂一待测物”复合物；其中所述待测物可与结合剂结合，从而当检测区接触含待测物的样品和结合剂后，在检测区形成“检测剂一待测物一结合剂”复合物； 或者(a2)将第二检测剂、待测物样品和结合剂分别添加于渗漏检测装置的检测区，或将第二检测剂、待测物样品和结合剂的混合物添加于所述的检测区， 其中，所述的检测区包含固定的第一检测剂，其中，所述第一检测剂被荧光物质标记，能与可流动的第二检测剂形成复合检测剂，并且所述复合检测剂能与样品中的待测物结合，从而形成“复合检测剂一待测物”复合物；所述待测物可与结合剂结合，从而当检测区接触第二检测剂、含待测物的样品和结合剂后，在检测区形成“复合检测剂一待测物一结合剂，，复合物; 并且，所述结合剂被吸光物质标记，且所述吸光物质影响所述荧光物质的荧光强度； (2):检测所述检测区的荧光强度F，从而测得待测物的存在与否或数量。
10.一种定量检测待测物的荧光分析方法，其特征在于，包括步骤: (1)包括: (bl)将待测物样品和结合剂依次添加于渗漏检测装置的检测区，或者将待测物样品和结合剂的混合物添加于所述的检测区， 其中，所述的检测区包含被荧光物质标记的固定化检测剂，并且所述固定化检测剂能与结合剂结合，从而形成“检测剂一结合剂”复合物；其中所述结合剂还可与待测物结合，从而当检测区接触待测物样品和结合剂后，在检测区形成“检测剂一结合剂”复合物； 或者 (b2)将待测物样品、第二检测剂和结合剂依次添加于渗漏检测装置的检测区， 或者首先提供一将待测物样品和第二检测剂的第一混合物，然后将结合剂和第一混合物依次添加于所述的检测区，或者将结合剂和第一混合物所形成的第二混合物添加于所述的检测区， 或者首先提供一待测物样品和结合剂的第三混合物，然后将第二检测剂和第三混合物依次添加于所述的检测区，或者将第二检测剂与第三混合物所形成的第四混合物添加于所述的检测区， 其中，所述的检测区包含固定的第一检测剂，其中，所述第一检测剂被荧光物质标记，能与可流动的第二检测剂形成复合检测剂，并且所述复合检测剂能与结合剂结合，从而形成“复合检测剂一结合剂”复合物；其中所述结合剂可与待测物结合，从而当检测区接触待测物样品、第二检测剂和结合剂后，在检测区形成“复合检测剂一结合剂”复合物； 并且，所述结合剂被吸光物质标记，且所述吸光物质影响所述荧光物质的荧光强度； (2)检测所述检测区的荧光强度F，从而测得待测物的存在与否或数量。
11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括:将检测区的荧光强度F和标准曲线或者与未加样的初始荧光强度进行比较，从而确定待测物的存在与否或数量。
12.一种定量检测待测物的荧光检测装置，其特征在于，所述的装置包括: (a)一权利要求1或2所述的渗漏检测装置；和 (b)一用于检测荧光强度的检测 器。
【文档编号】G01N33/564GK103713126SQ201210378333
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2012年9月29日 优先权日:2012年9月29日
【发明者】不公告发明人 申请人:庞磊