专利名称：一种酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种酵母葡聚糖含量的检测方法，具体涉及一种酵母葡聚糖中具有生物活性的非水溶性葡聚糖含量的检测方法。
背景技术：
酵母细胞中除含有大 量的蛋白质外，还含有甘露聚糖、甘露糖蛋白、β-1，3_葡聚糖、其他杂多糖和几丁质等成分。目前已被应用的酵母多糖产品主要有甘露糖系列的甘露聚糖、甘露寡糖、甘露糖蛋白，含多种多糖成分的酵母葡聚糖，非水溶性的酵母细胞壁β -I, 3-D-葡聚糖等。目前，对于酵母葡聚糖含量的检测方法有很多，都是对于酵母葡聚糖中水溶性葡聚糖含量的检测方法，如利用多糖的还原性测定还原性多糖的方法有3，5 —二硝基水杨酸盐比色法；利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物，然后再与酚类或胺类化合物缩合，生成有特殊颜色的物质的这一性质进行测定，这类方法有地衣酚-硫酸法、苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，其中非水溶性多糖很难彻底水解，若高温水解则会破坏目的组分，无法用于产品质量的检验、监督，使得酵母非水溶活性多糖产品的质量控制、生产过程中非水溶活性多糖的检测产生了很大的不确定性。国外常用酶法检测法检测非水溶性葡聚糖的含量，利用专一性酶对多糖底物的催化反应确认是否含有非水溶性葡聚糖，再结合其他方法测定非水溶性葡聚糖含量，但是此方法条件苛刻，对设备要求高，不适合一般实验室操作。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种酵母葡聚糖中具有生物活性的非水溶性葡聚糖含量的检测方法，采用特殊工艺除去单糖、低聚糖、水溶性杂多糖以及蛋白的干扰，采用合理的酸降解、水解，能够将非水溶性葡聚糖完全转化为水溶性葡聚糖，有效地解决了非水溶性葡聚糖难以降解或降解不完全的缺陷，减少了降解时间，降低了水解温度，为酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的定量检测提供了依据。一种酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法，主要步骤包括顺次经过除去碱溶性成分、除去酸溶性成分、浓酸降解、稀酸水解，将非水溶性葡聚糖完全转化为水溶性葡聚糖，用苯酚-硫酸法测定非水溶性葡聚糖的含量，并对检测方法进行精密度和回收率研究，具体步骤包括
(1)除去碱溶性成分
取烘干粉碎的待测多糖样品，分别称取20-200mg于3-5个离心杯中，分别加入碱溶液，充分震荡5-10min,离心5_20min,弃去上清液,如此重复2次；
(2)去除酸溶性成分
向步骤(I)中弃去上清液的3-5个离心杯中，分别加入酸溶液,充分震荡5-10min,离心5-20min,弃去上清液，如此重复2次；(3)浓酸降解
将步骤(2 )中弃去上清液的3-5个离心杯中的沉淀分别转移到相应的IOOmL碘量瓶中，分别向各个碘量瓶加入酸溶液，充分震荡2-5min，室温放置20_30min ；
(4)稀酸水解
向经步骤(3)酸处理后的3-5个碘量瓶中分别加入40mL-80mL水，接上冷凝管，100°C水解2-6小时，取出，冷水浴中降温到室温，分别转移到IOOmL容量瓶中，并定容得待测样品溶液；
(5)苯酚-硫酸法测定非水溶葡聚糖含量
配制50g/L的苯酹溶液称取精制苯酹5. Og,加水溶解并稀释至IOOmL,混勻，置冰箱中
保存，备用；
配制葡聚糖标准储备溶液精密称取分子量10000、干燥至恒重的葡聚糖标准品P82O. 5000g,加水溶解，并定容至50mL，混匀，置冰箱中保存；
配制葡聚糖标准溶液吸取葡聚糖标准储备液I. OOmL，置于IOOmL容量瓶中，加水至刻度，混匀，置冰箱中保存；
标准曲线绘制精密吸取葡聚糖标准溶液0，0. 10，O. 20，O. 40，O. 60，O. 80，I. OOmL分别置于25mL比色管中，准确补充水至2. OmL，加入50g/L的苯酚溶液I. OmL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10. OmL,于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸lOmin，冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，Icm比色皿测定吸光度值。以葡聚糖的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得出标准曲线的回归方程为y=4. 405x-0. 0031，R2=O. 9997
式中I为葡聚糖的质量浓度，单位为mg/mL，X为吸光度值，R为线性相关系数；
测定非水溶葡聚糖的含量吸取步骤(4)所得的待测样品溶液5-25mL，用蒸馏水稀释至50_500mL,吸取该稀释液lmL-2mL,分别加入3_5个25mL比色管中，依次加入蒸懼水补至总体积2mL,再分别加入50g/L的苯酹溶液I. OmL,混合均勻后,加入IOmL浓硫酸,然后迅速放入沸水浴中10-30min，再用冰水浴迅速冷却至室温，摇匀，以空白样品为参比，在490nm波长下，根据标准曲线得出样品溶液中非水溶葡聚糖的质量，从而按照下式获得样品中非水溶葡聚糖的含量
权利要求
1.一种酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法，其特征在于主要步骤包括顺次经过除去碱溶性成分、去除酸溶性成分、浓酸降解和稀酸水解，将非水溶性葡聚糖完全转化为水溶性葡聚糖，用苯酚-硫酸法测定非水溶性葡聚糖的含量。
2.根据权利要求I所述的酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法，其特征在于具体步骤包括 (1)除去碱溶性成分 取烘干粉碎的待测多糖样品，分别称取20-200mg于3-5个离心杯中，分别加入碱溶液，充分震荡5-10min,离心5_20min,弃去上清液,如此重复2次； (2)去除酸溶性成分 向步骤(I)中弃去上清液的3-5个离心杯中，分别加入酸溶液，充分震荡5-10min,离心5-20min,弃去上清液，如此重复2次； (3)浓酸降解 将步骤(2)中弃去上清液的3-5个离心杯中的沉淀分别转移到相应的IOOmL碘量瓶中，分别向各个碘量瓶加入酸溶液，充分震荡2-5min，室温放置20_30min ； (4)稀酸水解 向经步骤(3)酸处理后的3-5个碘量瓶中分别加入40mL-80mL水，接上冷凝管，100°C水解2-6小时，取出，冷水浴中降温到室温，分别转移到IOOmL容量瓶中，并定容得待测样品溶液； (5)苯酚-硫酸法测定非水溶葡聚糖的含量 配制50g/L的苯酹溶液称取精制苯酹5. Og,加水溶解并稀释至IOOmL,混勻，置冰箱中保存，备用； 配制葡聚糖标准储备溶液精密称取分子量10000、干燥至恒重的葡聚糖标准品P82O.5000g,加水溶解，并定容至50mL，混匀，置冰箱中保存； 配制葡聚糖标准溶液吸取葡聚糖标准储备溶液I. OOmL，置于IOOmL容量瓶中，加水至刻度，混匀，置冰箱中保存； 标准曲线绘制精密吸取葡聚糖标准溶液0，O. 10，O. 20，O. 40，O. 60，O. 80，I. OOmL分别置于25mL比色管中，准确补充水至2. OmL，加入50g/L的苯酚溶液I. OmL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10. OmL,于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸lOmin，冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，Icm比色皿测定吸光度值；以葡聚糖的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得出标准曲线的回归方程为y=4. 405x-0. 0031，R2=O. 9997 式中I为葡聚糖的质量浓度，单位为mg/mL，X为吸光度值，R为线性相关系数； 测定非水溶葡聚糖的含量吸取步骤(4)所得的待测样品溶液5-25mL，用蒸馏水稀释至50_500mL,吸取该稀释液lmL-2mL,分别加入3_5个25mL比色管中，依次加入蒸懼水补至总体积2mL,再分别加入50g/L的苯酹溶液I. OmL,混合均勻后,加入IOmL浓硫酸,然后迅速放入沸水浴中10-30min，再用冰水浴迅速冷却至室温，摇匀，以空白样品为参比，在490nm 波长下，根据标准曲线得出样品溶液中非水溶葡聚糖的质量，从而按照下式获得样品中非水溶葡聚糖的含量
3.根据权利要求2所述的酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法，其特征在于所述步骤(I)中碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液或其混合物。
4.根据权利要求2或3所述的酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法，其特征在于所述步骤(I)中碱溶液的体积为10mL-30mL，浓度为20g/L_100g/L。
5.根据权利要求2所述的酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法，其特征在于所述步骤(2)中酸溶液为盐酸溶液或硫酸溶液或其混合物。
6.根据权利要求2或5所述的酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法，其特征在于所述步骤(2)中酸溶液的体积为10mL-20mL，浓度为20ml/L_40ml/L。
7.根据权利要求2所述的酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法，其特征在于所述步骤(3)中酸溶液为10mL、8-10moL/L的硫酸溶液。
8.根据权利要求2所述的酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法，其特征在于所述步骤(I)和步骤(2)中的离心速率均为2000-4000r/min。
9.根据权利要求2所述的酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法，其特征在于所述步骤(5)中精制苯酚和50g/L的苯酚溶液中的苯酚都是重蒸苯酚。
全文摘要
本发明涉及一种酵母葡聚糖中具有生物活性的非水溶性葡聚糖含量的检测方法，主要步骤包括顺次经过除去碱溶性杂质、除去酸溶性杂质、浓酸降解、稀酸水解，先将酵母葡聚糖中的水溶性葡聚糖和杂质除去，再将非水溶性葡聚糖完全转化为水溶性葡聚糖，用苯酚-硫酸法测定非水溶性葡聚糖的含量。本发明能将酵母葡聚糖中的非水溶性葡聚糖完全转化为水溶性葡聚糖，从而用苯酚-硫酸法测定非水溶性葡聚糖的含量，本发明具有可操作性强、测量结果准确度高、相对标准偏差小、重现性好等优点，为酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的定量检测提供了依据。
文档编号G01N21/31GK102818779SQ20121027807
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月7日 优先权日2012年8月7日
发明者张心青, 杨传伦, 王秀芝, 徐泽平, 高洪奎 申请人:黄河三角洲京博化工研究院有限公司