专利名称：一种同时检测鸡蛋中阿莫西林、阿莫西林酸、二酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林残留的方法
技术领域：
本发明属于兽药残留检测领域，具体涉及一种同时检测鸡蛋中阿莫西林、阿莫西林酸、二酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林残留的方法。
背景技术：
目前国内外对阿莫西林、阿莫西林酸、二酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林的残留检测方法虽然有不少报道，主要有HPLC/UV法、HPLC/FLD法和HPLC-MS/MS法。HPLC/UV法样品杂质峰较多，干扰较大，对样品的净化要求较高，而且紫外检测器的灵敏度较低。HPLC/FLD法灵敏度高，样品杂质峰较少，对样品的净化要求较低，但阿莫西林、阿莫西林酸、二酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林本身无荧光吸收，样品需进行衍生化处理，且衍生化后四种药物色谱峰无法有效分离。但到目前为止，国内外同时检测鸡蛋中阿莫西林、阿莫西林酸、二酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林残留的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法的研究国内外尚未见报道。申请号为2011101751979的中国专利申请公开了一种用HPLC/FLD法同时检测鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林的方法，但是该方法不能同时检测并确证阿莫西林、阿莫西林酸、二酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林在鸡蛋中的残留，并满足欧盟标准。
发明内容
为了能同时检测并确证阿莫西林、阿莫西林酸、二酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林在鸡蛋中的残留，满足欧盟标准，本发明提供了一种高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)，能同时检测鸡蛋中阿莫西林、阿莫西林酸、二酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林的残留。本发明所采用的技术方案是一种同时检测鸡蛋中阿莫西林、阿莫西林酸、二酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林残留的方法，是将鸡蛋样品经过提取、净化后，以乙腈-O. 1%甲酸为流动相，采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)检测。液相色谱条件色谱柱AgilentC18, 5 μ m, 150mmX 4. 6mm i. d.;保护柱C18 柱，5 μ m ;流动相乙腈-O. 1%甲酸，分离AM0、AMA、DIKET0和AMP的梯度洗脱程序见表I ;流速I. OmL · mirf1 ;柱温25°C ;进样体积:20 μ L。表I分离AMO、AMA、DIKETO和AMP的梯度洗脱程序
时W (min)乙腈(％)0.1%Fp酸(％)流速(mLmin1)
_Time_Acetonitrile_Water_Flow rate_
0 0 100 1.0 22981.0
520801.0
1250501.0
202981.0
质谱条件为离子源电喷雾离子源(ESI);扫描方式正离子扫描；检测方式多反应监测(MRM);电喷雾毛细管电压4000V ;干燥气温度300°C ;干燥气流速10L · min—1 ；雾化器气体压力15psi ;鞘气温度250°C ;鞘气流速7L · min—1 ;二级碰撞气氮气。ΑΜ0、AMA、DIKET0、AMP和PV的保留时间和优化质谱条件见表2。表2AM0，AM，DIKETO，AMP和PV的保留时间和优化质谱条件
分析物保留时W (min)母离子(m/z) f离子(m/z) 锥孔电压(V) 碰撞能ft (eV) Analyte Retention time (tR) Parent ion Daughter ion Cone voltage Collision energy
349.0*742
AMO4.99U )
208.0746
323.0+9810
WW4.963S4 0
189.09818 160.0* 96 10
DIKETO6.37366.0
207.09610 106.0* 102 14
4MP5.51350.0
174.010210 160.0* 100 6
PV9.11"
114.010034注定量离子本发明中鸡蛋样品中阿莫西林和氨苄西林的提取、萃取和净化推荐使用乙腈提取，用二氯甲烷萃取净化。具体操作是将鸡蛋制成匀浆后，加入PV (青霉素V)内标溶液，然后加入乙腈溶液中混匀，离心，将上清液移出，加入ImL乙酸铵溶液(ΡΗ6. 7)，置漩涡混合器上混匀，再用经超纯水饱和的二氯甲烷萃取，离心，将上层水相转移至玻璃离心管中，最后用氮吹仪吹干。上机前残渣用I. 0mL2%乙腈分两次漩涡振荡溶解，转移至I. 5mL离心管中；12100 X g离心15min，上清液经0. 22 μ m滤膜过滤，滤液供HPLC-MS/MS测定。本发明采用HPLC-MS/MS法、与HPLC/FLD法相比，能进行确证分析，能同时检测鸡蛋中的阿莫西林及其代谢产物(阿莫西林酸、二酮哌嗪阿莫西林)和氨苄西林，灵敏度高。
图I鸡蛋中AMO的基质添加标准曲线。图2鸡蛋中AMA的基质添 加标准曲线。图3鸡蛋中DIKETO的基质添加标准曲线。图4鸡蛋中AMP的基质添加标准曲线。图5是空白鸡蛋样品离子色谱图。图6是基质添加标准品离子色谱图。图7是添加鸡蛋样品离子色谱图。
图8AM0的子离子扫描图。图9AMA的子离子扫描图。图10DIKET0的子离子扫描图。图IlAMP的子离子扫描图。图12PV的子离子扫描图。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。本发明中所涉及到的溶液百分浓度，除特别说明外均为质量百分浓度。I实验鸡的饲养、给药和样品采集随机选取28周龄京海黄鸡产蛋鸡25只，体重I. 78±0. 22kg，作为空白对照组，单笼饲养。试验前预饲I周，饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料，自由饮水。连续5d饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料，于每天17:30 18:00收集鸡蛋,鸡蛋样品保存在低温蛋库中。2样品处理本发明提取、萃取及净化步骤①用匀浆机将鸡蛋制成匀浆；②准确称取5. 0-6. Og鸡蛋匀浆样品，放于30_50mL具塞离心管中，加入PV内标溶液(7. 5 μ g · mL_1) 100 μ L ；③加入3_5mL乙腈溶液置漩涡混合器上混匀，漩涡振荡混匀l_3min ；④再加入3-5mL乙腈溶液，镟润振荡混勻l_3min,超声波振荡萃取10_15min,5500-6500 X g 离心 10_15min ；⑤上清液转移至另一 50mL具塞离心管中；⑥重复提取一次(一次性加入S-IOmL乙腈溶液，漩涡振荡混匀l_3min，超声波振荡萃取 10-15min，8000-10000 Xg 离心 10_15min)，合并上清液；⑦加入ImL乙酸铵溶液(pH6. 7)，置漩涡混合器上混匀；⑧加入20_30mL用超纯水饱和的二氯甲烷溶液置漩涡混合器上混匀(使药物溶于上层水相、乙腈溶于二氯甲烷溶液中)；⑨漩涡振荡混匀l_3min, 5500-6500 X g 离心 5-lOmin ；⑩取I. 0-1. 5mL上层水相至15_20mL有刻度具塞的玻璃离心管中；□在45_50°C氮吹仪吹干；冷冻保存；□上机前用I. 0mL2%乙腈分两次漩涡振荡溶解，转移至I. 5mL离心管中；□ 10000-12100 Xg 离心 10_15min，上清液经 O. 22 μ m 滤膜过滤，滤液供 HPLC-MS/MS测定。
3回收率的测定准确称取5. Og匀浆后的空白鸡蛋匀浆液，置于50mL聚丙烯离心管中，添加不同浓度的标准工作液(对应的在空白鸡蛋样品中添加浓度均为5. O、10. O、20. O μ g · kg—1，加入PV内标溶液(7. 5 μ g · πιΓ1) 100 μ L，每个浓度水平设置6个平行，漩涡振荡混匀，经上述样品提取与净化后，取20yL进样进行检测。根据各分析物定量子离子(AMO，m/ζ366· 0/349. O ；AMA, m/z384. 0/323. O ；DIKET0, m/z366. 0/160. 0 ；AMP, m/z350. 0/106. 0)与内标子离子(PV，m/z351. 0/160. 0)的峰面积比值计算添加回收率。本发明方法提取鸡蛋中阿莫西林、阿莫西林酸、二酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林的添加回收率及相对标准偏差的结果见表3。表3鸡蛋中AMO、AMA、DIKETO和AMP的添加回收率(η=6)
分析物添加值(pg.kg—1)冋收率〔％)相对标准偏左(%)
AnalyteAdded levelRecoveryRSD
5.085.18±7.66899 AMO 10.0a86.59 + 7.158.25
20.088.67 土 7.128.02
5.080.15 + 7.769.68 AMA IWf82.84 + 7.128.60
20.084.23 + 7.338.70
5.090.65 土 7.568.34 DIKETO 10.0a 90.74 + 6.63 7.30
20.091.53 ±6.12 6.68
5.093,45 ±6.236.66 AMP 10.0a 97.79±5.89 6.02
20.098.23 ±5.535.63注a.最闻残留限量由表3可见，AMO、AMA、DIKETO和AMP在添加浓度5. O 20. O μ g · kg-1范围内，平均回收率分别为 85. 18% 88. 67%,80. 15% 84. 23%,90. 65% 91. 53% 和 93. 45% 98. 23%，相对标准偏差分别低于8. 99%,9. 68%,8. 34%和6. 66%。表明该方法稳定可靠，完全能满足全蛋中阿莫西林及其代谢物和氨苄西林多残留分析方法的要求。4试验条件4. I液相色谱条件色谱柱AgilentC18, 5 μ m, 150mmX 4. 6mm i. d.;保护柱C18 柱，5 μ m ;流动相乙腈-O. 1%甲酸，分离AMO、AMA、DIKETO和AMP的梯度洗脱程序见表4 ;流速1. OmL · mirf1 ；柱温25°C ;进样体积20 μ L0表4分离AMO、AMA、DIKETO和AMP的梯度洗脱程序
权利要求
1.一种同时检测鸡蛋中阿莫西林、阿莫西林酸、二酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林残留的方法，是将鸡蛋样品经过提取、净化后，以乙腈-0. 1%甲酸为流动相，采用高效液相色谱_串联质谱法检测。
2.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于液相色谱条件为色谱柱=AgilentC18, 5 V- m, 150mmX 4. 6mm i. d.;保护柱C18 柱，5 ii m ;流动相乙腈-0. 1% 甲酸，流速I. 0mL ^irT1 ;柱温25°C;进样体积20mL ;质谱条件为离子源电喷雾离子源ESI ;扫描方式正离子扫描；检测方式多反应监测；电喷雾毛细管电压4000V ;干燥气温度300°C ;干燥气流速10L rniiT1 ;雾化器气体压力15psi ;鞘气温度250°C ;鞘气流速7L min—1 ;二级碰撞气:氮气。
3.根据权利要求I和2所述的检测方法，其特征在于所述鸡蛋样品经过提取、净化步骤如下将鸡蛋制成匀衆后，加入青霉素V内标溶液，然后加入乙腈溶液中混匀，离心，将上清液移出，加入I mL乙酸铵溶液，pH6. 7，置漩涡混合器上混匀，再用经超纯水饱和的二氯甲烷萃取，离心，将上层水相转移至玻璃离心管中，最后用氮吹仪吹干；上机前残渣用I. OmL 2%乙腈分两次漩涡振荡溶解，转移至I. 5mL离心管中；12100 Xg离心15min，上清液经0. 22 ii m滤膜过滤，滤液供HPLC-MS/MS测定。
全文摘要
本发明属于兽药残留检测领域，具体涉及一种同时检测鸡蛋中阿莫西林(AMO)、阿莫西林酸(AMA)、二酮哌嗪阿莫西林(DIKETO)和氨苄西林(AMP)残留的方法。该方法是将鸡蛋样品经过提取、净化后，以乙腈-0.1%甲酸为流动相,采用高效液相色谱-串联质谱法检测。本发明能同时检测并确证阿莫西林、阿莫西林酸、二酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林在鸡蛋中的残留，满足欧盟标准。
文档编号G01N30/06GK102706991SQ20121023430
公开日2012年10月3日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者孙瑛瑛, 张小杰, 张跟喜, 戴国俊, 李爱华, 王金玉, 谢恺舟, 谢星, 贾龙飞, 赵敏, 陈学森 申请人:扬州大学