专利名称：游离β人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明属于免疫分析医学领域，具体涉及游离P人绒毛膜促性腺激素(free^ -hCG)化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，可用于定量测定人血清、血浆中的游离@人绒毛膜促性腺激素含量。
背景技术：
人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，由两个非共价键结合的糖蛋白亚单位，亚基和3亚基。亚基由垂体前叶激素共有，而0亚基是HCG所特有的。与FSH、LH和TSH等不会发生交叉反应，虽然与P-LH的结构相近，但其末端的24个氨基酸是P-LH所没有的，￠-亚单位是人绒毛膜促性腺激素所特异的。游离P人绒毛膜促性腺激素(free P _hCG)是非结合状态的 HCG的3亚单位，对早期妊娠诊断有重要意义，对与妊娠相关疾病、滋养细胞肿瘤等疾病的诊断、鉴别和病程观察等有一定价值。在临床上可作为测定正常妊娠和妊娠滋养细胞疾病的重要指标。有研究表明，free 3 _hCG在正常妊娠、异位妊娠、葡萄胎、侵蚀性葡萄、绒癌中依次呈增长趋势，故free ^ _hCG可作为妊娠滋养细胞肿瘤的另一种敏感而特异的指标，可为判断葡萄胎恶变提供依据。目前free P _hCG更多的用于唐氏综合征的筛查，但其单独使用时存在检出率低，假阳性和假阴性率高的缺点，故常使用几种血清标志物联检来增大检出率。最广泛的组合为妊娠中期的血清三联检测，即AFP、free ^ -hCG和y E3，阳性检出率为65% 75%。目前临床上游离3人绒毛膜促性腺激素定量检测常用方法有胶乳集抑制试验和血凝抑制试验、放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、单克隆抗体胶体金试验、化学发光免疫分析(CLSA)法，其中化学发光免疫分析为当今最为敏感的微量免疫测定法，具有灵敏度高、稳定性好，无污染等优点，目前已广泛应用到基础和临床医学的各个领域，成为取代RIA和ELISA的首选技术。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种游离P人绒毛膜促性腺激素(free P_hCG化学发光定量检测试剂盒及其制备方法，解决了灵敏度低，成本高的问题。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是游离P人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，包括free ^ -hCG抗体包被板free & -hCG抗体酶结合物free P_hCG 校准品free P_hCG 质控品；20倍浓缩洗液
发光液A和发光液B其中，所述的free P-hCG抗体包被板为包被含有free P-hCG抗体的96孔或48孔白色微孔板。所述的free ^ _hCG酶结合物使用的酶是辣根过氧化物酶(HRP)，要求纯度RZ彡3. 0，活性> 250U/mL。所述的发光液A包含鲁米诺和对碘酚，发光液B包含过氧化脲。所述的20倍浓缩洗液包括75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl,5mL/L Tween-20，lg/LProclin300。溶液澄清、透明、无不溶性颗粒，pH为7. 4±0. 2。本发明还提供了一种制备上述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤I) free P-hCG抗体包被板的制备将free P-hCG抗体用0. 02M pH7. 4磷酸盐缓冲液稀释至I 10ug/mL,加入到白色 微孔板中，2 8°C包被2(T24小时；弃去孔内液体，用pH7. 4PBS-T缓冲液洗板，然后加入含有0. 5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2 8°C封闭20 24小时；弃去孔内液体，甩干后于3(T37°C烘干16 30小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2 8°C ；free P-hCG抗体购自Fitzgerald公司，在外观上应澄清透明，无沉淀,蛋白纯度应> 90%，效价应不低于IO5倍稀释，灵敏度、特异性和稳定性良好。2)用酶标记free ^ -hCG抗体,得free ^ -hCG抗体酶结合物用高碘酸钠氧化法将free P _hCG抗体和辣根过氧化物酶连结在一起；3)配制不同浓度的free ^ -hCG校准品将free ^ -hCG抗原用含有牛血清的校准品稀释液配制成不同浓度的标准品(浓度分别为0，2，5，15，50，200耶/1^);分装，贴标签，储存于2 8°C ；4)质控品的配制在正常人血清中加入适量的free ^ -hCG纯品，配制低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其浓度的平均值分别为4. 67ng/mL和105. 41ng/mL。5 )配制发光液A液和B液；A液是含有0. 7g/L鲁米诺和0. 165g/L对碘酚的pH8. 6的5mmol/LTris *HC1缓冲液液是浓度为0. 675g/L的过氧化脲，用工艺用水配制。6)配制20倍浓缩洗液；20倍浓缩洗液的配制方法如下75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/LTween_20，lg/L Proclin300o7)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C ;8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，并对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品测定值和稳定性进行测定。其中，所述的包被板为包被含有free P _hCG抗体的96孔或48孔白色微孔板，微孔板应表面光滑，无划痕、破损、飞边、肮脏，加发光液后要求平均本地发光值< 100。所述的发光液A液包含鲁米诺和对碘酚，发光液B液包含过氧化脲。本专利发明的试剂盒的测定原理是夹心法，样本加到包被有发热free ^ -hCG抗体的白色不透明的条板微孔中，再加入free ^ _hCG抗体-辣根过氧化物酶(HRP)结合物，温育一段时间后形成固相抗体-P-hCG-酶标抗体复合物。洗掉游离成分。加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5 15分钟测定各加样本孔的发光值RLU。样本的RLU与样本free P_hCG浓度呈正相关。样本中的free P-hCG浓度依据由校准品free ^-hCG浓度和对应的RLU建立的数学模型进行定量，从而检测人血清、血浆中的free 3 -hCG含量。具有以下优点(I)反应快速，可在65分钟内判断检测结果，操作简便，无污染；
(2)灵敏度高，本试剂盒的分析灵敏度不高于0. 5ng/mL ；(3)特异性强，与人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)未出现交叉反应；
(4)精密度良好，批内精密度不高于15%，批间精密度不高于20% ; (5)稳定性良好，本产品在37 °C可存放7天以上，在2 8 °C可存放I年；(6 )成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有临床应用价值。
图I是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒测定free P _hCG与放免试剂盒测 定free P-hCG的测定结果比较图，其中纵坐标为博奥赛斯测得的free P-hCG值,横坐标为放免试剂盒测定free ^ -hCG值,两种方法相关系数(r) =0. 9428,直线方程y =I.0294x-0. 8303。
具体实施例方式实施例I :制备游离3人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒游离3人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，包括free @-hCG抗体包被的96孔白色微孔板；free P -hCG抗体-辣根过氧化物酶(HRP)结合物；free P_hCG 校准品；free P_hCG 质控品；发光液A液和B液，A液包含鲁米诺和对碘酚，B液包含过氧化脲；20 倍浓缩液，配方为 75.5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/L Tween-20, lg/LProclin300o Proclin300 选自美国 sigma 公司。通过下述方法制备游离P人绒毛膜促性腺激素(free ^ -hCG)化学发光免疫定量检测试剂盒I)包被将free & -hCG抗体用0. 02M pH7. 4磷酸盐缓冲液稀释至I 10ug/mL,力口入到白色微孔板中，2 8°C包被2(T24小时；弃去孔内液体，用pH7. 4PBS-T缓冲液洗板，然后加入含有0. 5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2 8°C封闭20 24小时；弃去孔内液体，甩干后于3(T37°C烘干16 30小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2 8°C ；2)将free & -hCG抗体用高碘酸钠氧化法标记辣根过氧化物酶(HRP)，用含牛血清白蛋白的PBS缓冲液稀释至工作浓度，并加入辣根过氧化物酶(HRP)稳定剂；经检验灵敏度、特异性和稳定性均达到测定要求；分装，贴标签，储存于2l°C。3)配制不同浓度的free ^ -hCG校准品将free ^ -hCG抗原用含有牛血清的校准品稀释液配制成不同浓度的标准品(浓度分别为0，2，5，15，50，200ng/mL);分装，贴标签，储存于2 8°C ；4)质控品的配制在正常人血清中加入适量的free ^ -hCG纯品，配制低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其浓度的平均值分别为4. 67ng/mL和105. 41ng/mL。
5 )配制发光液A液和B液；A液是含有0. 7g/L鲁米诺和0. 165g/L对碘酚的pH8. 6的5mmol/LTris *HC1缓冲液液是浓度为0. 675g/L的过氧化脲，用工艺用水配制。6)配制20倍浓缩洗液；20 倍浓缩洗液的配制方法如下75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl,5mL/L Tween-20,lg/L Proclin300o7)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C;其中包含发光液A、发光液B、20倍浓缩洗液、free ^ -hCG抗体酶结合物各I瓶，free ^ -hCG抗体包被板I块，free ^ -hCG校准品6瓶、free P_hCG质控品2瓶。8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，并对准确度、剂量-反应曲线的线 性、精密度、特异性、灵敏度、质控品测定值和稳定性进行测定。说明( I)物理检查液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。(2)准确性试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析测定，用双对数数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行(t检验，111〈2. 447)；以企业标准品为对照品，用双对数数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在0. 9^1. I范围内。企业校准品是将free ^ -hCG纯品用校准品稀释液配成校准品浓储液，由国家标准品为其定值(free P _hCG纯品国家标准品批号为150535-9903)，浓度分别为0，2，5，15，50，200ng/mL,储存于-20°C。(3)剂量-反应曲线的线性用双对数数学模型拟合，剂量-反应曲线相关系数r应不低于0. 99。(4)分析灵敏度试剂盒分析灵敏度不高于0. 6ng/mL。(5)精密度批内不精密度(CV%)应不高于15% ;批间不精密度(CV%)应不高于20%。(6)质控品测定值平行测定10孔高值和低值的质控品，用Log (X)-Log (Y)数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，QcL和QcH的允许范围分别为3. 9074 5. 45ng61ng/mL 和 88. 444. 33 122. 386. 49ng/mL。(7)特异性交叉反应符合下表要求
— 交叉反应因子浓度测定值
人绒毛膜促性腺激素(hCG) 10,000ng/inL <2ng/mL 促黄体生成素(LH) l,000ng/mL <2ng/mL 促卵泡激素(FSH) l,000ng/mL <2ng/mL 促甲状腺激素(TSH)_l,000WU/mL <2ng/mL(8)稳定性37°C放置7天，测定值应符合上述各项要求。
实施例2 :制备游离3人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒除固相载体为48孔的微孔板外，以与实施例I 一样的方法制备本发明试剂盒。实施例3 :本发明试剂盒的使用方法(I)将待检试剂盒在室温(18 25°C)下平衡30分钟。(2)配制洗液用蒸馏水将浓缩洗液按1:20稀释(ImL洗液加19mL蒸馏水)。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37°C待结晶溶解后再进行稀释。(3)配制发光液使用前5分钟取适量发光液A与发光液B等体积混合。(4)根据实验需要取出适量的包被板条。设置空白对照I孔，校准品各2孔、质控品各10孔。每孔加入free P _hCG校准品、质控品和样本各50 ii L,空白对照不加校准品、质控品和样本。(5)每孔加入free P-hCG酶结合物50 ii L，空白对照孔除外。·(6)手工或机器轻轻振荡10秒混匀，用盖板膜将板孔盖好，在37°C下反应60分钟。(7)揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300UL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。(8)每孔加入发光液IOOii L，包括空白对照孔。(9)室温(18^25°C )下暗置5min，在化学发光免疫分析仪上测定发光值，然后采用双对数数学模型拟合，得到校准品剂量-反应曲线，样本中的free ^ -hCG浓度与RLU之间的关系成正比，可从上述剂量-反应曲线上反推算出样本中free ^ -hCG的浓度值。实施例4本专利发明的试剂盒已进行了临床考核，本次临床试验的样本总数117例，先free 3 _hCG放射性免疫试剂盒测试后，再利用本专利发明的试剂盒进行测定，并对测定结果进行了配对t检验、线性相关性分析及卡方检验。结果表明，直线方程为Y=L 0294X-0. 8303，线性回归系数为I. 0294，相关系数为0. 9428。线性回归系数为I. 0294接近1，可见这两种测定方法的一致性良好，本发明的试剂盒可用于临床检测中。另外，以SPSS 13. 0统计分析软件对相关系数进行t检验(检验水准a = 0. 05), P<0. 001，可见这两种方法测定的free ^ -hCG值密切相关。本次临床试验的灵敏度100%和特异性98. 75%，而假阳性率I. 25%、假阴性率0. 00%，反映出本试剂盒的测量值与实际值(原测值)的符合程度良好。粗一致性反映试剂盒诊断病人与非病人的能力，这里为99. 17%，接近于1，说明试剂盒的诊断能力较强。为了确定本试剂盒的临床参考值，对715份血清、血浆样本采用本试剂盒进行了
检测，结果表明本试剂盒的参考值(参考范围)为
权利要求
1.游离3人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括 free ^ -hCG抗体包被板； free ^ -hCG抗体酶结合物； free & -hCG 校准品； free ^ -hCG 质控品； 20倍浓缩洗液； 发光液A液和B液。
2.根据权利要求I所述的游离3人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的free 3-hCG抗体包被板为包被含有free 3-hCG抗体的96孔或48孔的白色微孔板。
3.根据权利要求I所述的游离3人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的free ^ -hCG酶结合物使用的酶是辣根过氧化物酶。
4.根据权利要求I所述的游离3人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的free P _hCG质控品包括低值质控品和高值质控品(，其中低值质控品的浓度范围是3. 74 5. 61ng/mL,高值质控品的浓度范围是84. 33 126. 49ng/mL。
5.根据权利要求I所述的游离3人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的发光液A包含0. 7g/L鲁米诺和0. 165g/L对碘酚；发光液B包含0. 675g/L过氧化脲。
6.根据权利要求I所述的游离3人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的20倍浓缩洗液包括75. 5g/LTris，120g/L NaCl,5mL/L Tween-20, lg/LProclin300o
7.一种制备所述权利要求I的试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤 1)free ^ -hCG抗体包被板的制备 将free ^ -hCG抗体用0. 02M pH7. 4磷酸盐缓冲液稀释至10ug/mL,加入到白色微孔板中，2 8°C包被2(T24小时；弃去孔内液体，用pH7. 4PBS-T缓冲液洗板，然后加入含有0.5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2 8°C封闭20 24小时；弃去孔内液体，甩干后于3(T37°C烘干16 30小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2 8°C ； 2)用酶标记free3 -hCG抗体,得free 3 -hCG抗体酶结合物 用高碘酸钠氧化法将free & -hCG抗体和辣根过氧化物酶连结在一起； 3)配制不同浓度的free^ -hCG校准品 将free ^ -hCG抗原用含有牛血清的校准品稀释液配制成不同浓度的标准品，浓度分别为0,2,5,15,50,200ng/mL ;分装，贴标签，储存于2 8。。； 4)质控品的配制 在正常人血清中加入适量的free ^ -hCG纯品，配制低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其浓度的平均值分别为4. 67ng/mL和105. 41ng/mL ； 5)配制发光液A液和B液 A液是含有0. 7g/L鲁米诺和0. 165g/L对碘酚的pH8. 6的5mmol/LTriS HCl缓冲液；B液是浓度为0. 675g/L的过氧化脲，用工艺用水配制；.6)配制20倍浓缩洗液 .20 倍浓缩洗液的配方如下75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/LTween_20，lg/LProclin300 ； .7)组装 将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C ; .8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，并对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品测定值和稳定性进行测定。
8.根据权利要求7所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的包被板为包被含有free P-hCG抗体的96孔或48孔白色微孔板。
全文摘要
本发明公开了一种游离β人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括free β-hCG抗体包被板，free β-hCG抗体酶结合物，free β-hCG校准品，free β-hCG质控品、20倍浓缩洗液，发光液A液和B液，本发明试剂盒具有检测灵敏度高，成本低，操作简单快速的优点，有较高的临床应用价值，本发明提供了这种试剂盒的制备方法。
文档编号G01N33/76GK102749461SQ20121021335
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月26日 优先权日2012年6月26日
发明者刘萍, 宋启超, 张影, 范利花 申请人:博奥赛斯(天津)生物科技有限公司