专利名称：一种检测手性氨基酸浓度的方法及其试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明属于分析化学领域，特别涉及一种化学发光法检测手性氨基酸的方法及其试剂盒。
背景技术：
生物体内氨基酸的水平反映了生物体中的许多生命现象，并和许多疾病密切相关。因此，特别是D型氨基酸的检测在临床诊断和临床基础研究中具有重要的意义。然而，由于这类化合物缺乏紫外吸收、荧光活性以及电化学活性，大多分析方法需要对这类化合物进行衍生；更为重要的是对于对映体的分析往往也需要手性衍生试剂或其他手性拆分技术才能实现，如采用手性色谱柱进行分离等。化学发光(CL)法检测具有灵敏度高，方法简单，且不需要任何外加光源等特点，因而近年来受到人们的关注。虽然已有一些发光体系用 于氨基酸的检测(1)过氧化草酸盐发光反应测定氨基酸荧光衍生物。这种方法虽可获得较高的灵敏度，但是仍需要衍生，且操作复杂，条件苛刻。(2)鲁米诺-次溴酸盐发光体系，在碱性条件下，氨基酸会抑制鲁米诺-次溴酸盐发光反应，以发光信号的衰减测定氨基酸的含量这种方法操作简便，但灵敏度受限。(3)鲁米诺-过氧化氢发光体系，氨基酸可与铜离子形成络合物，并催化化学发光活性。然而，这些分析方法并不适合于对映体中的手性氨基酸的含量分析。氨基酸氧化酶因其具有高度的立体专一性而广泛地应用于手性氨基酸的拆分。将氨基酸氧化酶与化学发光法相结合，用于手性氨基酸的分析虽已有文献报道。但是这种分析方法多采用流动注射法，且发光体系为金属离子催化鲁米诺-过氧化氢发光体系。这种分析方法一方面需要特殊的仪器设备，另一方面，因为存在的另一种氨基酸本身会抑制该发光体系，因此也不是适合对映体中手性氨基酸的分析检测。为此，发展一种操作简便、灵敏度高的发光体系，可用于测定对映体中手性氨基酸的含量显得十分必要。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对现有的化学发光法在检测氨基酸时不能实现对映体中手性氨基酸的含量分析，提供一种操作简单、灵敏度高的化学发光法，可用于检测对映体中的手性氨基酸。本发明解决上述技术问题的技术方案如下一种检测手性氨基酸浓度的方法，包括以下步骤I)在待检样品中加入D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶进行酶催化反应；2)在步骤I)所得的反应液中依次加入缓冲液、鲁米诺、辣根过氧化物酶进行化学发光反应；3)测定步骤2)所得的反应液的发光强度。本发明的技术原理在于待测定的手性氨基酸在相应的氨基酸氧化酶的作用下充分转化为过氧化氢，进一步添加辣根过氧化物酶催化过氧化氢氧化鲁米诺发光，且发光信号与测定的氨基酸浓度在一定范围内呈线性相关，因此可以用于手性氨基酸的测定。本发明在测定D-氨基酸时，采用D-氨基酸氧化酶；在测定L-氨基酸时，则采用L-氨基酸氧化酶。本发明中，步骤I)为在待检样品中加入D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶进行酶催化反应。优选的，步骤I)所述的酶催化反应的反应体系中，还包括常规的缓冲溶液，优选磷酸缓冲液(PBS)。反应体系的pH值优选7. 5、. 5，更优选pH 8.3。缓冲液的总浓度优选I. OX 10_21. OmoI/Lο D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶的浓度较佳的为 2.6^4. 4U/ml。酶催化反应的反应温度为2(Γ45° C，反应时间大于I分钟，优选f 15分钟。其中，加入D-氨基酸氧化酶，测定D-氨基酸，最佳为D_氨基酸氧化酶2.61.4U/ml，缓冲液为IOmM的磷酸缓冲液，pH为8. 3，酶反应温度为25° C，反应时间为10分钟。检测范围优选原始样品的浓度为I. OX 10_5 2. OX 10_3mol/L。其中，加入L-氨基酸氧化酶，测定L-氨基酸，最佳为L_氨基酸氧化酶2. 6 4. 4U/ml，缓冲液为IOOmM的磷酸缓冲液，pH为8. 8，酶反应温度为37° C，反应时间为10分钟。检测范围优选原始样品的浓度2. OX 10+1. OX 10_2mol/L。本发明中，步骤2)为在步骤I)所得的反应液中依次加入缓冲液、鲁米诺、辣根过氧化物酶进行化学发光反应。所述的缓冲液用于调整体系的PH在一定的范围内，优选的，使反应体系的PH值大于9. O。所述的缓冲液是常规，优选磷酸缓冲液。加入的缓冲液的总浓度优选O. 0Γ1. OmoI/L0鲁米诺的终浓度优选I. OX 10_5 I. OX 10_3mOl/L ;辣根过氧化物酶优选O. 1 5. OU/ml。优选的，发光反应的反应温度为1(Γ45° C，反应时间为1 10分钟。最佳为鲁米诺I. OX 10_4mOl/L，辣根过氧化物酶O. 36 0. 6U/ml ;缓冲液为O. lmol/L的磷酸缓冲液，PH为10 ;发光反应的温度为25° C，反应时间为f 10分钟。本发明中，步骤3)为测定步骤2)所得的反应液的发光强度。所述的测定发光强度的方法是本领域的常规方法，一般在化学发光仪上进行测定。本发明中，优选的，待检样品在进行步骤I)前还进行前处理，即采用阳离子交换固相萃取法除去样品中的如Cu2+、Co2+、Fe3+等金属离子。具体方法较佳的包括将样品的pH调节为5. 0，采用常规的方法将SCX SPE小柱活化，将待检样品通过SCX SPE小柱，用4%氨水溶液洗脱，收集洗脱液，即可用于后续的分析实验。对于鲁米诺-过氧化氢发光体系而言，常见的金属离子如Cu2+、Co2+、Fe3+等对该体系均有催化，因而对测定存在干扰。为此，在测定样品时通常需要对样品进行净化处理。为消除常见金属离子的干扰，可采用阳离子交换固相萃取法分离金属离子等对酶促反应以及鲁米诺发光造成影响的杂质。本发明还提供第二个技术方案一种化学发光法检测手性氨基酸浓度的试剂盒，包括以下试剂DD-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶；2)鲁米诺溶液；3)辣根过氧化物酶；和4)缓冲液。本发明中，试剂2)所述的鲁米诺溶液较佳的是浓度在1.0X l(T3mol/L的鲁米诺水溶液。本发明中，试剂4)所述的缓冲液是本领域常规的缓冲溶液，优选10-100mM，pH 8-10的磷酸缓冲液。较佳的包括10mM，pH 8. 3的磷酸缓冲液，IOOmM, pH 8. O的磷酸缓冲液和IOOmM, pH 10的磷酸缓冲液。缓冲液可用于配制D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶和辣根过氧化物酶的溶液，以及作为化学发光反应体系的缓冲液。本发明中，所述的试剂盒较佳的还包括阳离子交换固相萃取柱，优选SCX SPE小柱。以及还可以进一步包括该萃取柱的活化试剂、洗涤试剂、洗脱试剂等，如甲醇、双蒸水和磷酸缓冲溶液(O. 01M, pH 5. O)、氨水溶液等。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明中，当手性氨基酸在氨基酸氧化酶的作用下充分转化为过氧化氢时，在辣根过氧化物酶的作用下可使鲁米诺发光，且发光信号与测定的氨基酸呈线性相关。其他常 是却无法用于对于对映体中的手性氨基酸的含量分析。这是因为，比如当选择D-型的氨基酸氧化酶转化D-型氨基酸为过氧化氢时，在采用金属离子催化鲁米诺发光进行检测时，存在的L-型的氨基酸会抑制金属离子催化鲁米诺的发光。总的说来是这一发光体系不能在L-型氨基酸存在时测定D-型氨基酸。而且由于辣根过氧化物酶具有更低的发光背景和更高的催化效果，因而检测灵敏度较高。为此，本发明以辣根过氧化物酶催化鲁米诺-过氧化氢发光，构建检测对映体中的手性氨基酸的方法。本发明首次将辣根过氧化物酶-鲁米诺-过氧化氢作为发光体系用于检测对映体中的手性氨基酸。本发明还在于化学发光体系的混合方式、组成配比及适合该检测体系的样品处理方法。采用本发明所提供的检测方法，可以用于生物样品中氨基酸的检测。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图I是实施例3中L-氨基酸对D-氨基酸的干扰实验中的化学发光柱形图(辣根过氧化物酶-鲁米诺-过氧化氢发光体系)。样品广4分别为I,PBS (空白对照);2，2.0父10_3!1101/1的0-丙氨酸(D-Ala) ;3，D_ 丙氨酸(D-Ala)和L-丙氨酸(L-Ala)混合物，浓度分别为2. OX 10_3mol/L ;4，2. O X lO—W/L的L-丙氨酸(L-Ala)。图2是实施例3中在含铜离子的D-型氨基酸溶液SCX小柱处理后的化学发光柱形图(辣根过氧化物酶-鲁米诺-过氧化氢发光体系)。样品广3分别为l，1.0X10_2mol/L的铜离子(Cu2+)，进行SCX小柱处理；2，I. OX 10_3mol/L的D-丙氨酸(D-Ala)，不进行样品处理；3，I. OX 10_3mol/L 的 D-丙氨酸(D-Ala)，进行 SCX 小柱处理；4，I. O X 10_3mol/L 的D-丙氨酸，其中含有I. OX 10_2mol/L的铜离子(Cu2+)，进行SCX小柱处理。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。实施例I
样品前处理I、溶液配制①PBS缓冲液称取一定量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，配制总浓度为IOmM的磷酸缓冲液，调整溶液的PH为5. O。②氨基酸溶液称取D-丙氨酸，用IOmM PBS (pH 5. O)溶解，配制成浓度为I. 0X10_3mol/L 的溶液。③铜离子溶液称取一定量的硫酸铜，用IOmM PBS (pH 5. O)溶解，配制成
1.OX 10_2mOl/L的铜离子溶液。④含铜离子的氨基酸溶液在②所配制的氨基酸混合溶液中添加硫酸铜固体，使 其终浓度为I. OX 10_2mol/L。2、阳离子交换固相萃取法净化样品(I)活化 SCX SPE 小柱(型号为 CNWBOND SCX, 500mg, 3ml, CNW 公司)。分别用3ml的甲醇、双蒸水和磷酸缓冲溶液(O. 01M, pH 5. O)各洗涤SPE小柱三次。(2)上样取上述配制的含铜离子的溶液(即溶液③、④)3ml上活化好的SPE小柱，并用3ml磷酸缓冲溶液(O. 01M，pH 5. O)洗涤三次。最后用3ml 4%氨水洗脱，收集并合并洗脱液，调节该溶液的PH值。如果测定D-氨基酸则调节pH值为8. 3，反之测定L-氨基酸时为8. 8。实施例2D-型氨基酸氧化酶转化D-丙氨酸(D-Ala)为过氧化氢I.溶液配制①D-氨基酸氧化酶溶液称取一定量的D-氨基酸氧化酶，用IOmM PBS (pH 8. 3)溶解，浓度为43U/ml。②D-丙氨酸溶液称取D-丙氨酸，用IOmM PBS (pH 8. 3)溶解，配制成浓度为5· 0Χ10_6、1· 0Χ10_5、5· 0Χ10_5、1· 0Χ10_4、5· 0Χ10_4、1· 0Χ10_3、2· 0X10_3mol/L 的一系列溶液。③L-丙氨酸溶液称取L-丙氨酸，用IOmM PBS (pH 8. 3)溶解，配制成浓度为
2.0X10_3mol/L 的溶液。④D-丙氨酸和L-丙氨酸混合溶液称取D-丙氨酸和L-丙氨酸，用IOmMPBS (pH
8.3)溶解，配制成终浓度分别为2. OX 10_3mol/L的混合溶液。2、D-氨基酸转化酶反应取3μ I上述D-氨基酸氧化酶溶液(即溶液①)，5 μ I上述氨基酸溶液(即溶液②-④)或实施例I净化后的溶液和42 μ I IOmM PBS充分混匀后配制为50 μ I的反应体系，反应液的pH值为8. 3。25° C水浴反应10分钟后，立刻加入发光反应缓冲液。实施例3化学发光检测D-丙氨酸I、溶液配制(I)辣根过氧化物酶溶液称取一定量的辣根过氧化物酶，用IOOmMPBS (pH 8.0)溶解，浓度为60U/ml。(2)发光反应缓冲液配制O. lmol/L的磷酸缓冲溶液，调整溶液的pH值至10。
(3)鲁米诺溶液称取一定量的鲁米诺，用水溶解并配制成浓度为I. OX 10_3mol/L的鲁米诺溶液。鲁米诺的浓度不宜太高，否则不易溶解，需要加入更多的碱，不利于反应体系的pH的控制。2、辣根过氧化物酶催化鲁米诺发光反应 取D-型氨基酸氧化酶转化D-丙氨酸的反应液50 μ I，依次加入上述发光反应缓冲液397 μ 1，鲁米诺溶液50 μ 1，辣根过氧化物酶溶液3 μ I。充分混匀后室温下反应3分钟，取150 μ I加入96孔酶标板测定其发光强度，每组值测定三次。3、检测条件本实验采用Bioteck的多功能酶标仪(Synergy HI),选择化学发光模式,检测参数 Gain 值为 100, Read Height I. 00mm。
采用一系列不同浓度梯度的D-丙氨酸溶液进行检测，发现浓度在
I.OX 10_5 2. OX Krtiol/L成线性关系，工作曲线为1=2. OX 1(^0^^+83. 62，线性相关系数R为O. 998。以3Sb/S计算检测限，D-丙氨酸(D-ALA)的检测限分别3. 5X 10_6mol/L。此外，对样品D-丙氨酸中含有相同浓度的L-丙氨酸进行了发光强度的测定，结果如图I所示，L-丙氨酸不会对检测带来干扰。同时，对添加高于D-氨基酸10倍浓度的金属铜离子，在进行SCX小柱处理后，对检测没有干扰(如图2所示)。实施例4检测L-丙氨酸同实施例I进行样品前处理，除了在配制溶液②中将D-丙氨酸替换为L-丙氨酸以外。同实施例2进行L-氨基酸氧化酶转化L-丙氨酸(L-Ala)为过氧化氢，除了溶液
(I)中D-氨基酸氧化酶替换为L-氨基酸氧化酶，溶液(2)中的D-丙氨酸替换为L-丙氨酸。反应条件不同之处在于缓冲液为IOOmM的磷酸缓冲液，pH为8. 8，酶反应温度为37° C。化学发光检测同实施例3。结果，采用一系列不同浓度梯度的L-丙氨酸溶液进行检测，发现浓度在2.0X10-4 I. OX 10_2mOl/L成线性关系，工作曲线为1=5. 27 X 104Cl_m+20. 95，线性相关系数R为O. 999。以3Sb/S计算检测限，L-丙氨酸(L-ALA)的检测限为5. 7X 10_5mol/L。此外，对样品L-丙氨酸中含有相同浓度的D-丙氨酸进行了发光强度的测定，D-丙氨酸不会对检测带来干扰。同时，对添加高于L-氨基酸10倍浓度的金属铜离子，在进行SCX小柱处理后，对检测没有干扰。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种检测手性氨基酸浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)在待检样品中加入D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶进行酶催化反应； 2)在步骤I)所得的反应液中依次加入缓冲液、鲁米诺、辣根过氧化物酶进行化学发光反应; 3)测定步骤2)所得的反应液的发光强度。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤I)所述的酶催化反应的反应体系中，还包括常规的缓冲溶液，所述的反应体系的pH值为7. 5^9. 5, D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶的浓度大于O. 01U/ml,酶催化反应的反应温度为2(Γ45° C，反应时间f 15分钟；步骤2)所述的化学发光反应的反应体系pH值大于9. 0，鲁米诺的终浓度为1.0\10-5 1.0\10_311101/1，辣根过氧化物酶为O. Γ5. OU/ml，发光反应的反应温度为10 45° C，反应时间为I 10分钟。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤I)所述的酶催化反应中，所述的氨基酸氧化酶是D-氨基酸氧化酶，所述的缓冲液为10mM，pH8. 3的磷酸缓冲液，所述的反应温度为25° C，反应时间为10分钟。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤I)所述的酶催化反应中，所述的氨基酸氧化酶是L-氨基酸氧化酶，所述的缓冲液为lOOmM，pH8. 8的磷酸缓冲液，所述的反应温度为37° C，反应时间为10分钟。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤2)所述的化学发光反应中，所述的缓冲液为O. lmol/L, pHIO的磷酸缓冲液，所述的反应体系中，鲁米诺浓度为I. OX 10_4mol/L，辣根过氧化物酶浓度为O. 22、. 36U/ml，所述的发光反应的温度为25° C，反应时间为f 10分钟。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的待检样品在进行步骤I)前还采用阳离子交换固相萃取法除去样品中的金属离子。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的阳离子交换固相萃取法包括将待检样品的pH调节为5. 0，采用常规的方法将SCX SPE小柱活化后，将样品通过SCX SPE小柱，用4%氨水溶液洗脱,收集洗脱液,即可。
8.一种化学发光法检测手性氨基酸浓度的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂 1)D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶； 2)鲁米诺溶液； 3)辣根过氧化物酶；和 4)缓冲液。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，试剂2)所述的鲁米诺溶液是I.OX 10_3mol/L的鲁米诺水溶液；试剂4)所述的缓冲液是lO-lOOmM，pH 8-10的磷酸缓冲液。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括阳离子交换固相萃取柱。
全文摘要
本发明公开了一种检测手性氨基酸浓度的方法及其试剂盒，所述方法包括以下步骤1)在待检样品中加入D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸氧化酶进行酶催化反应；2)在步骤1)所得的反应液中依次加入缓冲液、鲁米诺、辣根过氧化物酶进行化学发光反应；3)测定步骤2)所得的反应液的发光强度。本发明可以用于对映体中其中的一种手性氨基酸的测定。本方法不受对映体中另一种手性氨基酸的干扰，也不受常见金属离子的干扰。本方法操作十分简单、且灵敏度高，可以检测对映体中手性氨基酸的含量。
文档编号G01N21/76GK102692409SQ20121021137
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月25日 优先权日2012年6月25日
发明者倪志尧, 夏琨, 曹旭妮 申请人:华东理工大学