专利名称：一种检测肾上腺激素含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种有效的新型分散液液微萃取高效液相色谱法检测生物样品中肾上腺素含量的方法，属于分析化学中痕量生物大分子的分离富集和分析測定技术领域。
背景技术：
肾上腺素分为糖皮质激素和盐皮质激素，糖皮质激素常见的有氢化可的松，地塞米松，倍他米松，曲安奈德，倍氯米松，苯丙酸诺龙等。现在中国，日本，欧盟都对糖皮质激素规定了最大残留量，而且我国还将部分糖皮质激素规定为违禁药物。近年来由于新的萃取净化处理技术，更加灵敏的检测技术获得了更多的样品处理简单，回收率更高的分离萃取技木，以及检测限更低，准确性和灵敏度更高的检测方法。
分散液液微萃取(DLLME)于2006年首次提出，是ー种基于合适萃取剂的简单快捷的样品前处理技木。只有极微量的有机溶剂和分散剂在萃取剂和水相中，萃取剂和分散剂快速进入到待被分析物的水相中，形成乳浊液。在乳浊液中被诱导形成微小的一滴，通过离心，微小的一滴被富集到试管底部。然后与分析仪器联用。该技术易操作，成本低，环境友好，需用样品少，已经成为非常有潜力的样品前处理技术之一。现有的检测肾上腺素的方法主要有高效液相色谱法、生物检测法，其中样品前处理是制约检测灵敏度、选择性提高的瓶颈，目前肾上腺素检测使用的样品前处理技术主要有液液萃取、固相萃取、固相微萃取等。本发明采用的分散液液微萃取在已有技术的基础上，一是采取表面活性剂做分散剂，提高分散效果及萃取率，缩短萃取时间；ニ是将肾上腺素与水扬醛发生衍生反应，改变肾上腺素性质，提高萃取效果，同时由于衍生物共扼体系增大，增强检测信号強度，提高检测灵敏度。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测生物样品中肾上腺激素含量的新方法，该方法对基体复杂的生物样品先采用水杨醛与肾上腺激素发生衍生反应，再用分散液液微萃取对衍生产物进行富集，结合高效液相色谱同时測定多种痕量肾上腺素，具有操作简单，富集倍数高，结果准确等特点。本发明分散液液微萃取高效液相色谱法检测生物样品中肾上腺素含量的方法，包括以下步骤
(I)工作曲线的制作配制一系列不同浓度的肾上腺素混合标准溶液，在一定色谱条件下，注入高效液相色谱进行分析，制作工作曲线，得到肾上腺素的检测限和线性回归方程；一般采用的配制浓度为 I. 00,10. 00,50. 00,100. 00,150. 00,200. 00,250. 00,300. 00 ng/mL。(2)样品处理在待测生物样品中加入I 2mlこ腈、O. I O. 5g氯化钠、O. I
O.5g氯化锌、O. I O. 5g醋酸钠、O. I O. 5g硫酸镁试剂中ー种，混匀，在转速5000 12000r/min下离心10 20min,取出上清液,用pH 5. 5 8. O的磷酸ニ氢钾-磷酸氢ニ钾缓冲溶液稀释至5ml，备用；
(3)分散液液微萃取将100-300μ L萃取剂，O. 5-1. OmL 5%(w/v)衍生试剂水杨醛和0.5 -I. OmL O. 05% 0.1% (v/v)分散剂混匀，立即加入备用样品5mL上清稀释液中，超声，形成乳池体系；然后在3000 8000 r/min下离心2 10 min,离心后离心管底形成一滴有机相；
(4)样品測定吸取步骤(3)中离心管底部的有机相过滤，在与步骤(I)相同色谱条件进行HPLC分析，并对照步骤(I)所得的线性回归方程，计算出样品中的肾上腺素含量。本发明中肾上腺素为地塞米松、曲安奈德、丙酸倍率米松、丁酸氢化可的松、苯丙酸诺龙、泼尼松、醋酸可的松、甲基泼尼松龙中ー种或几种。 色谱流动相为色谱条件为以こ腈-O. 1%甲酸溶液作为流动相，梯度洗脱为质量百分比浓度80%こ腈洗脱第O 3 min，质量百分比浓度80% 90%こ腈洗脱第3 6. 5min,质量百分比浓度90%こ腈洗脱第6. 5 8 min。本发明中生物样品为全血或尿液，检测前在-20°C下保存备用，血液处理量为
O.5 I. Oml,尿液的处理量为5. 0ml。本发明中萃取剂为ニ氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳中ー种。本发明中分散剂为甲醇、こ腈、丙酮、非离子表面活性剂聚こニ醇辛基苯基醚Triton X系列、非离子表面活性剂醇聚氧こ烯醚中ー种。本发明中非离子表面活性剂聚こニ醇辛基苯基醚Triton X系列试剂为TritonX-100 或 Triton X-114。本发明中非离子表面活性剂醇聚氧こ烯醚为Tergitol TMN-6。本发明方法的最低定量限为O. 010ng/mL。相对于现有技术，本发明具有以下显著优点
1、本方法能够对生物样品进行净化，减少了其他物质的干扰；
2、本发明提供了一种新的分散液液微萃取显色体系，实验证明本发明方法能有效地富集肾上腺素(地塞米松，曲安奈德，丙酸倍率米松，丁酸氢化可的松，苯丙酸诺龙，醋酸可的松，甲基泼尼松龙)，并且该方法安全，简便，快捷和高效，有机溶剂用量少，富集倍数高，检测时间短，能有效地与干扰物质分离，集采样、萃取、浓缩为一体，是ー种简便、快速、准确的分析方法，具有广泛的应用前景。3、本发明经分散液液微萃取显色体系衍生富集后，所得富集因子较大，均在60倍以上。4、本发明选用水杨醛溶液作为衍生试剂，且与高效液相色谱法结合后能大大提高该仪器的測定灵敏度，生物样品中肾上腺素浓度> 0. 010ng/mL均能检出。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进ー步地说明，但本发明的保护范围并不限于此。实施例I :本检测肾上腺激素含量的方法，检测人体血液中肾上腺激素(地塞米松，曲安奈德，丙酸倍率米松，丁酸氢化可的松，苯丙酸诺龙，醋酸可的松，甲基泼尼松龙)的含量，具体操作如下I)工作曲线制作取lKg/mL的不同肾上腺素标准母液按比例配制成I. 00、10. 00、
50.00、100. 00、150. 00,200. 00,250. 00,300. 00 ng/mL 等不同浓度的地塞米松，曲安奈德，
丙酸倍率米松，丁酸氢化可的松，苯丙酸诺龙，醋酸可的松，甲基泼尼松龙混合标样，进行色谱分析，制作工作曲线，得到的线性回归方程、线性范围、相关系数等见表I ;
色谱条件为以こ腈-O. lwt%甲酸溶液作为流动相，梯度洗脱为质量百分比浓度80%こ腈洗脱O 3 min,质量百分比浓度80% 90%的こ腈洗脱3 6. 5 min,质量百分比浓度90%こ腈洗脱6. 5 8 min。2)预先将 100 μ L 四氯化碳，O. 5mL 5% (w/v)的水杨醛和 O. 5 mL O. 05% (v/v)分散剂Triton X-100混匀；
3)取O.5ml全血,加入Imlこ腈,润流混勻30 s,在转速10000r/min条件下离心分离12min，取出上清液，用pH 5. 5磷酸ニ氢钾-磷酸氢ニ钾缓冲溶液稀释至5ml，备用；
4)用注射器吸取步骤2)的混合液，迅速注入步骤3)的离心管中，用吸管迅速导入空气混勻，在50 kHz下超声5min,形成乳池体系；
5)将步骤(4)的离心管在3000r/min离心IOmin ；
6)用微量液相进样器吸取离心管底部的有机相过滤膜过滤，然后进行HPLC分析，色谱条件同步骤I);
7)将步骤(6)所得到的色谱峰面积代入表I工作曲线，测出血液中丙酸倍氯米松36ng/mL, 丁酸氢化可的松40ng/mL,苯丙酸诺龙28ng/mL,地塞米松46ng/mL,曲安奈德34ng/mL,醋酸可的松13ng/mL,甲基泼尼松龙25ng/mL。表I :不同肾上腺激素的线性回归方程及相关结果
权利要求
1.ー种检测肾上腺激素含量的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)工作曲线的制作配制I 300ng/ml肾上腺素混合标准溶液，注入高效液相色谱进行分析，制作工作曲线，得到肾上腺素的检测限和线性回归方程； (2)样品处理在待测生物样品中加入I 2mlこ腈、O.I O. 5g氯化钠、O. I O. 5g氯化锌、O. I O. 5g醋酸钠、O. I O. 5g硫酸镁试剂中ー种，混匀，在转速5000 12000r/min下离心10 20min，取出上清液，用pH 5. 5 8. O的磷酸ニ氢钾-磷酸氢ニ钾缓冲溶液稀释至5ml,备用； (3)分散液液微萃取将100 300μ I萃取剂，O. 5 I. Oml 5%的衍生剂水杨醛和O. 5 I. O ml体积百分比浓度为O. 05 O. 1%的分散剂混匀，立即加入备用样品中，超声，形成乳池体系，然后在3000 8000 r/min下离心2 10 min ； (4)样品測定吸取步骤(3)中离心管底部的有机相，过滤，在与步骤(I)相同色谱条件进行HPLC分析，并对照步骤(I)所得的线性回归方程，计算出样品中肾上腺素的含量。
2.根据权利要求I所述检测肾上腺激素含量的方法，其特征在于肾上腺素为地塞米松、曲安奈德、丙酸倍率米松、丁酸氢化可的松、苯丙酸诺龙、泼尼松、醋酸可的松、甲基泼尼松龙中ー种或几种。
3.根据权利要求I所述的检测肾上腺激素含量的方法，其特征在于色谱条件为以こ腈-O. lwt%甲酸溶液作为流动相，梯度洗脱为质量百分比浓度80%こ腈洗脱O 3 min，质量百分比浓度80% 90%こ腈洗脱3 6. 5 min，质量百分比浓度90%こ腈洗脱6. 5 8min。
4.根据权利要求I所述的检测肾上腺激素含量的方法，其特征在于生物样品为全血或尿液，检测前在_20°C下保存备用，血液处理量为O. 5 I. 0ml，尿液的处理量为5. Oml0
5.根据权利要求I所述的检测肾上腺激素含量的方法，其特征在于萃取剂为ニ氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳中ー种。
6.根据权利要求I所述的检测肾上腺激素含量的方法，其特征在于分散剂为甲醇、こ腈、丙酮、非离子表面活性剂聚こニ醇辛基苯基醚Triton X系列、非离子表面活性剂醇聚氧こ烯醚中ー种。
7.根据权利要求6所述的检测肾上腺激素含量的方法，其特征在于非离子表面活性剂聚こニ醇辛基苯基醚Triton X系列试剂为Triton X-100或Triton X-114。
8.根据权利要求6所述的检测肾上腺激素含量的方法，其特征在于非离子表面活性剂醇聚氧こ烯醚为Tergitol TMN-6。
全文摘要
本发明公开了一种检测肾上腺激素含量的方法，该方法先采用水杨醛与肾上腺激素发生衍生反应，再用分散液液微萃取对衍生产物进行富集，结合高效液相色谱同时测定多种肾上腺素，方法用于生物样品中肾上腺激素含量的测定，且效果较好，方法检测限为0.010ng/mL。本发明的方法操作简单，有机溶剂用量少，富集倍数高，检测时间短，能有效地与干扰物质分离，是一种简便、快速、准确的分析方法，具有广泛的应用前景。
文档编号G01N30/36GK102680617SQ20121010701
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者杨亚玲, 秦慧 申请人:昆明理工大学